Summary
Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d'immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l'irradiation partielle d'animaux vivants.
Abstract
La planaire, un ver plat d'eau douce, s'est révélée être un puissant système pour disséquer la régénération des métazoaires et 1,2 biologie des cellules souches. La régénération des tissus planaire de toute manquants ou endommagés est rendu possible par les cellules souches adultes appelé néoblastes 3. Bien que ces cellules souches ont été définitivement démontré d'être pluripotentes et singulièrement capable de reconstituer un animal entier 4, l'hétérogénéité au sein de la population de cellules souches et de la dynamique de leurs comportements cellulaires restent largement non résolues. En raison du grand nombre et une large diffusion des cellules souches dans le plan du corps planaire, des méthodes avancées de manipulation de sous-populations de cellules souches pour l'étude moléculaire et fonctionnelle in vivo sont nécessaires.
La transplantation de tissus et de l'irradiation partielle sont deux méthodes par lesquelles une sous-population de cellules souches planaires peuvent être isolés pour une étude plus approfondie. Chaque technique présente des avantages distincts. Tla transplantation question permet de l'introduction de cellules souches, dans un hôte naïf, qui sont soit intrinsèquement génétiquement distincte ou qui ont été préalablement traités pharmacologiquement. En variante, l'irradiation partielle permet l'isolement de cellules souches dans un hôte, juxtaposés à un tissu dépourvu de cellules souches, sans l'introduction d'une plaie ou d'une culasse en intégrité des tissus. L'utilisation de ces deux méthodes, on peut étudier les facteurs cellulaires autonomes et non autonomes que les fonctions de contrôle sur les cellules souches, comme la prolifération, la différenciation et la migration.
Les deux tissus de transplantation 5,6 et partielle d'irradiation 7 ont été utilisés historiquement dans la définition de la plupart des questions au sujet de la régénération planaire qui restent à l'étude aujourd'hui. Cependant, ces techniques sont restés sous-utilisés en raison de la nature laborieuse et incohérente des méthodes précédentes. Les protocoles présentés ici représentent un grand pas en avant dans la réduction du temps unee les efforts nécessaires pour générer de manière reproductible un grand nombre d'animaux greffés ou partiellement irradié avec des efficacités de près de 100 pour cent. Nous couvrons la culture des grands animaux, l'immobilisation, la préparation pour l'irradiation partielle, la transplantation de tissus, et l'optimisation de la récupération des animaux. En outre, le travail décrit ici démontre la première application de la méthode par irradiation partielle pour une utilisation avec la planaire le plus largement étudié, Schmidtea mediterranea. En outre, le tissu efficace de greffage dans planaria ouvre la porte pour le test fonctionnel des sous-populations de cellules souches naïfs ou traités dans des essais de repeuplement, qui a longtemps été la méthode étalon-or de dosage adulte potentiel des cellules souches chez les mammifères 8. Une large adoption de ces techniques sera sans aucun doute à une meilleure compréhension des comportements cellulaires de cellules souches adultes au cours de l'homéostasie tissulaire et la régénération.
Protocol
Remarque: ce protocole suggère l'utilisation de matières potentiellement dangereuses (plomb et chloretone). Acquérir, lire et suivre les fiches signalétiques pour tous les matériaux potentiellement dangereux.
1. Culture animale, de sélection et de préparation
- Pour la culture des animaux et de l'eau planaire manipulation utilisation (1X sels Montjuïc 9) et pipettes de transfert en plastique.
- Sexuelle biotype Schmidtea mediterranea peut être utilisée lorsque soulevée dans le laboratoire dans des conditions normales de culture 10. Pour produire des spécimens asexuées de taille requise, S. mediterranea soulevé à la température ambiante dans des conditions normales 9 devrait être alimenté au double au triple fréquence normale (2-3 fois par semaine) pour un à deux mois avant de les utiliser. Alternativement, les animaux nourris asexuées à une fréquence normale peut être maintenue à 10 degrés Celsius indéfiniment afin d'augmenter leur taille moyenne.
- Sélectionnez les animaux qui sont entre 1 à 2 cm delongueur et plus large que 2 mm, puis mourir de faim les animaux 3-7 jours avant de les utiliser.
- Si vous effectuez des traitements pharmacologiques ou radiologique sur les hôtes, les donateurs, destinés ou des animaux partiellement irradiés, effectuer un traitement (s) à ce stade.
- Si les traitements pharmacologiques ont été réalisées que nécessaire pour nourrir les animaux, mourir de faim les animaux environ 3 à 7 jours supplémentaires avant de les utiliser.
2. Préparation des solutions et des matériaux
- Préparer la solution de chloretone, une légère anesthésique local, en dissolvant 0,1-0,2% p / v chloretone dans l'eau planaire et le refroidissement de la solution sur la glace.
- Si vous effectuez une irradiation partielle seulement, passez à l'étape 2.7. Pour la greffe de tissus passez à l'étape 2.3.
- Utilisation d'un bec Bunsen, pliez 0,75 mm de diamètre intérieur, utilisé pour couper le tissu greffé, et 0,7 mm de diamètre extérieur, utilisé pour créer un trou dans l'hôte, qui recevra le greffon, tubes capillaires à un angle de 90 ° à 1-2 cm de la fin de bistube de ch. Pour économiser des matières, plier les deux extrémités de chaque tube capillaire et les couper en deux pour produire deux outils. Veillez à ne pas flamber les confins des tubes.
- Couper les documents suivants aux dimensions indiquées:
- Noir filtre en papier (coupé en rectangles d'environ 2,5 cm. X 1,5 cm)
- Whatman n ° 3 papier filtre (coupé en rectangles d'environ 2 cm. X 0,5 cm)
- Kimwipe (plié et découpé en liasses environ. 3 cm x 0,5 cm x 4 plis)
- Papier à rouler les cigarettes (retirer la bande de gomme et les couper en rectangles d'environ 3 cm. X 2 cm)
- Préparer une solution modifiée Holtfreter de (3,5 g / L de NaCl, 0,2 g / L de NaHCO 3, 0,05 g / L de KCl, 0,2 g / L MgSO 4, 0,1 g / L CaCl 2, pH 7,0-7,5) et de la caséine une solution saturée de Holtfreter et froid à la fois à 4 ° C.
- Joindre une Kimwipe plié à un carré de parafilm et placer sur la plaque refroidisseur Peltier ou autre dispositif de refroidissement situé sous un microscope à dissection. Saturer le Kimwipe avec Holtf réfrigérésreter la solution et le lieu noir deux rectangles de papier filtre sur la Kimwipe.
- Ligne des boîtes de Pétri avec Whatman n ° 2 du papier filtre. Humidifier le papier filtre avec une solution Holtfreter et refroidir les plats sur la glace. Pour l'irradiation partielle une parabole plus grande et de la doublure de papier filtre peut être utilisé.
3. Anesthésie et d'immobilisation
- Remplissez une boîte de Pétri avec une solution chloretone réfrigérés et les vers de la pipette dans le plat. Pour la transplantation que anesthésier un hôte et un donneur à la fois. Pour l'irradiation partielle de nombreux (n> 10) les animaux peuvent être anesthésié à la fois.
- Laissez les vers à tremper dans la solution chloretone jusqu'à ce qu'ils deviennent immobiles (5-10 min).
- Rincer les vers en les pipettant dans un plat rempli d'une solution Holtfreter réfrigérés de.
- Immobiliser les animaux en les pipetage sur du papier filtre noir saturé avec une solution Holtfreter réfrigérés et les orienter face ventrale vers le bas avec une pince. Si les animaux sont capables de locomote, imprégnez-vous une solution Holtfreter excès, légèrement diminuer la température de votre Peltier ou assiette froide, ou d'augmenter la durée du traitement chloretone.
4. L'irradiation partielle
Remarque: Suivez ces étapes pour préparer les animaux pour l'irradiation partielle. Si vous effectuez la transplantation au lieu, passez à la section 5.
- Placez un plat réfrigéré Petri de l'étape 2.7 sur la glace dans un seau à glace qui s'adapte à l'intérieur d'une source de rayons X supérieure irradiateur.
- Disposer les animaux anesthésiés dans une boîte de Pétri en déplaçant le papier filtre noir sur lequel ils sont immobilisés. En utilisant des pinces à se déplacer vers anesthésiés directement peuvent les blesser.
- Le transport d'animaux agencée à un haut-source de rayons X et irradiateur situés le bac à glace de telle sorte que la distance entre le tube à cathode à des animaux est minimisée, afin de maximiser le débit de dose efficace.
- Plomb position de l'écran (s) (figure 1) entre les animaux et la cathode tube comme vous le souhaitez. Boucliers doit être de 4,5 à 6 mm d'épaisseur pour permettre une atténuation de 97 à 99% d'un 325kV faisceau de rayons X 11.
- Délivrer la dose de rayons X. Si complète d'ablation de cellules souches de non-blindés régions est désiré, livrer 30 Gy ou plus en utilisant un irradiateur de rayons X. Pour référence, 30 Gy équivaut à 3,6 minutes à 320 kilovolts et 10 milliampères dans une précision X-Ray Inc XRAD320 avec une distance du champ à la source de 30 centimètres.
- Immédiatement après l'administration est complet, la manipulation des vers par le papier filtre noir, les animaux de transfert dans l'eau glacée planaire. Laisser l'eau planaire se réchauffer à température ambiante et les animaux à se déloger du papier filtre noir. La procédure d'irradiation partielle est maintenant terminée.
5. La transplantation de tissus
- En utilisant une pipette de transfert et de forceps, organiser hôte anesthésié et les vers des donateurs sur les rectangles de papier séparées filtre noir sur le Kimwipe qui a été refroidi sur le Peltiplaque er ou refroidisseur sous la loupe binoculaire.
- L'utilisation d'un tube de 0,75 mm de diamètre interne du capillaire découper la fiche du greffon du donneur et, en utilisant une pince, placez-le sur une sur la partie moyen de l'hôte. Si un matériau de greffe se coince dans le tube capillaire, de déloger avec des pinces.
- L'utilisation d'un tube de 0,7 mm de diamètre extérieur capillaire retirer une fiche de l'hôte et l'utilisation de la position des pinces du greffon dans le trou qui est laissé derrière.
- Transfert de l'hôte transplanté sur son rectangle de papier noir filtre dans la boîte de Pétri préparée à l'étape 2.7.
- Mouillez un morceau de papier à rouler avec une solution saturée de caséine Holtfreter et placez-le sur le dessus de l'hôte transplanté comme schématisé à la figure 2A.
- Faire tremper quatre morceaux de papier filtre dans la caséine solution saturée Holtfreter et envelopper l'hôte transplanté comme schématisé dans la figure 2B.
- Faire tremper quatre liasses de Kimwipe coupe dans la caséine solution saturée Holtfreter et les étendre surle papier filtre provenant de l'étape 5.6 (figure 2B). Replacez le couvercle et mettre la boîte de Pétri sur la glace.
- Transfert le ver planaire des bailleurs de fonds dans l'eau pour récupérer, guérir et se régénérer.
- Lorsque toutes les greffes sont terminées, placez les vers transplantés dans un incubateur à 10 ° C pendant la nuit.
- Le lendemain matin, en prenant soin de ne pas perturber la greffe, de découvrir le ver et le transférer (sur son papier filtre noir) à une boîte de Pétri remplie d'eau planaire.
- Soit permettre au ver de se dégager du papier filtre ou retirez-le délicatement avec une pince.
- Changez l'eau une fois tous les planaire 2-3 jours.
6. Les résultats représentatifs
Immédiatement après l'irradiation partielle planaire apparaît normale et naturelle. En fonction de la dose délivrée et la géométrie du bouclier utilisé, tissu irradié peut régresser et même désintégrer 7. Tissus blindé doit rester intacte. Follla régression du tissu en raison, et une perte de l'intégrité des tissus, un blastème se former et les structures manquantes seront régénérés (figure 3A). Si une amputation est faite dans la région partiellement irradié, le tissu irradié sera sauvé (c.-à-empêché de régression ou de désagrégation) (figure 3B). Dans les deux indemne et la régénération cas amputée sera retardée par rapport à une amputation non-irradié planaria (figure 3C). Si une dose de rayons X de 30 Gy a été délivrée et l'animal partiellement irradié n'a pas été blessé, l'ablation réussie de cellules souches dans un motif correspondant avec le bouclier de plomb utilisé peut être confirmée de 2 à 3 jours après l'irradiation partielle par hybridation in situ pour la cellule souche marqueur Smed-piwi-1 12 (aka smedwi-1) (figure 4).
Le matin, après une transplantation, une greffe réussie du tissu transplanté doit être évidentes wans le tissu de l'hôte, ayant adhéré à la fois les surfaces dorsale et ventrale de l'hôte (figure 5A). Parfois, la greffe se conformera à la seule surface ventrale ou dorsale. Si la transplantation a été un échec total, aucun signe de la greffe sera visible à partir soit de la surface dorsale ou ventrale de l'hôte (figure 5B). Peu de temps après une greffe réussie de tissu non irradié dans un hôte qui avait été une ablation des cellules souches par une irradiation létale 13,14, hybridation in situ pour Smed-piwi-1 révèle que les cellules souches sont présentes essentiellement dans le greffon (figure 5C ). En outre, greffes réussies de tissus non irradiés dans des hôtes irradiées de façon létale se traduira par le sauvetage des tissus de l'hôte et à long terme la survie de l'hôte 15.
Figure 1. Disposition générale de la composante de bases pour une irradiation partielle. Dans un irradiateur de rayons X avec une partie supérieure positionnée source de rayons X (tube cathodique) du planaire anesthésié est positionné directement au-dessous de la source de rayons X dans le champ d'irradiation. Afin de maximiser le débit de dose de rayons X, la distance entre le planaire et la source de rayons X doit être minimisée. Un blindage de plomb doit être placé entre le tube cathodique et le ver anesthésié, au plus près du ver comme pratique. Le blindage de plomb doit être conçu, fabriqué et placé de telle sorte qu'il protège le tissu désiré, mais expose complètement le reste du ver. De nombreux fabricants commerciale produira boucliers de plomb personnalisés à partir de votre schéma de conception simple, nous l'avons utilisé avec succès des systèmes Alpha Corp (Bluffdale, UT). Le fil doit être suffisamment épais pour permettre la quantité désirée de blindage. Par exemple, si près de blindage complet d'une 320 kV faisceau de rayons X est souhaité, le chef de file devrait être de 4,5 à 6 mm d'épaisseur. La planaire et le bouclier sont positionnés surtremper une Holtfreter de papier filtre bordée boîte de Pétri qui repose dans un seau à glace. Étant donné un champ d'irradiation suffisamment grand de rayons X et un certain nombre de boucliers de plomb identiques, de nombreux spécimens peuvent être partiellement irradié à un moment (non illustré).
Figure 2. Construction de la chambre de récupération. (A) Une vue éclatée de la chambre de récupération greffes de tissus, montrant tous les composants qui sont posés sur le dessus les uns des autres après avoir été trempé dans une solution saturée de la caséine du Holtfreter. (B) une chambre de récupération presque terminé, illustrant le placement de l'emboîtement Whatman n ° 3 rectangles de papier filtre qui enferment l'serré planaire anesthésié, pour empêcher tout mouvement lors de la cicatrisation. La construction minutieuse de la chambre de récupération empêche les mouvements des animaux et à la dessiccation, la promotion de la guérison rapide et une plus grande efficacité de la transplantation de tissus.
Figure 3. Résultats représentatifs de simples irradiation partielle postérieure. Comme Dubois décrits 7, (A) lorsque la moitié postérieure de planaires ont été protégés avec le plomb et ensuite exposée aux rayons X d'irradiation du tissu antérieure a été observée à régresser à la frontière entre le irradié et blindé tissus au cours de laquelle blastèmes points non pigmentées formé et les animaux ont commencé à se régénérer. (B) D'autre part, lorsque les animaux ont été décapités à la suite de l'irradiation partielle effectuée dans la même (A), la régression du tissu n'a pas été observée et le reste du tissu irradié antérieure a été sauvé. Le décapité animaux partiellement irradiés têtes régénérées (B), cependant, la régénération a été considérablement retardée par rapport à non irradiées contrôles décapités (C).
Figure 4. Représentant outcome de l'ablation partielle de cellules souches après irradiation partielle. Tout montage hybridation in situ (WISH) pour le marqueur de cellules souches Smed-piwi-1 révèle que la planaire de type sauvage ont des cellules souches distribuées tout au long de leur corps à l'exception du tissu antérieure à la photorécepteurs (tête de flèche) et le pharynx bon (astérisque) 14. (A) WISH pour Smed-piwi-1 dans le contrôle irradié, mais entièrement blindé planaria fixé trois jours qui suivent l'irradiation montre une distribution de cellules souches qui est indiscernable de celle des planaires de type sauvage. (B) D'autre part, souhaitent pour Smed-piwi-1 chez les animaux qui n'ont été que partiellement blindés, laissant le exposées antérieure et postérieure, mais ont également fixé les trois jours suivant montre l'irradiation que les cellules souches sont une ablation des régions non-blindés . Barres d'échelle sont de 500 microns.
Figure 5. Examples de la transplantation de tissus réussite et d'échec. (A) Les images en direct de vues dorsale et ventrale d'une planaire transplantés avec succès trois jours après la transplantation. Le greffon (indiqué) est clairement visible sur les deux faces dorsales et ventrales et est entouré de tissus non pigmentée caractéristique à l'interface du greffon hôte. (B) En conséquence, les transplantations infructueuses ne présentent pas de greffe de tissu visible sur le site de transplantation (indiqué) et de plutôt montrer une cicatrisées, non pigmentée, la plaie latérale de la transplantation a échoué. Une greffe qui adhère seulement à la dorsale ou la surface ventrale de ressembler à une transplantation réussie (A) lorsqu'elle est vue à partir d'un côté et une transplantation d'échec (B) lorsqu'elle est vue à partir de l'autre. (C) Lorsque de type sauvage (wt) de tissu est greffé dans un hôte irradié qui a été une ablation de cellules souches résidentes et les cellules souches transplantées sont révélé plus tard par la volonté de Smed-piwi-1 deux jours après la transplantation,le succès de la transplantation est clairement affiché par la présence spécifique des cellules souches que dans ou autour de l'emplacement du greffon (pointes de flèches). Barres d'échelle sont de 500 microns.
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Discussion
Importance de l'immobilisation
Immobilisation est de loin l'étape la plus critique pour la réussite de chacun de ces processus. Si planaria sont mal immobilisé avant l'irradiation partielle, ils peuvent se déplacer sous le blindage de plomb, produisant des résultats incohérents et la confusion. En outre, si les animaux ne sont pas suffisamment immobilisé après la transplantation, le ver hôte sera probablement s'éloigner de la greffe de tissu, résultant en un échec de la greffe pour guérir correctement à l'hôte. Immobilisation adéquate est obtenue en ajustant la concentration ou la durée du traitement chloretone et la température et l'humidité du papier filtre sur lequel le reste planaire. Traitements Chloretone à 0,2 pour cent jusqu'à une demi-heure ne semblent pas être toxique, cependant, des traitements de cette longueur peut induire d'éjection du pharynx. Planaria rester immobile et se prêtent à une irradiation partielle au cours de ce laps de temps. Notre expérience a montré quel'humidité, plutôt que le traitement chloretone, est le facteur le plus important - trop humide et les animaux se déplacent facilement, trop sec et les animaux se dessèche. Dans tous les cas un papier filtre doit être complètement saturé, mais pas au point de créer de l'eau stagnante dans le récipient ou sur la surface. L'excès de liquide peut être secoué de la boîte de Pétri. La quantité de liquide utilisé pour saturer le papier filtre sera sans aucun doute besoin d'être ajustée en fonction de l'humidité spécifique de l'environnement.
Vitesse de la transplantation
La vitesse est essentielle pour accroître l'efficacité de l'irradiation partielle à la fois et de la transplantation. Les animaux plus partiellement irradiés sont immobilisés plus les chances d'une blessure ou une brèche dans l'intégrité des tissus qui peut fausser les résultats d'un dosage particulier. La vitesse à laquelle les transplantations sont préformés correspond à peu près avec le taux de greffe réussie. Si le trou dans l'hôte qui consiste à recevoir la greffe est laissé vidependant trop longtemps, les surfaces ventrale et dorsale blessés vont commencer à guérir les uns aux autres plutôt que de la greffe de tissu, conduisant ainsi à une transplantation d'échec. Dans nos mains, la prise du greffon qu'occasionnellement se loge dans le tube capillaire. À ces occasions, la fiche peut normalement être délogés rapidement avec une pince fine ou en forçant l'air à travers le tube capillaire par la bouche. Une fois que l'on devient pratique avec la procédure de transplantation, le temps nécessaire pour produire de nombreux animaux greffés peuvent être considérablement réduits en anesthésiant le prochain hôte des bailleurs de fonds-paire tout en greffant la paire précédente. En effectuant l'anesthésie et de la transplantation en même temps, le temps réel nécessaire pour produire chaque animal greffé peut chuter à aussi peu que cinq minutes.
La polyvalence de l'irradiation partielle et de la transplantation
Une fois que les conditions de l'anesthésie et l'irradiation partielle sont optimisés en fonction de la l'environnement à l'expérimental spécifiquent et la mise à disposition de rayons X irradiateur, le nombre de tests différents qui peuvent être effectuée en utilisant la technique d'irradiation partielle devient grande. Des techniques avancées d'usinage de plomb permettent la production non seulement de boucliers d'irradiation complexes qui peuvent cibler des organes et de tissus spécifiques, mais aussi la fabrication d'un grand nombre de boucliers identiques, permettant la création rapide de la diversité biologique de répliques. Les recherches futures seront, sans aucun doute, de prendre avantage de cette méthode pour tester in vivo l'réponses cellulaires à l'ablation de cellules souches localisées et les différences fonctionnelles entre les populations de cellules souches présentes dans différentes parties de la planaire. La polyvalence de l'irradiation partielle, comme ce qui a trait à la question scientifique de l'intérêt, n'est limitée que par les techniques actuelles d'usinage de plomb et son imagination. Par conséquent, la véritable puissance de la technique d'irradiation partielle pourrait résider dans la capacité de protéger et de pratiquer l'ablation précise de près différemment positionnéssous-populations de cellules souches.
Considérant que la transplantation permet également à l'isolement d'une sous-population de cellules souches, l'avantage plus important de cette technique est la capacité à différentiellement traiter l'hôte ou des bailleurs de fonds avant la transplantation. Traitement de l'hôte ou des bailleurs de fonds avec un médicament ou l'interférence ARN, permettra à l'enquête de la façon dont non traités des cellules transplantées se comporter dans un environnement traité ou comment traité les cellules se comportent dans un environnement non traitée. Ces types d'expériences contribuera certainement à démêler les contributions autonomes et non autonomes moléculaires pour endiguer la fonction des cellules.
En outre, comme classiques des expériences de greffe chez la planaire ont déjà montré 5,6, greffes de tissus est une technique idéale pour explorer le potentiel d'induction de différents tissus lors de la régénération. Comme la recherche planaire entre dans l'ère moléculaire, nous avons commencé à découvrir très spécifique l'expression localisée de important molécules de signalisation qui contrôlent directement la régénération 16. Transplantation tissus qui contiennent ces molécules de signalisation aux sites extra-utérine pendant la régénération peut nous aider à mieux comprendre leur rôle dans la direction de la morphogenèse des structures de régénération.
Avantages de l'irradiation partielle et la transplantation de tissus rapport aux autres techniques
Outre les forces inhérentes spécifiques que l'irradiation partielle et la transplantation de tissus ont par rapport à l'autre, ils fournissent également des avantages particuliers sur d'autres techniques utilisées dans le domaine de la régénération planaire. Par exemple, l'irradiation à faible dose a été utilisée comme un moyen d'isoler un petit nombre de cellules souches au sein d'une cellule hôte par ailleurs dépourvue de tige 4,17, cependant, parce que nous ne savons pas comment l'irradiation sublétale affecte les cellules souches planaires, nous ne pouvons pas être sûr que les comportements cellulaires observées dans ces expériences sont typiquement normale.Cette mise en garde de l'irradiation à faible dose est moins un sujet de préoccupation dans l'irradiation partielle car l'exposition aux rayonnements peut être facilement atténuées plus de 99 pour cent de plomb de l'épaisseur désirée. En outre, la transplantation évite complètement cette mise en garde, car une petite population de cellules souches peuvent être isolées au sein d'un hôte sur les cellules souches dépourvues sans jamais exposer les cellules transplantées à des rayonnements. En outre, la position exacte des cellules souches saines peuvent être connus et maîtrisés dans les deux irradiation partielle et de la transplantation, tandis que les cellules survivantes irradiation à faible dose sont positionnés de manière aléatoire dans l'animal. Enfin, alors que la transplantation de cellules unique a élégamment démontré le fort potentiel d'une cellule souche planaire unique de 4, la transplantation de tissus peut s'avérer une technique aussi puissante parce qu'elle est plus rapide, moins fastidieux, et la fonction et le comportement d'un certain nombre de cellules peut être observée simultanément dans chaque hôte. L'analyse d'une petite population de cellulespar rapport à une cellule unique ne permet pas seulement pour la collecte plus efficace des données, mais il peut aussi révéler interactions cellule-cellule qui serait manquer à un essai de transplantation de cellules unique.
Conclusion
L'irradiation partielle et la transplantation de tissus, bien que les techniques anciennes, jouera un rôle important dans la dissection des fonctions des cellules souches planaires ainsi que les mécanismes moléculaires sous-jacents généraux de régénération. Modernisation de ces techniques classiques a apporté un débit plus élevé et une plus grande cohérence tout en permettant l'intégration de tests fonctionnels et modernes techniques moléculaires. Ces techniques classiques qui étaient autrefois utilisés pour décrire les grandes questions de la régénération planaire peut maintenant être utilisée pour découvrir les réponses à ces questions et donc d'approfondir notre connaissance de la biologie des cellules souches.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Chiyoko Kobayashi et Kiyokazu Agata pour obtenir des conseils utiles sur la transplantation planaire ainsi que les membres passés et présents du laboratoire Sánchez pour les discussions précieuses lors de l'élaboration de ces techniques. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant formation (5T32 HD0791) à BCG et les NIH R37GM057260 à l'AAS. ASA est un Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 | |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 | |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 | |
| Black filter paper | Schleicher Schuell | 10310809 | |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B | |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E | |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA | |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 | |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 | |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 | |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 | |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design | |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
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