Summary
Planaria के बीच परिभाषित और लगातार आकार के ऊतक की कलम बांधने का काम के लिए एक प्रभावी तरीका वर्णित है. भी शामिल कैसे स्थिरीकरण प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल तकनीक जीवित पशुओं का आंशिक विकिरण के लिए नेतृत्व ढाल, के साथ संयोजन के रूप में अनुकूलित कर सकते हैं की एक विवरण.
Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें (नेतृत्व और chloretone) के संभावित खतरनाक सामग्री से पता चलता है. अधिग्रहण, पढ़ने, और सभी संभावित खतरनाक सामग्री के लिए MSDS का पालन करें.
1. पशु संस्कृति, चयन, और तैयार
- पशु संस्कृति और हैंडलिंग उपयोग planarian (1X Montjuïc लवण 9) के पानी और प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes के लिए.
- . यौन बायोटाइप Schmidtea Mediterranea जब सामान्य संस्कृति 10 की शर्तों के तहत प्रयोगशाला में उठाया इस्तेमाल किया जा सकता है. अपेक्षित आकार की अलैंगिक नमूनों का उत्पादन, एस. Mediterranea सामान्य परिस्थितियों में कमरे के तापमान पर उठाया 9 ट्रिपल सामान्य आवृत्ति (2-3 बार प्रति सप्ताह) डबल में उपयोग से पहले 1-2 महीने के लिए खिलाया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, अलैंगिक सामान्य आवृत्ति पर खिलाया जानवरों अनिश्चित काल सेल्सियस से 10 डिग्री पर रखा जा सकता है क्रम में उनके औसत आकार में वृद्धि.
- जानवरों है कि 1 से 2 सेमी के बीच का चयन करेंलंबाई और 2 मिमी से अधिक व्यापक तो जानवरों 3-7 दिनों का उपयोग करने के पूर्व भूखा.
- अगर इरादा मेजबान, दाताओं, या आंशिक रूप से विकिरणित जानवरों पर कोई औषधीय या रेडियोलॉजिकल उपचार प्रदर्शन, इस बिंदु पर (ओं) को उपचार करते हैं.
- यदि औषधीय उपचार प्रदर्शन किया गया है कि जानवरों खिलाने की आवश्यकता है, जानवरों के एक अतिरिक्त 3 से 7 दिनों का उपयोग करने के पूर्व भूखा.
2. समाधान और सामग्री की तैयारी
- 0.1-0.2% chloretone w / वी planarian पानी में भंग और बर्फ पर समाधान द्रुतशीतन द्वारा समाधान chloretone, एक हल्के स्थानीय संवेदनाहारी, तैयार हो जाओ.
- यदि आंशिक विकिरण प्रदर्शन केवल 2.7 कदम आगे बढ़ना. ऊतक प्रत्यारोपण के लिए जारी रखने के चरण से 2.3.
- एक लेम्प बर्नर का प्रयोग, 0.75 मिमी व्यास इंटीरियर, भ्रष्टाचार ऊतक को काटने के लिए प्रयोग किया जाता है, और 0.7 मिमी की बाहरी व्यास, मेजबान में एक छेद है जो 1-2 सेमी में भ्रष्टाचार, 90 एक केशिका ट्यूब ° कोण प्राप्त होगा बनाने के लिए इस्तेमाल मोड़ ea के अंत सेचर्चा ट्यूब. करने के लिए सामग्री को बचाने के लिए, प्रत्येक केशिका ट्यूब के दोनों सिरों को मोड़ और उन्हें तोड़ने छमाही में दो उपकरणों का उत्पादन. लौ ट्यूब की बहुत समाप्त होता है के लिए नहीं ख्याल रखना.
- संकेत आकार करने के लिए निम्नलिखित कागजात कटौती:
- काले फिल्टर पेपर (आयतों लगभग 2.5 सेमी x 1.5 सेमी में कटौती)
- वाटमान # 3 फिल्टर पेपर (आयत लगभग 2 सेमी x 0.5 सेमी में कटौती)
- Kimwipe (तह और बेचते लगभग में कटौती 3 सेमी x 0.5 सेमी x प्लाई 4)
- सिगरेट कागज रोलिंग (गम पट्टी को हटाने के और आयतों लगभग में कटौती 3 सेमी. X 2 सेमी)
- तैयार संशोधित Holtfreter समाधान (3.5 छ / एल NaCl, 0.2 छ / एल 3 NaHCO, 0.05 छ / एल KCl, 0.2 छ / एल 4 MgSO, 0.1 छ / एल 2 CaCl, पीएच 7.0-7.5) और कैसिइन है Holtfreter समाधान और सर्द संतृप्त दोनों से 4 डिग्री सेल्सियस
- वर्ग Parafilm की एक और Peltier कूलर प्लेट या अन्य ठंडा विदारक खुर्दबीन के नीचे स्थित डिवाइस पर जगह एक जोड़ Kimwipe के संलग्न. ठंडा Holtf साथ Kimwipe तरहै reter समाधान और जगह दो काले Kimwipe पर फिल्टर कागज आयत.
- लाइन वाटमान 2 फिल्टर पेपर के साथ पेट्री डिश. Holtfreter समाधान के साथ फिल्टर पेपर गीला और बर्फ पर बर्तन ठंडा. आंशिक रूप से विकिरण के लिए एक बड़ा पकवान और फिल्टर पेपर लाइनर इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. Anesthetization और स्थिरीकरण
- पकवान में ठंडा chloretone समाधान और विंदुक कीड़े के साथ एक पेट्री डिश भरें. प्रत्यारोपण के लिए केवल एक मेजबान और एक समय में एक दाता चतनाशून्य करना. आंशिक रूप से विकिरण के लिए कई जानवरों (n> 10) संवेदनाहृत में एक बार हो सकता है.
- कीड़े chloretone समाधान में सोख करने के लिए जब तक वे स्थिर हो गया है की अनुमति दें (5-10 मिनट).
- उन्हें एक ठंडा Holtfreter समाधान के साथ भरा पकवान में pipetting द्वारा कीड़े कुल्ला.
- उन्हें काले फिल्टर ठंडा Holtfreter समाधान और उन्हें संदंश के साथ उदर की ओर उन्मुख नीचे के साथ संतृप्त कागज पर pipetting द्वारा जानवरों को स्थिर करना. अगर पशुओं नियंत्रण रेखा के लिए कर रहे हैंomote के, अतिरिक्त Holtfreter समाधान सोख, थोड़ा अपने Peltier या थाली ठंड के तापमान में कमी, या chloretone उपचार की लंबाई में वृद्धि.
4. आंशिक किरणन
नोट: इन चरणों का पालन करने के लिए आंशिक विकिरण के लिए पशुओं को तैयार. यदि प्रत्यारोपण के बजाय प्रदर्शन, धारा 5 के लिए आगे बढ़ना.
- 2.7 कदम से है कि एक शीर्ष एक्स - रे irradiator स्रोत के अंदर फिट होगा एक बर्फ बाल्टी में बर्फ पर एक ठंडा पेट्री डिश रखें.
- जिस पर वे स्थिर हैं काला फिल्टर पेपर हिल द्वारा anesthetized जानवरों को एक पेट्री डिश में व्यवस्था करो. संदंश का प्रयोग लिए संवेदनाहृत कीड़े सीधे कदम उन्हें घायल कर सकता है.
- परिवहन एक एक्स - रे irradiator शीर्ष स्रोत के लिए पशुओं की व्यवस्था और ऐसी है कि कैथोड ट्यूब से जानवरों के लिए दूरी कम से कम है बर्फ बाल्टी स्थित है, इस प्रकार प्रभावी खुराक दर अधिकतम.
- स्थिति सीसा () (चित्रा 1) जानवरों और कैथोड टी के बीच ढालयूबे के रूप में वांछित. ढाल 4.5-6 मिमी एक 325kV 11 एक्स - रे किरण 97-99% क्षीणन के लिए अनुमति देने के लिए मोटी होना चाहिए.
- एक्स - रे खुराक देने. यदि गैर परिरक्षित क्षेत्रों से पूरी तरह स्टेम सेल पृथक वांछित है, 30 Gy या अधिक से अधिक एक एक्स - रे irradiator का उपयोग देने. संदर्भ के लिए, 30 Gy 320 kilovolts में 3.6 मिनट और 30 सेंटीमीटर की दूरी क्षेत्र के लिए स्रोत के साथ एक प्रेसिजन एक्स रे, Inc XRAD320 में 10 milliamps बराबर है.
- तुरंत खुराक के बाद पूरा हो गया है, काले फिल्टर पेपर, स्थानांतरण जानवर द्वारा ठंडा planarian पानी में कीड़े से निपटने. Planarian कमरे के तापमान और पशुओं के लिए पानी गर्म करने के लिए खुद को काले फिल्टर पेपर से जगह देना अनुमति दें. आंशिक विकिरण प्रक्रिया अब पूरा हो गया है.
5. ऊतक प्रत्यारोपण
- एक हस्तांतरण विंदुक और संदंश का प्रयोग, anesthetized मेजबान और काला फिल्टर पेपर के अलग आयतों पर Kimwipe पर दाता कीड़े जो Pelti पर ठंडा है की व्यवस्थाएर या कूलर विदारक माइक्रोस्कोप के तहत थाली.
- एक .75 मिमी भीतरी व्यास केशिका ट्यूब का प्रयोग दाता से भ्रष्टाचार प्लग में कटौती और, संदंश का उपयोग कर, यह मेजबान के रास्ते भाग की एक बाहर पर जगह है. यदि भ्रष्टाचार सामग्री केशिका ट्यूब में अटक जाता है, संदंश के साथ जगह देना.
- 0.7 मिमी की बाहरी व्यास केशिका ट्यूब मेजबान से एक प्लग को हटाने और छेद है कि पीछे छोड़ दिया है संदंश स्थिति में भ्रष्टाचार का उपयोग.
- 2.7 चरण में तैयार पेट्री डिश में अपनी काली फिल्टर पेपर आयत पर प्रतिरोपित मेजबान हस्तांतरण.
- कैसिइन संतृप्त Holtfreter समाधान के साथ रोलिंग कागज का एक टुकड़ा गीला और यह प्रतिरोपित मेजबान के शीर्ष पर जगह के रूप में चित्रा 2A में diagramed.
- कैसिइन संतृप्त Holtfreter के समाधान में और प्रतिरोपित मेजबान के रूप में चित्रा 2B में diagramed के डिब्बे में रखना फिल्टर पेपर के चार टुकड़े भिगोएँ.
- कैसिइन संतृप्त Holtfreter समाधान में चार कट Kimwipe की बेचते भिगोएँ और उन्हें रखना खत्म हो5.6 कदम से फिल्टर पेपर (चित्रा 2B). ढक्कन बदलें और बर्फ पर पेट्री डिश में डाल दिया.
- Planarian पानी के लिए ठीक हो, ठीक है, और पुनर्जन्म में स्थानांतरण दाता कीड़ा.
- जब सभी प्रत्यारोपण पूरा कर रहे हैं, एक 10 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्रतिरोपित कीड़े रातोंरात जगह.
- निम्नलिखित सुबह, देखभाल करने के परेशान करने के लिए नहीं भ्रष्टाचार, कृमि को उजागर और यह एक पेट्री planaria पानी से भरा पकवान अपनी काली फिल्टर पेपर पर स्थानांतरण.
- या तो कीड़ा ही फिल्टर पेपर से जगह देना या धीरे यह संदंश के साथ हटाने के लिए अनुमति देते हैं.
- हर एक बार 2-3 दिन planarian पानी बदलें.
6. प्रतिनिधि परिणाम
तुरंत आंशिक विकिरण planaria के बाद सामान्य और अप्रभावित दिखाई देगा. दिया खुराक और इस्तेमाल किया ढाल की ज्यामिति पर निर्भर करता है, विकिरणित ऊतक निकासी और यहां तक कि 7 बिखर सकता है. परिरक्षित ऊतक बरकरार रहना चाहिए. Follकारण ऊतक प्रतिगमन और ऊतक की अखंडता का एक नुकसान, एक भ्रूण की गिलाफ फार्म और लापता संरचनाओं (चित्रा 3A) पुनर्जीवित किया जाएगा. यदि एक विच्छेदन आंशिक रूप से विकिरणित क्षेत्र में किया जाता है, विकिरणित ऊतक (यानी regressing या बिखरने से रोका) बचाया जाएगा (3B चित्रा). दोनों रिहाई का और काट मामला उत्थान के रूप में एक काट गैर विकिरणित planaria है (चित्रा -3 सी) की तुलना में विलंब होगा. यदि एक्स - रे 30 Gy की एक खुराक दिया गया था और आंशिक रूप से विकिरणित पशु रिहाई का नेतृत्व इस्तेमाल किया ढाल इसी के साथ 2 से 3 दिन आंशिक विकिरण के बाद होने की पुष्टि कर सकते हैं द्वारा स्वस्थानी संकरण में स्टेम सेल के लिए एक पैटर्न में सफल स्टेम सेल पृथक में मार्कर Smed - Piwi 1 - 12 (उर्फ smedwi 1) (चित्रा 4).
सुबह प्रत्यारोपण प्रतिरोपित ऊतकों की एक सफल भ्रष्टाचार के बाद स्पष्ट w के होना चाहिएमेजबान ऊतक ithin, दोनों मेजबान (चित्रा 5A) के पृष्ठीय और ventral सतहों का पालन किया. कभी कभी, भ्रष्टाचार केवल उदर या पृष्ठीय सतह का पालन करना होगा. यदि प्रत्यारोपण पूरी तरह से असफल रहा था, भ्रष्टाचार के कोई संकेत नहीं है या तो मेजबान (चित्रा 5 ब) के पृष्ठीय या ventral सतह से दिखाई देगा. फौरन गैर विकिरणित ऊतक के एक मेजबान के घातक विकिरण 13,14, के द्वारा किया गया था स्टेम कोशिकाओं के Smed - Piwi-1 कि स्टेम सेल मौजूद हैं भ्रष्टाचार के भीतर मुख्य रूप से पता चलता है (चित्र 5C के लिए स्वस्थानी संकरण में ablated में एक सफल भ्रष्टाचार के बाद ). इसके अतिरिक्त, गैर विकिरणित ऊतक के सफल grafts के lethally विकिरणित मेजबान में मेजबान ऊतक और 15 की मेजबानी के दीर्घकालिक अस्तित्व के बचाव में परिणाम देगा.
आकृति 1. बुनियादी घटक की सामान्य व्यवस्थाआंशिक विकिरण के लिए irradiator एक शीर्ष तैनात स्रोत एक्स - रे के साथ एक एक्स - रे कैथोड ट्यूब संवेदनाहृत planarian के विकिरण क्षेत्र के भीतर एक्स - रे स्रोत सीधे नीचे तैनात है. आदेश में एक्स - रे खुराक दर को अधिकतम करने के लिए, planarian और एक्स - रे स्रोत के बीच की दूरी कम से कम किया जाना चाहिए. एक का नेतृत्व ढाल कैथोड ट्यूब और anesthetized कीड़ा, के रूप में व्यावहारिक रूप में कीड़ा के करीब के बीच तैनात किया जाना चाहिए. तो यह वांछित ऊतक ढाल कि लेकिन पूरी तरह से कृमि के बाकी को उजागर नेतृत्व ढाल, डिजाइन किया जाना चाहिए निर्मित है, और तैनात. कई वाणिज्यिक बनाती अपने सरल डिजाइन आरेख से कस्टम नेतृत्व ढाल का उत्पादन होगा, हम सफलतापूर्वक अल्फा सिस्टम कार्पोरेशन (Bluffdale, केन्द्र शासित प्रदेशों) का इस्तेमाल किया है. नेतृत्व पर्याप्त परिरक्षण की वांछित राशि के लिए अनुमति देने के लिए मोटी होना चाहिए. उदाहरण के लिए, अगर पूरा पास एक 320 केवी एक्स - रे किरण का परिरक्षण वांछित है, का नेतृत्व 4.5-6 मिमी मोटी होना चाहिए. planarian और ढाल पर तैनात हैंएक Holtfreter लथपथ फिल्टर पेपर पेट्री डिश है जो एक बर्फ बाल्टी में टिकी हुई है लाइन. एक पर्याप्त बड़ी विकिरण एक्स - रे क्षेत्र और समान नेतृत्व ढाल की संख्या को देखते हुए, कई नमूनों आंशिक रूप से एक बार (चित्र नहीं) पर विकिरणित किया जा सकता है.
चित्रा 2. वसूली कक्ष (ए) ऊतक प्रत्यारोपण वसूली कक्ष के एक विस्फोट दृश्य बिल्डिंग, के सभी घटक है कि कैसिइन संतृप्त Holtfreter के समाधान में भिगो जा रहा है के बाद एक दूसरे के शीर्ष पर स्तरित हैं दिखा. (बी) के एक लगभग पूरा वसूली कक्ष, illustrating के वाटमान की इंटरलॉकिंग प्लेसमेंट # 3 फिल्टर पेपर आयत जो में snugly संवेदनाहृत planarian डिब्बे में बंद करना, उपचार के दौरान आंदोलन को रोकने. वसूली कक्ष के निर्माण सावधान पशु आंदोलन और शुष्क्ीकरण रोकता है, तेजी से और ऊतक प्रत्यारोपण के अधिक से अधिक प्रभाव के उपचार को बढ़ावा देने.
चित्रा 3. सरल पीछे आंशिक विकिरण के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में ड्यूविस 7 में वर्णित है., (ए) है जब planarians के पीछे आधा नेतृत्व के साथ परिरक्षित किया गया और फिर से एक्स - रे विकिरण के संपर्क में पूर्वकाल ऊतक विकिरणित और कवच के बीच सीमा को वापस निकासी मनाया गया जो ऊतक के बिंदु unpigmented blastemas गठन और जानवरों को पुनर्जीवित करने के लिए शुरू किया. (बी) दूसरी ओर, जब जानवर एक ही आंशिक विकिरण (ए), ऊतक प्रतिगमन मनाया और शेष विकिरणित पूर्वकाल ऊतक बचाया था नहीं किया गया प्रदर्शन के बाद में decapitated गया. आंशिक रूप से विकिरणित पुनर्जीवित सिर (बी) जानवरों decapitated, लेकिन, उत्थान काफी unirradiated decapitated नियंत्रण (सी) के रूप में की तुलना में विलंब हो गया.
चित्रा 4. प्रतिनिधि outcoमुझे आंशिक स्टेम सेल पृथक की आंशिक विकिरण के बाद स्टेम सेल मार्कर Smed - Piwi-1 के लिए स्वस्थानी संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट कि जंगली प्रकार planaria के पता चलता है. स्टेम कोशिकाओं ऊतक के लिए पूर्वकाल अपवाद के साथ अपने शरीर भर में वितरित (नोक) photoreceptors और ग्रसनी उचित 14 (तारांकन). (ए) विकिरणित लेकिन पूरी तरह से परिरक्षित नियंत्रण में Smed - Piwi-1 के लिए इच्छा planaria तय विकिरण के बाद तीन दिन है कि जंगली प्रकार planaria के उस से अप्रभेद्य है एक स्टेम सेल वितरण से पता चलता है. (ख) दूसरी ओर, जानवरों है कि केवल आंशिक रूप से परिरक्षित गया में Smed Piwi-1 के लिए करना चाहते हैं, पूर्वकाल और कूल्हों उजागर छोड़ने, लेकिन तीन दिन विकिरण शो के बाद भी कि स्टेम सेल गैर परिरक्षित क्षेत्रों में से ablated तय . स्केल सलाखों 500 माइक्रोन हैं.
चित्रा 5. Exaसफल और असफल ऊतक प्रत्यारोपण के mples. (ए) एक सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित planarian पर तीन दिनों के प्रत्यारोपण के बाद का पृष्ठीय और ventral विचारों की छवियों जीते. भ्रष्टाचार (संकेत) दोनों पृष्ठीय और ventral सतहों पर स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और भ्रष्टाचार मेजबान अंतरफलक में विशेषता unpigmented ऊतक के साथ घिरा हुआ है. (बी) तदनुसार, असफल प्रत्यारोपण प्रत्यारोपण साइट (संकेत) में नहीं दिखाई भ्रष्टाचार ऊतक प्रदर्शित और बजाय एक चंगा, unpigmented, असफल प्रत्यारोपण से पार्श्व घाव दिखा. एक भ्रष्टाचार है कि केवल पृष्ठीय या उदर सतह का पालन करता है एक सफल (ए) जब एक तरफ और एक असफल प्रत्यारोपण (बी) से देखा जब दूसरे से देखा प्रत्यारोपण के समान कर सकते हैं. (सी) जब जंगली प्रकार के ऊतक (wt) एक विकिरणित मेजबान के निवासी स्टेम सेल और प्रतिरोपित स्टेम सेल के ablated में grafted है बाद में Smed - Piwi-1 प्रत्यारोपण के बाद दो दिन के लिए इच्छा के द्वारा पता चला,प्रत्यारोपण की सफलता ही में या चारों ओर भ्रष्टाचार के स्थान (तीर) स्टेम कोशिकाओं की विशिष्ट उपस्थिति द्वारा स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया जाता है. स्केल सलाखों 500 माइक्रोन हैं.
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Discussion
स्थिरीकरण का महत्व
स्थिरीकरण द्वारा अब तक इन प्रक्रियाओं में से किसी के सफल समापन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है. यदि planaria अनुचित तरीके से आंशिक विकिरण से पहले स्थिर रहे हैं, वे नेतृत्व ढाल के नीचे ले जाने के लिए, असंगत और confounding परिणाम का निर्माण हो सकता है. इसके अलावा, अगर पशुओं अपर्याप्त प्रत्यारोपण के बाद स्थिर कर रहे हैं, मेजबान कीड़ा संभावना भ्रष्टाचार ऊतक से दूर कदम होगा, होस्ट करने के लिए ठीक से चंगा भ्रष्टाचार की विफलता में जिसके परिणामस्वरूप. उचित स्थिरीकरण एकाग्रता या chloretone उपचार के लंबाई का समायोजन करके हासिल की है और जो planaria बाकी पर और फिल्टर पेपर के तापमान और नमी. एक आधे घंटे के लिए 0.2 प्रतिशत पर chloretone उपचार करने के लिए विषाक्त हो सकता है प्रकट नहीं होता है, तथापि, कि लंबाई के उपचार ग्रसनी का इंजेक्शन उत्पन्न हो सकता है. Planaria अभी भी समय की लंबाई के दौरान आंशिक विकिरण करने के लिए उत्तरदायी रहना. हमारे अनुभव से पता चला है किनमी, chloretone उपचार के बजाय, सबसे महत्वपूर्ण कारक है - भी गीला और जानवरों को आसानी से चाल, बहुत शुष्क और जानवरों झुरना जाएगा. सभी मामलों में फिल्टर पेपर पूरी तरह से नहीं बल्कि कंटेनर के भीतर या सतह पर खड़े पानी बनाने की बात करने के लिए संतृप्त किया जाना चाहिए. अतिरिक्त तरल पेट्री डिश से हिल जा सकता है. फिल्टर पेपर तर करने के लिए इस्तेमाल किया तरल की राशि कोई संदेह नहीं है के लिए विशिष्ट पर्यावरणीय नमी अनुसार समायोजित किया जा आवश्यकता होगी.
प्रत्यारोपण के स्पीड
स्पीड दोनों आंशिक विकिरण और प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता बढ़ाने में आवश्यक है. अब आंशिक रूप से विकिरणित जानवरों स्थिर रहे हैं अधिक से अधिक एक चोट की संभावना है या ऊतक की अखंडता में एक ब्रीच जो एक विशेष परख के परिणाम तिरछा हो सकता है. गति, जिस पर प्रत्यारोपण preformed कर रहे हैं मोटे तौर पर सफल भ्रष्टाचार दर के साथ संबद्ध है. अगर मेजबान है कि भ्रष्टाचार प्राप्त करने में छेद खाली छोड़ दिया हैभी लंबे समय के लिए, घायल उदर और पृष्ठीय सतहों को एक दूसरे के बजाय भ्रष्टाचार के ऊतकों को चंगा शुरू करने के लिए, इस प्रकार एक असफल प्रत्यारोपण में जिसके परिणामस्वरूप. हमारे हाथ में भ्रष्टाचार प्लग कभी कभी ही केशिका ट्यूब में दर्ज हो जाता है. उन अवसरों पर, प्लग आम तौर पर ठीक संदंश साथ या केशिका ट्यूब के माध्यम से मुँह से हवा मजबूर द्वारा जल्दी से कर सकते हैं उखाड़ फेंकना जा. एक बार एक प्रत्यारोपण प्रक्रिया के साथ अभ्यास हो जाता है, समय के लिए उत्पादन कई grafted पशुओं बहुत अगले जोड़ी दाता मेजबान anesthetizing जबकि पिछले जोड़ी कलम बांधने का काम करके कम किया जा सकता है की जरूरत है. Anesthetization और प्रत्यारोपण समवर्ती प्रदर्शन करके, वास्तविक समय प्रत्येक grafted पशु उत्पादन के लिए आवश्यक के रूप में छोटे रूप में पाँच मिनट के लिए छोड़ सकते हैं.
आंशिक विकिरण और प्रत्यारोपण की बहुमुखी प्रतिभा
एक बार anesthetization और आंशिक विकिरण के लिए शर्तों विशिष्ट प्रयोगात्मक environme के अनुसार अनुकूलित कर रहे हैंNT और उपलब्ध irradiator एक्स - रे, विभिन्न प्रयोगों की संख्या है कि आंशिक विकिरण तकनीक का उपयोग किया जा सकता है बड़ा हो जाता है. उन्नत नेतृत्व मशीनिंग तकनीक न केवल जटिल विकिरण ढाल है कि विशिष्ट अंगों और ऊतकों को लक्षित कर सकते हैं के उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन भी समान ढाल की बड़ी संख्या के निर्माण, कई प्रतिकृति जैविक का तेजी से निर्माण की अनुमति है. भविष्य जांच कोई संदेह नहीं है, इस पद्धति का लाभ ले जाएगा स्थानीयकृत स्टेम सेल planarian के विभिन्न भागों में मौजूद स्टेम सेल आबादी के बीच पृथक और कार्यात्मक अंतर के लिए vivo सेलुलर प्रतिक्रियाओं में परीक्षण. आंशिक विकिरण के बहुमुखी प्रतिभा के रूप में, यह ब्याज की वैज्ञानिक प्रश्न से संबंधित है, वर्तमान नेतृत्व मशीनिंग तकनीक और कल्पना केवल द्वारा सीमित है. इसलिए, आंशिक विकिरण तकनीक की असली शक्ति की क्षमता में झूठ बोलने के लिए ठीक से ढाल सकता है और लगभग किसी भी अलग से तैनात काटकर अलग करनास्टेम सेल के उप - जनसंख्या.
जबकि प्रत्यारोपण भी स्टेम सेल के एक subpopulation के अलगाव के लिए अनुमति देता है, इस तकनीक का अधिक महत्वपूर्ण लाभ के लिए विभिन्न मेजबान या दाता प्रत्यारोपण करने से पहले का इलाज करने की क्षमता है. मेजबान या एक दवा या शाही सेना के हस्तक्षेप के साथ दाता के उपचार, कैसे अनुपचारित प्रतिरोपित कोशिकाओं को एक इलाज वातावरण में व्यवहार करते हैं या इलाज कैसे कोशिकाओं एक अनुपचारित वातावरण में व्यवहार की जांच के लिए अनुमति देगा. प्रयोगों के इन प्रकार के निश्चित रूप से अलग स्वायत्त और गैर स्वायत्त आणविक योगदान तंग करने के लिए स्टेम सेल समारोह में मदद मिलेगी.
इसके अतिरिक्त, के रूप में शास्त्रीय planaria में कलम बांधने का काम प्रयोगों को पहले से ही 5,6 से पता चला है, ऊतक प्रत्यारोपण के विभिन्न ऊतकों के उत्थान के दौरान आगमनात्मक संभावित खोज के लिए एक आदर्श तकनीक है. के रूप में planarian अनुसंधान आणविक उम्र में प्रवेश करती है, हम छोटा सा भूत की बहुत विशिष्ट स्थानीयकृत अभिव्यक्ति को उजागर करने के लिए शुरू कर दिया हैortant संकेतन अणुओं है जो सीधे 16 उत्थान नियंत्रण. रोपाई ऊतकों है कि इन संकेतन अणुओं होते उत्थान के दौरान अस्थानिक साइटों के लिए हमें मदद regenerating के संरचनाओं के morphogenesis निर्देशन में उनकी भूमिका को बेहतर ढंग से समझ सकते हैं.
आंशिक विकिरण और ऊतक प्रत्यारोपण की तकनीक दूसरे पर लाभ
निहित विशिष्ट ताकत है कि आंशिक विकिरण और ऊतक प्रत्यारोपण जब एक दूसरे से तुलना के अलावा, वे भी अन्य planarian उत्थान के क्षेत्र में इस्तेमाल तकनीक पर विशेष लाभ प्रदान करते हैं. उदाहरण के लिए, कम खुराक विकिरण करने के लिए एक अन्यथा स्टेम सेल रहित 4,17 मेजबान, तथापि के भीतर स्टेम सेल की एक छोटी संख्या को अलग तरीके के रूप में उपयोग किया गया है, क्योंकि हम नहीं जानते कि कैसे sublethal विकिरण planarian स्टेम कोशिकाओं को प्रभावित करता है, हमें यकीन नहीं हो सकता कि सेलुलर इन प्रयोगों में मनाया व्यवहार विशेषता से सामान्य हो रहे हैं.कम खुराक विकिरण की इस चेतावनी कम आंशिक विकिरण में एक चिंता का है क्योंकि विकिरण जोखिम को आसानी से तनु उचित मोटाई की बढ़त के साथ 99 प्रतिशत से अधिक हो सकता है. इसके अलावा, प्रत्यारोपण पूरी तरह से इस चेतावनी से बचा जाता है क्योंकि स्टेम सेल की एक छोटी सी आबादी कभी विकिरण करने के लिए प्रतिरोपित कोशिकाओं को प्रकाश में लाने के बिना एक स्टेम सेल रहित मेजबान के भीतर अलग किया जा सकता है. इसके अलावा, स्वस्थ स्टेम सेल की सही स्थिति से जाना जा सकता है दोनों आंशिक विकिरण और प्रत्यारोपण के नियंत्रण में है, जबकि कम खुराक विकिरण जीवित कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से पशु भर में तैनात हैं. अंत में, जबकि एकल कोशिका प्रत्यारोपण elegantly एक एकल 4 planarian स्टेम सेल की उच्च क्षमता का प्रदर्शन किया है, ऊतक प्रत्यारोपण के एक समान रूप से शक्तिशाली तकनीक साबित होता है क्योंकि यह तेजी से, कम थकाऊ है, हो सकता है और समारोह और कक्षों की एक संख्या के व्यवहार के साथ मनाया जा सकता है प्रत्येक मेजबान में. कक्षों की एक छोटी सी आबादी का विश्लेषणएक एकल कोशिका की तुलना में न केवल अधिक कुशल डेटा की सभा के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी है कि एक एकल कोशिका प्रत्यारोपण परख में याद किया जाएगा सेल सेल बातचीत प्रकट हो सकता है.
निष्कर्ष
आंशिक विकिरण और ऊतक प्रत्यारोपण, हालांकि पुरानी तकनीक, planarian स्टेम कोशिकाओं के कार्यों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य आणविक उत्थान अंतर्निहित तंत्र विदारक में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभानी होगी. इन शास्त्रीय तकनीकों के आधुनिकीकरण उच्च throughput और अधिक से अधिक स्थिरता लाया गया है, जबकि आधुनिक कार्यात्मक assays और आणविक तकनीक के एकीकरण के लिए अनुमति देता है. इन शास्त्रीय तकनीक है कि एक बार planarian उत्थान के प्रमुख सवालों का उल्लेख किया गया है अब उन सवालों के जवाब खोजने के लिए और आगे इसलिए स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए planarian प्रत्यारोपण पर उपयोगी सलाह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सांचेज़ प्रयोगशाला के अतीत और वर्तमान सदस्यों के लिए इन तकनीकों के विकास के दौरान अमूल्य विचार विमर्श के लिए Chiyoko कोबायाशी और Kiyokazu Agata धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम एनआईएच प्रशिक्षण OCG और एएसए के लिए एनआईएच R37GM057260 अनुदान (HD0791 5T32) द्वारा समर्थित किया गया था. एएसए एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 | |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 | |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 | |
| Black filter paper | Schleicher Schuell | 10310809 | |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B | |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E | |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA | |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 | |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 | |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 | |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 | |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design | |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 Forthcoming.
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l 'ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
