Planarian Immobilisering, Delvis bestråling og vævstransplantation

Summary

En effektiv fremgangsmåde til podning væv veldefineret og ensartet størrelse mellem planaria er beskrevet. Også indbefattet er en beskrivelse af, hvordan immobilisering anvendte teknik til transplantation kan tilpasses, sammen med bly skjolde, til delvis bestråling af levende dyr.

Abstract

Det planarian, en ferskvands fladorm, har vist sig at være et effektivt system til dissekere metazoan regenerering og stamcellebiologi ^1,2. Planarian regenerering af eventuelle manglende eller beskadigede væv er gjort mulig ved voksne stamceller kaldes neoblasts ^3. Selv om disse stamceller er blevet definitivt vist at være pluripotente og enkeltvis stand til at rekonstituere et helt dyr ⁴ heterogeniteten i stamcellepopulation og dynamikken i deres cellulære adfærd stort set uløst. Grund af det store antal og udbredelse af stamceller gennem planarian kroppen plan, der avancerede metoder til manipulering subpopulationer af stamceller for molekylær-og funktionelle studier in vivo brug.

Vævstransplantation og delvis bestråling er to metoder, som en subpopulation af planarian stamceller kan isoleres til yderligere undersøgelse. Hver teknik har forskellige fordele. Tproblem transplantation tillader indføring af stamceller, i en naiv vært, der er enten iboende genetisk forskellige, eller tidligere er blevet behandlet farmakologisk. Alternativt delvis bestråling muliggør isolering af stamceller i en vært, anbragt på væv uden stamceller, uden indføring af et sår eller en bundstykket i væv integritet. Ved hjælp af disse to metoder, kan man undersøge celle autonome og ikke-autonome faktorer, der styrer stamceller funktioner, såsom proliferation, differentiering og migration.

Både vævstransplantation ^5,6 og partiel bestråling ⁷ har været anvendt historisk til at definere mange af de spørgsmål om planarian regenerering, der fortsat er under undersøgelse i dag. Imidlertid har disse teknikker forblev underudnyttede grundet arbejdskrævende og usammenhængende art tidligere metoder. De protokoller, der præsenteres her repræsenterer et stort skridt fremad i begrænse den tid, ennd nødvendige indsats for at reproducerbart frembringe store antal podede eller delvist bestrålede dyr med effektiviteter nærmer sig 100 procent. Vi dækker kultur store dyr, immobilisering, forberedelse til delvis bestråling, vævstransplantation, og optimering af animalsk opsving. Endvidere arbejdet beskrevet her, viser den første anvendelse af den delvise bestråling fremgangsmåde til brug med den mest undersøgte planarian, Schmidtea Mediterranea. Derudover effektiv vævstransplantation i planaria åbner døren for den funktionelle test af delpopulationer af naive eller behandlet stamceller i genindsættelse assays, som længe har været guld-standard metode til analyse voksne stamceller potentiale i pattedyr ^8. Bred indførelse af disse teknikker vil uden tvivl føre til en bedre forståelse af de cellulære adfærd af voksne stamceller under vævshomeostase og regenerering.

Protocol

Bemærk: denne protokol foreslår brugen af potentielt farlige materialer (bly og chloretone). Acquire, læse, og følg MSDS for alle potentielt farlige materialer.

1. Animal Kultur, udvælgelse og forberedelse

1. For dyr kultur og håndtering brug planarian vand (1X Montjuic salte ⁹⁾ og plast overførselspipetter.
2. Seksuel biotype Schmidtea Mediterranea kan bruges når den er hævet i laboratoriet under normale dyrkningsbetingelser ^10. At fremstille ukønnede prøver af fornødne størrelse, S. Mediterranea rejst ved stuetemperatur under normale vilkår ⁹ skal fodres med dobbelt til tredobbelt normal frekvens (2-3 gange om ugen) for en til to måneder før at bruge. Alternativt kan ukønnede fodret med normale frekvens holdes på 10 ° C på ubestemt tid med henblik på at forøge deres gennemsnitlige størrelse.
3. Selektere dyr, der er mellem 1 til 2 cm ilængde og bredere end 2 mm og derefter sulte dyr 3-7 dage før brug.
4. Hvis du udfører nogen farmakologiske eller radiologiske behandlinger om planlagte værter, donorer, eller delvis bestrålede dyr, udføre behandlingen (r) på dette punkt.
5. Hvis farmakologiske behandlinger blev udført som kræves fodring af dyrene, sulte dyr i yderligere 3 til 7 dage før brug.

2. Udarbejdelse af løsninger og materialer

1. Fremstille chloretone opløsning, en mild lokal anæstetikum, ved at opløse 0,1-0,2% w / v chloretone i planarian vand og afkøling af opløsningen på is.
2. Hvis der udføres partiel bestråling alene, skal du fortsætte til trin 2,7. For vævstransplantation fortsætte til trin 2,3.
3. Anvendelse af en bunsenbrænder, 0,75 mm indvendig diameter, der anvendes til skæring af transplantatvæv, og 0,7 mm ydre diameter, der anvendes til at skabe et hul i den vært, der skal modtage transplantatet, kapillarrør til en 90 ° vinkel på 1-2 cm bøje fra slutningen af ​​eaCH rør. At spare materiale, bøje begge ender af hvert kapillarrør og bryde dem i halv for at frembringe to værktøjer. Pas på ikke at flamme selve enderne af rørene.
4. Skær de følgende papirer til de angivne størrelser:
   • Sort filtrerpapir (skåret i firkanter ca. 2,5 cm x 1,5 cm)
   • Whatman # 3 filterpapir (skåret i firkanter cirka 2 cm x 0,5 cm)
   • Kimwipe (foldes og skæres i forladninger ca. 3 cm x 0,5 cm x 4 lag)
   • Cigaretrulning papir (fjern gummi strimmel og skæres i firkanter ca 3 cm x 2 cm)
5. Fremstille modificerede Holtfreter løsning (3,5 g / L NaCl, 0,2 g / L _NaHCO3, 0,05 g / L KCI, 0,2 g / L _MgSO4, 0,1 g / _l CaCl2, pH 7,0-7,5) og casein mættet Holtfreter opløsning og chill både til 4 ° C.
6. Vedhæft en foldet Kimwipe til et kvadrat af Parafilm og sted på Peltier køler plade eller en anden køleenhed placeret under et dissektionsmikroskop. Mættes Kimwipe med kølede Holtfreter løsning og sted to sorte filter papir rektangler på Kimwipe.
7. Linie petriskåle med Whatman nr. 2 filterpapir. Fugt filtrerpapiret med Holtfreter løsning og køling af retter på is. Delvis bestråling større skål og filterpapir foring kan anvendes.

3. Bedøvelse og Immobilisering

1. Fyld en petriskål med afkølet chloretone løsning og pipettespidser orme i fadet. For transplantation kun bedøver en vært og en donor ad gangen. Delvis bestråling mange (n> 10) dyr kan være bedøvet på én gang.
2. Lad orme at suge i chloretone løsning, indtil de bliver ubevægelige (5-10 min).
3. Skylning orme ved pipettering dem i en skål fyldt med afkølet Holtfreter opløsning.
4. Immobilisere dyr ved pipettering dem på sort filtrerpapir mættet med afkølet Holtfreter opløsning og orientere dem ventrale nedad med pincet. Hvis dyr er i stand til locomote, opsuge overskydende Holtfreter løsning, falde lidt temperaturen på din Peltier eller kold plade, eller øge længden af ​​chloretone behandling.

4. Delvis Bestråling

Bemærk: Følg disse trin for at forberede dyrene til delvis bestråling. Hvis der udføres transplantation i stedet gå til pkt 5.

1. Placer en kølet petriskål fra trin 2,7 på is i en isspand, der vil passe ind i en top kilde X-ray strålerøret.
2. Arrangere bedøvede dyr i en petriskål ved at bevæge den sorte filtrerpapir på hvilke de er immobiliseret. Ved hjælp af en pincet til at bevæge bedøvede orme direkte kan skade dem.
3. Transport arrangeret dyr til en top-kilde røntgen strålerøret og placerer isspanden således, at afstanden fra katoden røret til dyrene er minimeret, således at maksimere den effektive dosis.
4. Position blyskærm (s) (fig. 1) mellem dyr og katoden tUbe som ønsket. Skærmene skal være 4,5 til 6 mm tyk, så for 97 til 99% dæmpning af en 325kV røntgenstråle ^11.
5. Levere røntgen dosis. Hvis fuldstændig stamcelle ablation fra ikke-afskærmede områder ønskes, afgiver 30 Gy eller derover under anvendelse af en X-ray strålerøret. For reference, er 30 Gy svarer til 3,6 minutter ved 320 kilovolt og 10 milliampere i en Precision X-Ray Inc. XRAD320 med et felt-til-kilde afstand af 30 centimeter.
6. Umiddelbart efter dosering er færdig, håndtering orme med sorte filtrerpapiret, overførsel dyr i afkølet planarian vand. Tillader planarian vand til at opvarme til stuetemperatur, og dyrene at frigøre sig fra den sorte filtrerpapir. Den delvise bestråling Proceduren er nu færdig.

5. Vævstransplantation

1. Ved hjælp af overførsel pipette og pincet arrangere bedøvet vært og donor orme på separate rektangler af sort filtrerpapir på Kimwipe som er blevet afkølet på Peltiis eller køligere plade under dissektionsmikroskop.
2. Ved anvendelse af en 0,75 mm indre diameter kapillarrør udskåret transplantatet proppen fra donoren, og med pincet, placerer den på en ud af vejen del af værten. Hvis implantatet materiale sætter sig fast i kapillarrøret, løsnes med pincet.
3. Ved anvendelse af en 0,7 mm ydre diameter kapillarrør fjerne en prop fra værten og anvende pincet position transplantatet i hullet, der bliver tilbage.
4. Overfør transplanterede vært på sin sorte filterpapir rektangel i petriskålen forberedt i trin 2,7.
5. Wet et stykke rullende papir med kasein mættet Holtfreter løsning og placere den på toppen af det transplanterede værten som afbildet i figur 2A.
6. Suge fire stykker filterpapir i casein mættet Holtfreter-opløsning, og omslutter det transplanterede værten som afbildet i figur 2B.
7. Soak fire totter af cut Kimwipe i kasein mættet Holtfreter løsning og lægge dem overfilterpapiret fra trin 5.6 (fig. 2B). Sæt låget og sætte petriskålen på is.
8. Overfør donor ormen i planarian vand at komme sig, helbrede og regenerere.
9. Når alle transplantater er udført, placeres de transplanterede orme i et 10 ° C inkubator natten over.
10. Den følgende morgen, pas på ikke at forstyrre transplantatet, afdække ormen og overføre det (på sin sorte filter papir) til en petriskål fyldt med planaria vand.
11. Enten giver ormen til at løsne sig fra filtrerpapir eller forsigtigt fjerne det med en pincet.
12. Ændre planarian vand en gang hver 2-3 dage.

6. Repræsentative resultater

Umiddelbart efter partiel bestråling planaria vises normal og upåvirket. Afhængig af den leverede dosis og geometrien af den anvendte skjoldet kan bestrålede væv regression og endog nedbrydes ^7. Skærmet væv skal forblive intakt. Follgrund væv regression og et tab af vævsintegritet, vil en blastema danne og manglende strukturer vil blive regenereret (figur 3A). Hvis en amputation der i den delvist bestrålede område, vil det bestrålede væv reddes (dvs. forhindres regression eller desintegrerende) (figur 3B). I både skadede og den amputerede tilfældet regenerering vil blive forsinket i forhold til en amputeret ikke-bestrålet planaria (figur 3C). Hvis en X-ray dosis på 30 Gy blev leveret og delvist bestrålede dyr var ubeskadiget, vellykket stamcelle ablation i et mønster svarende til det ledende anvendte skjoldet kan bekræftes 2 til 3 dage efter delvis bestråling ved in situ-hybridisering for stamceller markør Smed-piwi-1 ¹² (alias smedwi-1) (figur 4).

Om morgenen efter transplantation, en vellykket podning af det transplanterede væv bør være indlysende within værtsvævet, som har klæbet til både dorsale og ventrale overflader værten (figur 5A). Lejlighedsvis vil transplantatet klæbe til kun den ventrale eller dorsale overflade. Hvis transplantation var fuldstændig tabt, vil ingen tegn på transplantatet være synlig fra enten den dorsale eller ventrale overflade af værten (figur 5B). Kort efter en vellykket transplantat af ikke-bestrålede væv til en vært, der var blevet ablateres af stamceller ved letal bestråling ^13,14, in situ hybridisering for Smed-piwi-1 vil afsløre, at stamcellerne er til stede primært i transplantatet (figur 5C ). Derudover vil vellykkede transplantater af ikke-bestrålede væv i letalt bestrålede værter resultere i redning af værtsvæv og langsigtet overlevelse af værten ^15.

Figur 1. Generel indretning af grundlæggende komponents delvis bestråling. I en røntgenundersøgelse strålerøret med en top placeret røntgenkilde (katoderør) i bedøvede planarian er placeret direkte under røntgenkilden inden bestrålingen området. For at maksimere røntgen-dosering, bør afstanden mellem planarian og røntgenkilden minimeres. En blyskærm skal placeres mellem katoden røret og bedøvet orm, så tæt på sneglen som praktisk muligt. Den ledende skjold skal være designet, produceret og placeret således, at det beskytter den ønskede væv, men helt udsætter resten af ​​ormen. Mange kommercielle producenter vil producere brugerdefinerede bly skjolde fra din enkle design diagrammet, vi har med succes brugt Alpha Systems Corp (Bluffdale, UT). Den ledende bør være tilstrækkeligt tykt til at tillade den ønskede mængde af afskærmningen. For eksempel, hvis næsten fuldstændig afskærmning af en 320 kV røntgenstråle ønskes, bør den ledende være 4,5 til 6 mm tyk. Den planarian og skjold er placeret påen Holtfreter har gennemblødt filterpapir foret petriskål, der hviler i en isspand. Givet en tilstrækkelig stor X-ray bestråling felt og en række af identiske bly skjolde, kan mange prøver delvis bestråles på én gang (ikke afbilledet).

Figur 2. Bygge genvinding kammeret. (A) en eksploderet afbildning af vævstransplantation genvinding kammer, viser alle de komponenter, der er lagt oven på hinanden efter at være gennemvædet i casein mættet Holtfreter opløsning. (B) En næsten færdig opsving kammer, illustrerer sikringsanlæg placeringen af ​​Whatman # 3 filterpapir rektangler som tæt indramme bedøvet planarian. Forhindrer bevægelse under healing Den omhyggelige opbygning af opsvinget kammeret forhindrer dyrs bevægelser og udtørring, fremmer hurtig heling og større effekt af vævstransplantation.

Figur 3. Repræsentative resultater af simple posterior delvis bestråling. Som Dubois beskrevet ^7, (A), når den bageste halvdel af planarier blev skærmet med bly og derefter udsat for x-ray bestråling forreste vævet blev observeret at relatere tilbage til grænsen mellem det bestrålede og skærmede væv, på hvilket tidspunkt upigmenterede blastemas dannet, og dyrene begyndte at regenerere. (B) På den anden side. Når dyrene blev dekapiteret følge den samme partielle bestråling udføres i (A), blev vævet regression ikke observeret, og den resterende bestrålede forreste væv blev reddet Den halshuggede delvist bestrålede dyr regenererede hoveder (B), blev dog regenerering betydeligt forsinket i forhold til ubestrålede afhuggede kontroller (C).

Figur 4. Repræsentant outcomig delvis stamcelle ablation efter delvis bestråling. Whole-mount in situ hybridisering (WISH) for stamcelle markør Smed-piwi-1 afslører, at vildtype planaria har stamceller fordelt i hele deres kroppe med undtagelse af væv foran den fotoreceptorer (pilespids) og svælget korrekte (asterisk) ^14. (A) ønsker for Smed-piwi-1 bestrålet, men fuldt beskyttet kontrol planaria fastgjort tre dage efter bestråling viser en stamcelle fordeling, som kan skelnes fra den for vildtype planaria. (B) På den anden side vil for Smed-piwi-1 i dyr, der kun er delvist afskærmet, så den forreste og bageste eksponeret, men blev også rettet tre dage efter bestråling viser, at stamceller ablateres fra de ikke-afskærmede områder . Målestoksforhold er 500 mikrometer.

Figur 5. Examples af vellykkede og mislykkede vævstransplantation. (A) Live billeder af dorsale og ventrale udsigt til en vellykket transplantation planarian tre dage efter transplantation. Transplantatet (angivet) er klart synlig på både dorsale og ventrale overflader og er omgivet med karakteristiske upigmenteret væv ved graft-host-grænsefladen. (B) Tilsvarende mislykkede transplantationer viser ingen synlig transplantat væv ved transplantation sted (vist) og i stedet viser en helede, upigmenteret, lateral sår fra den mislykkede transplantation. En graft, der klæber til kun den dorsale eller den ventrale overflade kan ligne en succesfuld transplantation (A) når den ses fra den ene side og en mislykket transplantation (B) når den ses fra den anden. (C) når vildtype (wt) væv er podet ind i en bestrålet vært, der er blevet ablateres af residente stamceller og de ​​transplanterede stamceller senere afslørede efter ønske for Smed-piwi-1 to dage efter transplantation,succes transplantationen er tydeligt af den specifikke tilstedeværelsen af ​​stamceller kun i eller omkring implantatet placering (pilespidser). Målestoksforhold er 500 mikrometer.

Discussion

Vigtigheden af ​​immobilisering

Immobilisering er langt den mest kritiske skridt for en vellykket gennemførelse af nogen af ​​disse processer. Hvis planaria ukorrekt immobiliseres forud for delvis bestråling, kan de bevæge sig under blyafskærmning, der producerer usammenhængende og confounding resultater. Desuden, hvis dyrene utilstrækkeligt immobiliseret efter transplantation, vil værtens ormen sandsynlige bevæge sig bort fra transplantatet væv, hvilket resulterer i en fejl i implantatet til hele ordentligt til værten. Passende immobilisering opnås ved at justere koncentrationen eller længden af ​​chloretone behandling og temperaturen og fugtigheden af ​​filterpapir, som planaria resten. Chloretone behandlinger ved 0,2 procent af op til en halv time synes ikke at være toksisk, men kan behandlinger af denne længde inducerer udstødning af pharynx. Planaria forbliver stille og egnet til delvis bestråling under dette tidsrum. Vores erfaring har vist, atfugt, snarere end chloretone behandling, er den mest afgørende faktor - for vådt, og dyrene bevæger sig let, for tørt, og dyrene vil udtørre. I alle tilfælde filtrerpapir bør helt mættet, men ikke til det punkt, for at skabe stående vand i beholderen eller på overfladen. Overskydende væske kan blive rystet fra petriskålen. Mængden af ​​væske, som anvendes til at mætte filterpapiret vil uden tvivl skal justeres i henhold til den specifikke omgivelsernes fugtighed.

Hastighed transplantation

Hastighed er nødvendigt at øge effekten af ​​både delvis bestråling og transplantation. De længere delvist bestrålede dyr immobiliseres jo større er chancen for en skade eller underkroppræsentation i vævsintegritet som kan forvrænge resultaterne af et bestemt assay. Den hastighed, hvormed transplantationer er præfabrikerede groft korrelerer med den succesfulde graft sats. Hvis hullet i værten, som skal modtage transplantatet efterlades tomtfor længe, ​​vil den sårede ventrale og dorsale overflade begynder at helbrede med hinanden snarere end transplantatet vævet, hvilket resulterer i en mislykket transplantation. I vore hænder, kun lejlighedsvis transplantatet stikket bliver indgivet i kapillarrøret. I de tilfælde, kan proppen normalt løsne sig hurtigt med fine tænger eller ved at tvinge luft gennem kapillarrøret med munden. Når man bliver praktiseret med transplantation procedure, den nødvendige tid til at producere mange podede dyr kan reduceres betydeligt ved at bedøve den næste donor-vært par, mens podning den foregående par. Ved at udføre bedøvelse og transplantation samtidig, kan den faktiske tid, der kræves til at fremstille hver podet dyr falde til så lidt som fem minutter.

Den alsidighed af delvis bestråling og transplantation

Når betingelserne for bedøvelse og delvis bestråling er optimeret til den specifikke eksperimentelle environment og den tilgængelige røntgen-strålerøret, antallet af forskellige eksperimenter, der kan udføres under anvendelse af den delvise bestråling teknikken bliver stor. Avancerede bly bearbejdning teknikker gør det muligt for produktionen af ​​ikke blot indviklede bestråling skjolde, der kan målrette specifikke organer og væv, men også fremstilling af et stort antal identiske skjolde, tillader en hurtig oprettelse af mange biologiske gentagelser. Fremtidige undersøgelser vil uden tvivl drage fordel af denne metode til at teste in vivo cellulære reaktioner på lokal stamcelle-ablation og de ​​funktionelle forskelle mellem stamceller populationer til stede i forskellige dele af planarian. Den alsidighed delvise bestråling, som den vedrører den videnskabelige spørgsmål af interesse, er kun begrænset af de nuværende bly bearbejdning teknikker og ens fantasi. Derfor kan den sande kraft af den partielle bestråling teknik ligger i evnen til præcist afskærme og ablatere næsten anderledes placeretsubpopulationer af stamceller.

Henviser transplantation også mulighed for isolering af en subpopulation af stamceller, desto større fordel ved denne teknik er evnen til differentielt at behandle værten eller donoren før transplantation. Behandling af værten eller donor med et lægemiddel eller RNA interferens, vil give mulighed for undersøgelse af, hvordan ubehandlede transplanterede celler opfører sig på en behandlet miljø eller hvor behandlede celler opfører sig en ubehandlet miljø. Disse typer af eksperimenter vil helt sikkert hjælpe til at drille hinanden de autonome og ikke-autonome molekylære bidrag til at dæmme op cellefunktion.

Derudover, som klassiske podning eksperimenter i planaria allerede har vist ^5,6, vævstransplantation er en ideel teknik til at udforske den induktive potentialet af forskellige væv under regenerering. Som planarian forskning kommer ind i molekylær alder, har vi begyndt at afdække meget specifik lokaliseret ekspression af important signalmolekyler, som direkte styrer regenerering ^16. Transplantation af væv, der indeholder disse signalmolekyler til ektopiske steder under regenerering kan hjælpe os til bedre at forstå deres rolle i at lede morfogenese af regenererende strukturer.

Fordele ved partiel bestråling og vævstransplantation i forhold til andre teknikker

Udover de iboende specifikke styrker den delvise bestråling og vævstransplantation har i forhold til hinanden, har de også tilvejebringer særlige fordele i forhold til andre teknikker, der anvendes i planarian regenerering felt. For eksempel har lav dosis bestråling blevet anvendt som en måde at isolere et lille antal af stamceller i en ellers stamcelle blottet vært ^4,17, men fordi vi ikke ved, hvordan subletal bestråling påvirker planarian stamceller, kan vi ikke være sikre at de cellulære adfærd observeret i disse eksperimenter er karakteristisk normal.Denne advarsel af lav dosis bestråling er mindre bekymrende delvis bestråling, fordi stråling kan være let dæmpes mere end 99 procent med bly i den rette tykkelse. Endvidere transplantation helt undgår dette forbehold, fordi en lille population af stamceller kan isoleres i en stamcelle blottet vært uden nogensinde at udsætte de transplanterede celler over for stråling. Endvidere kan den nøjagtige position af de raske stamceller kendt og kontrolleret i både delvis bestråling og transplantation, hvorimod celler, der overlever en lav dosis bestråling er anbragt tilfældigt i hele dyret. Endelig henviser enkelt celle transplantation elegant har vist det store potentiale af en enkelt planarian stamcelle ⁴ kan vævstransplantation vise en lige så kraftig teknik, fordi den er hurtigere, mindre trættende og funktion og opførslen af en række celler kan observeres samtidigt i hver vært. Analysen af ​​en lille population af cellerversus en enkelt celle, ikke blot tillader mere effektiv indsamling af data, men det kan også afsløre celle-celle interaktioner, der ville blive opdaget i en enkelt celle transplantation assay.

Konklusion

Delvis bestråling og vævstransplantation, skønt gamle teknikker, vil spille en vigtig rolle i dissekere de funktioner planarian stamceller såvel som generelle molekylære mekanismer, der ligger regenerering. Modernisering af disse klassiske teknikker, der er bragt højere gennemløb og større ensartethed, mens der tillader integration af moderne funktionelle assays og molekylære teknikker. Disse klassiske teknikker, der engang blev brugt til at skitsere de store spørgsmål planarian regenerering kan nu bruges til at finde svarene på disse spørgsmål, og derfor er yderligere vores forståelse af stamceller biologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Purpose Transfer Pipette	Samco	691
Capillary tubes (ID 0.75 mm)	FHC	30-30-0
Capillary tubes (OD 0.7 mm)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
Black filter paper	Schleicher Schuell	10310809
Whatman #2 filter paper 1002-055	Fisher Scientific	09-810B
Whatman #3 filter paper 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
Cigarette rolling paper	Zig-Zag, original	NA
Petri dishes	VWR	82050-544
Forceps DUMONT, INOX #5	FST	11251-20
Chloretone	Sigma Aldrich	112054
Casein	Sigma Aldrich	C3400
Lead Shields	Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT	Custom design
XRAD-320 Biological Irradiator	Precision X-Ray, North Branford, CT	NA