Summary
白内障是导致失明的世界。太阳紫外线辐射（UVR）是白内障发展的主要危险因素。远紫外线B诱导白内障动物模型的开发。在这篇文章中，我们描述了白内障的形成进行调查：暴露于紫外线辐射，定量RT-PCR和免疫组化的方法。
Abstract
白内障是导致失明的世界1。世界卫生组织定义白内障混浊的眼睛，阻碍了光传输的镜头。白内障是一种多因素的疾病，与糖尿病，吸烟，紫外线辐射（UVR），酒精，电离辐射，类固醇和高血压有关。有强烈的实验2-4和流行病学证据5,6，紫外线辐射会导致白内障。我们开发了两种麻醉和非麻醉动物的紫外线B诱导白内障的动物模型。
唯一的治疗白内障的手术治疗，但这种治疗方法是无法访问的所有。据估计10年白内障的发病延迟可以减少白内障手术的需要的50％9。为了延缓白内障的发生率，它是需要了解白内障的形成机制和有效的预防地层几种学习策略。白内障发展的机制之一，细胞凋亡起着至关重要的作用在启动白内障在人类和动物的10。最近我们的重点是在镜头凋亡的机制白内障的发展8,11,12。据预测，更好地了解紫外线辐射的影响，对细胞凋亡通路的发现新的药物，以防止白内障的可能性。
在这篇文章中，我们将介绍如何白内障可以通过实验诱导体内暴露于UVR-B。进一步的RT-PCR和免疫组化被作为工具来研究UVR-B诱发白内障的分子机制。
Protocol
1。暴露于紫外线辐射
- 前15分钟的曝光，麻醉一个雌性Sprague-Dawley大鼠用90毫克/千克Ketalar（氯胺酮）和10毫克/公斤Rompun（甲苯噻嗪）通过腹膜内注射的混合物。
- 将动物在大鼠阻挡，并拧紧而不会造成一个中继线挤压13，直到固定大鼠的皮带。
- 灌输Mydriacyl（托），10毫克/毫升，在两只眼睛的大鼠诱导散瞳。
- 将动物，使一只眼睛被靠住一个狭窄的光束的紫外线辐射在300 nm 14与10nm的半最大值全宽和屏蔽对侧眼用黑胶带。
- 公开大鼠单方面亚阈值剂量的1千焦/米2 UVR-B在300 nm为15分钟，15。
2。解剖
- 预先确定的暴露后的时间间隔（1，5，24和120小时）后，牺牲的6周龄大鼠（重量<200克）的碳水化合物Ň二氧化碳窒息和颈椎脱位。
- 摘除细胞核的眼睛。此后，把眼睛角膜下，后侧。然后，冲头通过施加的27口径，插管和推切向巩膜，以避免损坏，这是非常接近的巩膜透镜，一个最小的孔。然后用一对眼科手术剪刀切圆周背后的后部巩膜缘，直到可以升空。然后，用钝头弯钳提起的镜头。
- 在显微镜下从透镜赤道移除残余的睫状体，保持透镜的平衡盐溶液中不再比5-10分钟。
3。定量RT-PCR
- 将镜头到350微升RA1裂解缓冲液（NucleoSpin RNA总RNA提取试剂盒II）和3.5μLβ-巯基乙醇2 ml Eppendorf管中的混合。
- 在此混合，在室温下的30分钟期间保持镜头。
- 均质的透镜与只有硬核的镜头的针，直到剩下从透镜（皮层和胶囊的镜头的裂解缓冲液中裂解）。从组合中移除的核心。
- 店内样品立即在-70°C。
- 解冻的样品，并按照协议“总RNA纯化培养的细胞和组织”（NucleoSpin RNA总RNA提取试剂盒II）。
- 专区RNA样品在-70℃下
- 要验证足够去除DNA，从每个样品中，运行一个PCR在以下条件下（第1步：95℃2分钟;步骤2中进行40个循环：95℃20秒，55℃下持续20秒，72° ℃20秒;步骤3：72℃，7分钟）与p53 DNA的特异性引物，正向5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3'和逆5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3'和Taq DNA的聚合酶（dNTPack）的，根据制造协议。预期的PCR产物为243个碱基对。
- 运行的1.5％琼脂糖凝胶电泳以检测DNA中的243个碱基对的特异性PCR产物。为了准备在TBE缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶3.75克琼脂糖，TBE缓冲液在250毫升的解决这个问题。加入溴化乙锭（0.5毫克/毫升）500微升在500毫升1.5％的琼脂糖凝胶溶液。加热该混合物，在一个微波欧文和搅拌解决琼脂糖。
样品没有发现任何DNA特异的PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳。
- RNA样品（1微升），测量的浓度中的NanoDrop ND-1000分光光度计在260 nm（RNA）和280 nm（蛋白质）的样品的吸光度的比例。如果RNA蛋白质的RNA样品的吸光度的比率是2.0或以上，则RNA样品是纯的。如果RNA样品的吸光度的比例低于2.0，重做RNA纯化步骤3.5。
- 以对应的1微克RNA样品的体积，并合成cDNA后，协议第一链cDNA合成试剂盒（ 第一链cDNA合成试剂盒用于RT-PCR）。
- 在-20°C贮存cDNA样本（周期为1以上，储存在-70℃下）。
- 运行实时定量PCR的iCycler MyiQ™实时单色实时PCR检测系统。的负载一式三份于96孔板与1μlcDNA样本，TaqMan基因表达的TaqMan母液，半胱天冬酶3的基因表达分析，根据生产指令。负载三份在另一96孔板中与1μlcDNA样品，TaqMan基因表达母液，TaqMan基因表达为18秒的测定，根据生产指令（TaqMan基因表达含量议定书）。在系列稀释cDNA的3个随机选择的非暴露镜头的一小部分。运行串行稀释液一起从样品中的96 - 孔板的cDNA。
- 使用标准曲线法进行定量的结果。的周期的数量在阈值荧光用作MyiQ™实时软件中的测量。在相对集中的校准功能的阈值的标准曲线表示的周期数是ES建立起来，在每块板中的系列稀释液。 cDNA的未经处理的镜片样品用于校准。对每个样品的周期相关的阈值数的标准曲线，得到样品的cDNA的测量的相对浓度。最后，得到的靶基因的表达水平，由有关的内部控制，18S基因的cDNA的目标相对集中。
4。免疫组化染色
- 固定术
- 解剖的眼睛在PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中。
- 将眼球的管中填充用4％的多聚甲醛（PFA）在冰冷的20分钟。准备PFA 4％的前一天。储存于4℃直至使用。 PFA是新鲜的大约一个星期。
- 微量移除PFA。然后，20分钟，用冰冷的PBS洗涤。
- 把的眼睛蔗糖的30％在4°C过夜。
- 把眼睛中充满了最佳切削温度（OCT）介质一杯（组织-TEK）。在一个合适的位置，切片放在眼。
- 干冰冻结OCT介质。
- 储存于-70℃直至使用。
- 切片
- 冰冻切片在适当的平面上放置的眼睛。
- 切三5μm厚的矢状面中的部分从每个透镜的中心部分。放弃至少6节之间连续的部分，以免弄脏相同的细胞核中不同的部分。
- 一旦部分已被切断，轻轻地放在一张幻灯片，在它的上面。本节应坚持的幻灯片。
- 离开幻灯片，空气干燥，使用前。幻灯片可以储存在-20℃，直到需要。
- 荧光免疫组化
- 让样品达到室温（5-10分钟）。
- 绘制一个PAP笔（Invitrogen公司）的标本与周围的边缘。
- 让边境干燥的一段时间（10分钟）。
- 标签的显微镜幻灯片。
- 补充水分，1×PBS 15分钟。
- 通透标准块溶液中30分钟。
- 加入一抗（兔多克隆抗体，切割的caspase-3抗体Asp175 9661;细胞信号技术公司）稀释1:3,000标准块的解决方案。
- 储存在湿盒在4°C过夜。
- 通过移液（3×5分钟），或通过浸渍在一个大的浴（> 15分钟，1-2的变化），在PBS中清洗。
- 添加在标准块溶液1:300稀释的第二抗体（抗兔第二抗体与一个特定的吸收/发射光谱）。
- 通过移液（3×5分钟），或通过浸渍在一个大的浴（> 15分钟，1-2的变化），在PBS中清洗。
- 擦拭掉PAP笔涂片。
- 存储在一个加湿室中在室温搅拌3小时。避免暴露在光线下。
- 添加一个的Vectashield下降，并在幻灯片上放置盖玻片。避免气泡。
- 让Vectashield变硬（〜20分钟）。
- 保持第In是黑暗的，直到分析。
- 所有的控制部的处理的情况下的初级抗体。
- 查找的结果，在荧光显微镜下在几个小时内。
- 计数上皮细胞的细胞核从一个侧面核弓对方核弓的每一个镜头。应用标准的蓝色滤色器看到所有镜头上皮细胞核在蓝色和一个标准的过滤器适合的二次抗体的发射绿色看到的caspase-3阳性细胞核。
- 记录全部晶状体上皮细胞核和阳性细胞核的数目的数目。计数细胞3次的每个部分。
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Representative Results
测量中的变化的各种来源，估计与方差分析，并发现，考虑三个测量每只动物的方差用于测量的时间是在15％的动物的顺序。因此，考虑到整个透镜分析，这是不可能的，以增加的精度。正交试验阐明了统计上显着的对比度，120小时之间延迟的时间间隔与较短的延迟时间间隔的caspase-3的消息。
在体内紫外线辐射暴露诱导的caspase-3的表达。
图1。暴露于紫外线辐射的流动的示意图。
图2。演变CASPASE-3（CASP3）mRNA表达的晶状体后在体内曝光1千焦/米2，紫外线辐射波长为300 nm。误差线为95％的置信区间为平均比的的CASP3 mRNA/18s rRNA基因之间暴露的镜头和对侧没有暴露的镜头。的装置的上方和下方的黑线，1相对。单元，分别表示向上和向下调节的CASP3基因。
图3，Caspase-3表达（A）中的露出的透镜，曝光24小时后，和（B）在一个未曝光的透镜。箭头显示标记的细胞。
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Discussion
本文介绍的方法，使学习在UVR-B引起的白内障发生的分子事件。
考虑，大多数信息可用于在体内的紫外线辐射性白内障是来自实验白化只SD大鼠7日，16日，17日，18日，19后，我们决定在目前的研究中使用的白化SD大鼠。年龄的影响是6周大的。的性别是女性，因为在对男性相比，女性较少有过敏尿。此外，有没有性别差异的严重程度的紫外线辐射性白内障20。
所有的动物都被保存和处理根据ARVO声明眼科和视觉研究中使用动物的。伦理许可获得的来自乌普萨拉动物实验伦理委员会，协议号C 29/10。大鼠从商业饲养员（Taconic公司，丹麦）得到。
帐篷“>甲窄带紫外线辐射源，以便选择要频谱定义良好的紫外线辐射。大鼠透镜到UVR-B的最大灵敏度大约是300纳米。1千焦耳/米2的剂量被选择为低于阈值的剂量15，15分钟的曝光时间被选择诱导的透镜21的最严重的损坏。暴露到UVR-B的剂量和后曝光时间可以有所不同，根据实验设计。成对器官的眼睛在动物研究中使用的统计和道德方面具有明显的优势。单侧曝光的眼睛能够使用一侧露出，因此，在一个动物的另一侧作为控制它减少了一半的动物数量未成对器官相比。
在这个协议中，我们使用了麻醉作为用于动物固定方法的。然而，其他的替代，大鼠阻挡器13，它在我们的实验室中，我们设计了可以用于固定unanaesthetized动物。 ŕ安非他明类兴奋剂有空调对大鼠限制器前的UV曝光。由于其副作用，麻醉时，不建议使用此装置可有效地控制重复风险。这里，我们使用大鼠作为麻醉动物的定位和保持装置，用于阻挡。
大鼠限制器是用木头做的，是在我们的实验室在几个项目。我们清理我们的束缚设备，在每个动物的位置上。木块，淌着和木材站作为富集的老鼠笼。这种富集批准乌普萨拉动物实验伦理委员会和联邦的欧洲实验动物科学协会（FELASA）。
在短的时间内（5-10分钟），该透镜具有在BSS被解剖。这个限制允许的镜头留下清晰和透明。
定量RT-PCR
保持镜头的RA1裂解缓冲液中的30分钟的时间是enough，破坏晶状体囊膜和皮质。晶状体核仍然难以在30分钟内。晶状体核，或细胞器 - 自由区域被认为是一种转录非活性部分的镜头。因此，从样品中除去细胞核，以增加mRNA的表达比的信号/噪声。
用于RNA的纯度（有无的DNA）控制的特定的DNA引物中任意选择的是p53的引物。可以选择任何普遍发生的经过编码的序列，特别是动物基因组DNA的。 PCR，每曝光后间隔为10只和每个镜头两款镜头进行了分析，在三个独立的测量，caspase-3的RNA含量的测定。
RT-PCR，mRNA的利益来衡量。转换的mRNA逆转录成互补的DNA，然后通过PCR扩增。使用通过放大连续稀释的样品的cDNA的int得到的标准曲线进行定量测量erest。应用标准曲线的优点是标准曲线提供了一种可靠的方法来计算的不确定性浓度的标准曲线的mRNA的利益提供了定量测量。可选地，感兴趣的mRNA的相对含量，可以通过直接比较所需要的周期，以获得一个标准化的荧光信号，的Ct法的数目估计。校准曲线的主要缺点是，它需要使用更多的基因组的Ct方法的产品比。
免疫组化染色
用免疫组化研究晶状体上皮细胞的活性caspase-3在空间分布。
的眼睛立刻被冻结到-70°C至停止所有正在进行的生物化学。的眼睛，然后将其存储在相同温度下保存。
免疫组化与两个一般亲张国才，陈浩，大学物理COLLEGE PHYSICS;初级抗体的特异性和非特异性结合的抗体。 ，应该获得一个很好的控制源，从而保证了特异性抗体。如果可能的话，应含有的抗原表位的组织染色，作为阳性对照。为了outrule非特异性染色，如果可能的话，应阻止的抗原表位，然后再与特定的抗体，阴性对照染色。此外，非特异性染色，可以最小化，通过建立的最优的抗体浓度和反应时间。通过两个组织暴露于紫外线辐射和未暴露于紫外线辐射的组织染色，它是可能的建立紫外线辐射诱导的表位，在这里的caspase-3。为了方便的点caspapse-3信号的细胞表达的荧光显微镜图像的数字记录。为了最大限度地减少背景噪声的变化，我们使用了固定的设置，所有的显微镜照片。
背景荧光信号的强度变化在一个共同ntinuous规模。因此，显著染色的阈值已被设置。然而，可能会发生变化的平均荧光观察使其难以显著染色使用绝对阈值的段内的空间。因此，通常的判断，具体的染色依赖于一个经验丰富的观察员和特殊染色结果的绝对依赖于经验丰富的观察员认为，但该观察员将是一致的。出于这个原因，使用了只有一个有经验的观察者。为了提高信号的实验变量，暴露于紫外线辐射引起的，作为噪声相比，每个部分的照片进行计数三次。
如果可能的话，免疫组织化学，应验证通过免疫印迹，从而确认与预期的分子大小的抗原决定基的存在。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的卡罗林斯卡研究所的KID资金，瑞典辐射保护局，卡罗林斯卡医学院眼科研究基金会，Konung古斯塔夫枪OCH贝蒂尔Stohnes Stiftelse，圣Erik的眼科医院研究基金会，Ögonfonden：秒OCH Drottning Viktorias Frimurarstiftelse。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 | |
|
|||
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
- Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
