Summary
Biz ovalbumin bağlı alerjik hava yolu inflamasyonu ayarı ovalbumin yanıt olarak pulmoner dendritik hücrelerin olgunlaşma ve göç izlemek için bir strateji tanımlamak. Bu strateji, enfeksiyon ayarlarında pulmoner dendritik hücreler göç değerlendirmek için modifiye edilebilir.
Abstract
Dendritik hücreler (DC) antijen-spesifik T hücreleri aktive ederek adaptif immün yanıtın başlatılması dahil anahtar oyuncular vardır. DC'ler kararlı periferik dokularda bulunur, ancak antijen uyarılara yanıt olarak, DC'lerin antijen kadar sürebilir ve hızla 1,2 antijene karşı T hücre yanıtı başlatır lenf düğümlerine göç ederler. Buna ek olarak, dendritik da otoimmün yanı sıra alerjik bağışıklık yanıtı 3 başlatıcı önemli bir rol oynamaktadır.
DC'ler akciğer çevre 4 ortamda hoşgörü immün yanıt ve indüksiyon hem başlamasında önemli bir rol oynamaktadır. Akciğer çevre antijenleri 5 geniş bir dizi maruz kalma nedeniyle, büyük ölçüde tolerogenic olduğunu. Bununla birlikte, bazı kişiler alerji ve astım indüksiyon yol açar toleransı bir ara vardır. Bu çalışmada, hava yolu DC olgunlaşması ve mig izlemek için kullanılabilecek bir strateji tanımlamaksensitizasyon için kullanılan antijene karşı tepki olarak oranı. Havayolu DC olgunlaşma ve göç ölçümü hava yolu allerjik inflamasyon sırasında bağışıklık yanıtının kinetiği değerlendirmesi için olanak sağlar ve ayrıca altta yatan mekanizmalarıyla birlikte izleyen bağışıklık yanıtının büyüklüğünü anlamakta yardımcı olur.
Bizim strateji duyarlaştırıcı ajan olarak ovalbumin kullanımına dayanmaktadır. Ovalbumin bağlı allerjik astım solunum yolu eozinofili, akciğer iltihabı ve astım 6,7 sırasında bulunan yüksek IgE düzeyleri yeniden üretmek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Sensitizasyon sonra, farelerin alımı ovalbumin havayolu DC'lerin özel etiketleme sağlar FITC etiketli ovalbumin intranazal teslimat, karşı karşıya gelmekte. Sonraki birkaç DC özel işaretlerini kullanarak, bu DC'ler olgunlaşmasını değerlendirmek ve aynı zamanda akış sitometri kullanılarak lenf düğümlerine göç değerlendirebilir.
Protocol
1. Ovalbumin fareler duyarlılaştırılması
- OVA (evre V; Sigma, MO) solüsyonu hazırlamak 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda steril PBS içinde (solüsyonu -80 ° C'de saklanabilir.)
- OVA'ya Alum karışım hazırlamak için, bir tüp içinde Alum almak ve 1:1 oranında, tüp vorteks sırasında bir çözeltisine damla damla tarzda OVA solüsyonu ilave edin. 30 dakika boyunca karışımı ilave edip karıştırdıktan sonra hemen kullanın.
- Bir 1 ml şırınga kullanılarak, fare periton içine karışımı 0.2 ml enjekte ve 2 hafta sonra tekrar enjekte tekrarlanır.
2. FITC Etiketli ovalbumin fareler intranazal Mücadelesi
- OVA-Şap, ikinci enjeksiyon sonrası 7 gün, fareler OVA-FITC intranazal meydan hazırız.
- -80 Az 1 mg / ml ve alikotları depolayan bir konsantrasyonda steril PBS kullanılarak OVA-FITC (Sigma) solüsyonu ° C'de hazırlamak
- Bir 50 ml Falcon borusunun alt kısmında ve kimyasal bir saat içinde, bir steril gazlı yerleştirmekOOD, gazlı bez üzerine Aerrane 5 ml ekleyin. Farelerde uyuşturmak için, yaklaşık 5-10 saniye tüp içine hayvan yönlendirir.
- Dik konumda ve steril pipet uçları, bir drop-bilge moda farelerin burun üzerine OVA-FITC solüsyonu 100 ul kullanarak anestezi hayvan tutun.
- Sonraki iki gün OVA-FITC intranazal meydan tekrarlayın.
3. Tek hücreli akciğer gelen Süspansiyon ve boşaltılması Lenf düğümleri hazırlanması
- Euthanyl intraperitoneal kullanarak fareler kurban.
- DC analizi karmaşıklaştırabilir makrofaj kirlenme, azaltmak amacıyla, akciğer lavaj gerçekleştirilir. Akciğerler lavaj için, fare tracheas kısaca bir kateter ve şırınga ile maruz kalan ve deliklidir; 5 mM EDTA ile buz PBS kullanarak, alt solunum yolu alveoler boşluklar hücreleri kaldırmak için 3 defa durulanır.
- 10 U / ml hepar içeren PBS ile 10 ml akciğerler perfüzekalp sağ ventrikül vasıtasıyla in, akciğer vasküler kan hücreleri çıkarmak için kullanılır. Akciğerlere kan hücrelerinin çoğu çıkarılması göstergesi, beyaza kadar perfüzyonsintigrafisiyle gerçekleştirin. Bu periferik kandan kirlenmesine hücreleri çıkarmak için özellikle önemlidir.
- Ciğerlerini inceleyin ve mediastinal lenf nodu (MLN) çıkarın ve ayrı bir kapta, lenf düğümleri yerleştirin. (FITC floresans söndürme engellemek için ışığa dokuların maruziyeti en aza indirmek için deneyin.)
- Bir Petri tabağına yerleştirin akciğerler ve makas kullanılarak kıyma. Sonraki 37 azından 25 dakika süreyle akciğerler sindirimi ° kollajenaz aktivitesi durdurmak için bir sonraki 5 dakika boyunca 250 U / ml Kollajenaz D (Roche) ve eklentinin EDTA (10 mM nihai konsantrasyon) ile C.
- 100 mikron hücre süzgecinden sindirmek akciğerlerin parçaları Pass ve eritrositler kaldırmak için hipotonik parçalanma. Tek bir hücre süspansiyonu dendritik daha fazla analiz için hazırdır.
- MLN, t tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak içinbir hücre süzgecinden süzme ardından yukarıda tarif edildiği gibi kollajenaz ince iğneler ve sindirim kullanılarak MLN kolaylığı.
4. DC için boyama Olgunlaşma / göçün değerlendirilmesi için Belirteçleri
- Akciğerlerde DC'ler belirlemek için, boyama CD11c ve CD11b için yapılır. Ayrıca olgunlaşması için değerlendirmek üzere, boyama DC'ler olgunlaşma tabi olarak regüle edilir CD86 ve CD80 için yapılır. MLN içinde CD11c + CD11b + OVA-FITC + hücreleri akciğerlerden OVA havayolu meydan yanıt MLN göç akciğer DC'leri olarak tanımlanır.
- 10 x 10 6 hücre / ml FACS tampon içinde (% 1 FBS ve 1 mM EDTA ile PBS) ve FACS boyanması için hücre süspansiyonu / tüp alikotu 150 ul'lik bir konsantrasyonda hücreleri askıya. Akciğer DC'ler belirlenmesi için, takip lekeleri ihtiyaç vardır: boyanmamış kontrol (OVA-FITC maruz kalmayan farelerin Akciğer hücreleri), OVA-FITC kontrolü, CD11c tek kontrol CD11b tek kontrol CD11b+ CD11c + çift kumanda, CD11b + OVA-FITC + çift kumanda, CD11c + OVA-FITC + çift kumanda, MHC II OVA-FITC + CD11c + CD11b + MHCII için boyanan tek bir kontrol, CD86 tek kontrol, CD80 tek kontrol ve örnek + , OVA-FITC + CD11c + CD11b + CD86 + ve OVA-FITC + CD11c + CD11b + CD80 +.
- DC göç değerlendirmek MLN gelen tek hücre süspansiyonu mutlak hücre sayımı gerçekleştirmek ve daha sonra aşağıdaki tüpler hazırlamak için: CD11c boyanmamış kontrol (OVA-FITC maruz kalmayan farelerin MLN hücreleri), OVA-FITC kontrolü, + tek kontrolü, CD11b + çift kumanda, CD11b + OVA-FITC + çift kumanda, CD11c + OVA-FITC + çift kontrol ve CD11c + CD11b + OVA-FITC + örnekleri.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Havayolu alerjik enflamasyon indüklemek için intraperitoneal sensitizasyon için gereken zaman noktalarında önemlidir ve Şekil 1 de tasvir edildiği gibi yapılmalıdır. Hava yolu alerjik enflamasyon indüksiyonu teyit etmek için, intraperitoneal hassasiyetine ve hava yolu OVA meydan takiben, bazı fareler feda edilebilir ve Şekil 2 'de gösterildiği gibi histolojik analiz akciğer bölümler üzerinde gerçekleştirilebilir. Inflamatuar hücre varlığı Hematoksilen & Eosin boyama tarafından teyit edilebilir (Şekil 2A) ve mukus üretiminin varlığı Periyodik asit-Schiff boyası (Şekil 2B) tarafından değerlendirilebilir. Toplamda bu OVA-Duyarlı farelerin 8 OVA karşılaştırmadan sonra hava yolu allerjik inflamasyonun indüksiyonu onaylayacaktır. Bunun aksine, Tuzlu muamele farelerin akciğer bölümler herhangi bir mukus üretimi yokluğu ile birlikte herhangi bir iltihap serbest olması beklenmektedir. Ayrıca, aşağıdaki OVA meydan, akciğer DC'leri unde rgo olgunlaşma ve lenf düğümlerine sonraki göç. Duyarlı ve OVA ile meydan farelerin lenf nodu (MLN) içinde CD11c + hücrelerin analizi tuzlu uygulanan farelerin (Şekil 3A) göre CD11c + hücrelerinin yüksek oranda göstermesi bekleniyor. Ayrıca, CD11c + CD11b mutlak hücre sayısının analizi OVA-duyarlı ve meydan farelerin MLN in + OVA-FITC + hücreler, (birkaç kat daha yüksek yani) anlamlı derecede yüksek bir sayı göstermek için bekleniyor tuzlu tedavi edilen farelerde (gelen meslektaşlarıyla Şekil 3B).
Şekil 1. Ovalbumin indüksiyon (OVA) FITC etiketli ovalbumin (OVA-FITC) ile havayolu meydan birlikte farelerde neden olduğu alerjik hava yolu inflamasyonu için deneysel protokol.
fig2.jpg "/>
OVA havayolu meydan takip Şekil 2. OVA sensitizasyon (A) gösterilen akciğer bölümlerin Hematoksilen & Eosin boyama ile belirlenen hava yolu allerjik inflamasyonun indüksiyonu yol açar ve aynı zamanda akciğer Periyodik Asit Schiff boyası ile belirlenen solunum yollarındaki mukus üretimini azalır (B) 'de gösterildiği gibi bölümler.
Şekil 3. OVA-FITC meydan akciğerlerden lenf nodu (MLN) DC göç indükler. (A) Flow sitometri parselleri kontrol veya OVA-sensitize farelerin MLN içinde CD11c + hücre oranları resmediyor. (B) serum fizyolojik veya OVA-sensitize farelerin MLN içinde CD11c + CD11b + OVA-FITC + hücrelerin mutlak sayıları. * P <0.05. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntemi havayolu meydan için OVA-FITC teslim dayalı akciğer DC'leri, analiz için bir akış sitometri tabanlı bir yaklaşım sunuyor. Bu OVA-FITC sürebilir ve izlenen bu nedenle DC nüfus, etkili OVA bağlı alerjik hava yolu inflamasyonu sırasında hava yolu bağışıklık yanıtı katılıyor olanlar akciğer DC'leri, seçici izleme sağlar. Kontrolü farelerde, allerjik hava yolu inflamasyonu yokluğunda, MLN tespit göçmen DC'lerin numaraları (OVA-FITC + DC) önemli bir artışla sonuçlanan alerjik hava yolu inflamasyonu yanıt olarak hızlandırır DC göç, bazal oranları göstergesidir MLN içinde OVA-FITC + DC'lerin mutlak sayısı. Analizi daha kısa zaman dilimi içinde yürütülen ve etkinliği / hassasiyeti çok daha yüksek olabilir, çünkü açıklanan strateji, geleneksel İmmünoboyama / immünohistokimyasal temelli yaklaşımlar üzerinde bir avantaj sunuyor. Bu nedenle eyöntemlerini tarif edildiği gibi uygun bir kontrol akış sitometrisi analizi sırasında kullanılan emin olmak için qually önemlidir. Sonuçlar etkileyebilir başka bir parametre, akciğerlerden, tek bir hücre süspansiyonu preparatıdır. Ayrıca sindirim için fazla akciğer enzimatik sindirim sırasında alınmalıdır Dolayısıyla bakımı bu OVA-FITC ve bakım floresans etkileyebilecek ışığa dokuların önemli maruziyet önlemek için alınması gereken hücrelerin yüzey belirteçlerinin bölünmesine yol açabilir, bu akış analizi etkileyecektir. Makrofaj ve dendritik ileri pulmoner DC nüfusu 9 analizi zorlaştırıyor yüzey belirteçleri, benzer setleri paylaşabilirsiniz. Bu nedenle DC analizi engelleyebilir makrofaj kaldırmak için akciğerlere lavaj için çok önemlidir.
Alerjik enflamasyon hava yolu boyunca pulmoner DC göç analizi ek olarak, belirtilen yöntem potansiyel olarak diğer bağışıklık yanıtı, bir değerlendirmek üzere değiştirilebilirspesifik antijenler bir floresan boya ile işaretlenmiştir ve intranazal teslim olmasına vesile tigens. Daha sonra yukarıda anlatıldığı gibi analiz benzer akciğer DC tepkisini tayin etmek için gerçekleştirilebilir. Antijen etiketli edilemediği durumlarda, antijen sunumu, FITC-dekstran veya KAKE önce birkaç saat farelere teslim edilebilir. Daha sonra, antijen Doğumdan sonra, analizi FITC-dekstran veya spesifik antijen 10,11 ile aşılanmasını takiben pulmoner DC göç kinetikleri gösterir MLN, etmek dendritik etiketli KAKE göçü izlemek için gerçekleştirilebilir. Daha önceki çalışmalarımızda, adenoviral gen tedavisi vektörleri 10 teslim tepki olarak olgunlaşma / akciğer DC'leri göçü değerlendirmek için bu strateji istihdam var. DC'ler sonra flow sitometri ile izlenebilir akciğer DC'leri tarafından hızlı uptake FITC-Dextran sonuçlar fagositik, intranazal teslim olduğu için. Durumlarda, pulmoner plazmasitoid dendritik izlenmesi arzu edilir olduğu, KAKE emplo olmalıdırplasmasitoid DC'ler alımı FITC-Dextran verimli şekilde diğer pulmoner DC alt 10 bunu yapmadıkları için YED.
Bu hava yolu inflamasyonu sırasında pulmoner DC olgunlaşma / göç kantitatif bir analiz sunmaktadır için Hep birlikte, açıklanan stratejinin diğer geleneksel yaklaşımlardan avantajlar sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Dr Jim Hu CIHR ve CF Kanada hibe ve CF Kanada tarafından Rahul Kushwah verilen bir Doktora Öğrenciliği tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Alum | Thermo Scientific | 77161 | |
| OVA-FITC | Sigma-Aldrich | A9771 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Antibodies | e-Bioscience |
References
- Kushwah, R., Hu, J. Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells. Cell Biosci. 20, (2011).
- Kushwah, R., Hu, J. Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system. Immunology. 133, 409-419 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma. Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma. Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).
- Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. Tolerizing allergic responses in the lung. Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).
- Herz, U. The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma. Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).
- Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses. Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).
- Nakae, S. TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).
- Guth, A. M. Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).
- Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery. J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).
- Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells. J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).
