Summary
白内障は世界の失明の主要な原因である。太陽紫外線（UVR）は白内障開発のための主要な危険因子である。遠くUVR-B誘発白内障の動物モデルが開発されました。 UVR、定量的RT-PCR法と免疫組織化学への暴露：この記事では、白内障の調査のための方法を説明します。
Abstract
白内障は、世界1の失明の主要な原因である。世界保健機関（WHO）は、光の伝達を妨げ、眼のレンズの混濁として白内障が定義されています。白内障は、糖尿病、喫煙、紫外線照射（UVR）、アルコール、電離放射線、ステロイドや高血圧に関連付けられている多因子疾患である。強い実験2-4および疫学的証拠は、UVR 5,6は白内障引き起こすことがあります。我々は麻酔7及び非麻酔動物8の両方でB UVR誘発白内障のための動物モデルを開発しました。
白内障のための唯一の治療法は手術ですが、この治療法はすべてにアクセスすることはできません。それは10年間の白内障の発症の遅延が50％9で白内障手術の必要性を減らすことができると推定されている。白内障の発症を遅延させるには、それは白内障形成のメカニズムを理解し、効果的な予防戦略を見つけるために必要とされるegies。白内障開発のためのメカニズムの中で、アポトーシスは、ヒトおよび動物10の白内障の開始に重要な役割を果たしている。我々の焦点は、最近白内障開発8,11,12するためのメカニズムとしてレンズのアポトーシスとなっています。これはアポトーシス経路上のUVRの効果の理解は白内障防ぐための新たな医薬品の発見の可能性を提供することが予想されます。
本稿では、実験的にUVR-Bへのin vivoでの暴露にによって誘導することができる方法白内障について説明します。さらにRT-PCR法と免疫組織化学は、UVR-B誘発白内障の分子メカニズムを研究するためのツールとして提示されます。
Protocol
1。紫外線照射
- 暴露前の15分には、腹腔内注射で90 mg / kgのKetalar（ケタミン）及び10 mg / kg Rompun（キシラジン）の混合物で雌Sprague-Dawleyラットを麻酔。
- ラットの拘束に動物を置き、トランクスクイズ13を発生させることなく、ラットの固定までベルトを締めます。
- 散瞳を誘導するために、ラットの両眼にMydriacyl（トロピカミド）、10 mg / mlのを植え付ける。
- 片目が半値全幅は10nmと300nmの14でUVRの狭いビームに対して位置決めされるように動物を置き、黒いテープで反対側の眼を遮蔽する。
- 15分15のための300 nmにおけるサブスレッショルド·用量1 KJ / m 2の UVR-Bに一方的にラットを公開します。
2。解剖
- 予め決められた露光後インターバル（1、5、24および120時間）の後、炭で6週齢のラット（体重<200グラム）を犠牲にするn個の二酸化窒息と頸椎脱臼。
- 摘出するの目。その後、後方側を、目の角膜を上にして置き。次に、強膜に非常に近いレンズの損傷を防ぐために、強膜に対して接線方向にパンチ27ゲージのカニューレを適用することにより、最小限の穴とプッシュ。その後、強膜の後部をオフに持ち上げることができるまで、ちょうど縁の後ろに周方向に切断するために眼科手術用はさみのペアを使用しています。その後、鈍湾曲したピンセットでレンズを持ち上げます。
- 5〜10分を超えない平衡塩溶液中でレンズを保持し、顕微鏡下でレンズ赤道から毛様体の残骸を削除。
3。定量的RT-PCR
- 350μlのRA1の溶解緩衝液（NucleoSpin RNA IIの全RNA単離キット）および2mlのエッペンドルフチューブに3.5μLのβ-メルカプトエタノールのミックスにレンズを置きます。
- 室温で30分間の間、このミックスでレンズを保管してください。
- レンズをホモジナイズレンズの唯一のハード核まで針がレンズ（皮質、レンズのカプセルが溶解バッファー中で溶解されている）から残っている。ミックスから核を取り除きます。
- ストアサンプル直ちに-70℃
- サンプルを解凍し、プロトコル "培養細胞や組織からの全RNA精製"（NucleoSpin RNA IIの全RNA単離キット）に従う。
- ストアRNAサンプル-70℃
- 2分間、95℃、40サイクルのステップ2：各試料からのDNAの十分な除去を確認するには、以下の条件（ステップ1でPCRを実行し95℃で20秒、55℃20秒、72℃ 20秒のC;ステップ3：7分72℃）、p53のDNA特異的プライマーを用いて、フォワード5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'と逆方向5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3'およびTaq DNAポリメラーゼ（dNTPack）、製造によるプロトコル。予想されたPCR産物は、243塩基対である。
- 243塩基対のDNA特異的なPCR産物を検出するために、1.5％アガロースゲル電気泳動を実行します。準備するにはTBE緩衝液中で1.5％アガロースゲルはアガロースの3.75グラムを取るとTBEバッファー250mlにそれを解決する。臭化エチジウム（0.5 mg / ml）を1.5％アガロースゲル溶液500mlで500μlを添加する。マイクロ波オーウェンに、混合物を加熱してアガロースを解決するためにかき混ぜる。
試料はいずれも1.5％アガロースゲル電気泳動上の任意のDNA特異的なPCR産物を明らかにするために持っていません。
- RNAサンプルの濃度（1μL）および260 nm（RNA）と光度計ND-1000分光光度計で280nmの（タンパク質）におけるサンプルの吸光度比を測定します。 RNAサンプルの吸光度のタンパク質に対する比のRNAが2.0以上である場合、RNAサンプルは純粋です。 RNAサンプルの吸光度比が2.0より低い場合は、RNA精製ステップ3.5をやり直してください。
- プロトコル第1ストランド cDNA合成キット（RT-PCRのための第1ストランド cDNA合成キット）に続く1μgに相当するRNAサンプルの音量を取ると、cDNAを合成。
- -20℃でcDNAサンプルを保存（期間1年以上とするため、-70℃で保存）。
- iCycler MyiQ単色リアルタイムPCR検出システムで、定量的リアルタイムPCRを実行します。負荷は、1μlのcDNA試料は、TaqMan遺伝子発現マスターミックス、カスパーゼ3のためのTaqMan遺伝子発現アッセイを96ウェルプレートに三連の指示を製造する方法。負荷は、1μlのcDNA試料は、TaqMan遺伝子発現マスターミックス、18sのためのTaqMan遺伝子発現アッセイを持つ別の96ウェルプレートにトリプリケート命令（のTaqMan遺伝子発現アッセイプロトコル）を製造する方法。直列3ランダムに選ばれた非露光レンズからのcDNAの一部を希釈します。 96ウェルプレート中のサンプルからのcDNAと共に希釈を実行します。
- 結果の定量化のための標準曲線法を使用します。しきい蛍光におけるサイクル数はMyiQソフトウェアの測定として使用されます。キャリブレータの相対濃度の関数としてしきい値でサイクル数を表現する標準曲線は、esです各プレートで連続希釈用tablished。 3非処理レンズ試料からのcDNAは、キャリブレーションのために使用された。測定されたcDNAサンプルの相対濃度を得るために標準曲線と各サンプルのサイクル数のしきい値を関連付けます。最後に、cDNAの内部統制18Sに対するcDNAターゲットの相対濃度を関連付けることにより、標的遺伝子の発現レベルを取得します。
4。免疫組織化学的染色
- 固定
- PBS中目（; pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水）を解剖する。
- 20分間氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）で満たされたチューブに目を入れた。前日に4％PFAを準備します。 4℃で保存し、使用時まで。 PFAは、約1週間新鮮です。
- マイクロピペットでPFAを削除します。その後、20分間氷冷PBSで洗浄する。
- ℃で一晩4でスクロース30％で目を入れた。
- （10月）最適切削温度で満たさカップに目を入れて、媒体（ティッシュ- Tek社）。セクショニングの適当な位置に目を置いた。
- ドライアイスの上に、OCT-培地中で凍結する。
- -70℃で保存し、使用時まで。
- セクショニング
- 適切な平面にクライオセクショニングの目の位置を決めます。
- 各レンズの中央部から35μm厚半ば矢状断面をカットします。異なるセクションの同じ核を染色避けるために順次セクションの間には、少なくとも6つのセクションを破棄します。
- セクションがカットされたら、そっとその上にスライドを配置します。セクションでは、スライドに固執する必要があります。
- 使用前に空気乾燥にスライドしたままにします。必要になるまでスライドを-20℃で保存することができます。
- 蛍光免疫組織化学
- サンプルは室温（5〜10分）を達成しましょう。
- PAP-ペン（Invitrogen）を用いて試験片の周りにエッジを描画する。
- しばらく（10分）の境界線に乾かします。
- 顕微鏡スライドラベルを付けます。
- 1に水分補給×Pを15分間のBS。
- 30分間の標準ブロック·ソリューションで透過処理。
- 標準ブロック·溶液中で1:3,000に希釈し、一次抗体（セルシグナリングテクノロジー株式会社ウサギポリクローナル、切断カスパーゼ-3抗体Asp175 9661）を追加します。
- 一晩4℃で加湿チャンバーに保管してください。
- （3×5分）、ピペッティングによりまたは大浴場（> 15分、1月2日変更）中に浸漬することにより、PBS中で洗浄します。
- 標準ブロック·溶液中で1:300に希釈した二次抗体（特定の吸収/発光スペクトルを持つ抗ウサギ二次抗体）を追加します。
- （3×5分）、ピペッティングによりまたは大浴場（> 15分、1月2日変更）中に浸漬することにより、PBS中で洗浄します。
- PAPペンスメアを拭き取ってください。
- 3時間室温で加湿チャンバー内で保管してください。光への曝露を避ける。
- Vectashieldのドロップを追加して、スライドにカバースリップを置く。泡を作ることは避けてください。
- Vectashield硬化（〜20分）をしましょう。
- セクションI保つ分析するまでダークをn。
- すべての制御セクションは、一次抗体の非存在下で処理されます。
- 蛍光顕微鏡下で数時間以内に結果を探してください。
- 片側核船首から各レンズの反対側の核弓に上皮細胞の核を数える。青のすべての水晶体上皮核と緑におけるカスパーゼ3陽性核を見て二次抗体の放出に適合する標準フィルタを表示するには、標準の青のフィルタを適用します。
- すべての水晶体上皮核および陽性核の数を記録します。セクションごとに細胞を三回を数える。
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Representative Results
測定値の変動のさまざまな源は分散分析を用いて推定された、それは動物ごとに3つの測定値を考慮すると測定のための分散は動物のそれの15％のオーダーであることがわかった。したがって、レンズ全体の分析を考慮すれば、精度を向上させることはできません。直交テストは120時間の待ち時間の間隔対短い待ち時間間隔のカスパーゼ-3メッセージの統計学的に有意なコントラストを明らかにした。
生体 UVR曝露におけるカスパーゼ3の発現を誘導する。
図1紫外線照射の流れの模式図。
図2の進化カスパーゼ300 nmで1 KJ / m 2である UVR曝露に対する生体内の後の水晶体の3（casp3）mRNA発現。エラーバーは、露出したレンズと反対側の露出していないレンズの間casp3 mRNA/18s rRNAの平均比の95％信頼区間である。手段、上下1 RELに黒いライン。ユニットは、それぞれのアップと表すcasp3遺伝子のダウンレギュレーション。
図3に露出レンズ、露光後および（B）の非露光レンズで24時間におけるカスパーゼ3の発現（A）。矢印は、標識された細胞を示しています。
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Discussion
本稿では、UVR-B誘発白内障の間に発生する分子事象を研究する有効な方法について説明します。
生体 UVR誘発性白内障で使用可能なほとんどの情報がアルビノSprague-Dawleyラット7、16、17、18、19日の実験から得られたことを、考慮して、現在の研究ではアルビノSprague-Dawleyラットを使用することを決めた。ラットの年齢は6週齢であった。性別は男性とは対照的に、女性が少ないアレルギー尿を持っている、ので、女性に選ばれた。また、UVR誘発白内障20の重症度との関係で男女に違いはありません。
すべての動物は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って保管し、処理した。倫理的な権限はウプサラ動物実験倫理委員会は、プロトコル番号C 29/10から得られた。ラットは、商業ブリーダー（タコニック、デンマーク）から得られる。
テント">狭UVRソースはUVRスペクトルうまく定義するために選ばれました。UVR-Bへのラットレンズの最大感度は300nm程度である。用量1 KJ / m 2の閾値用量より下になるように選択されました15 15分の露光時間、レンズ21〜最大ダメージを誘発するように選択されました。UVR-Bへの暴露と暴露後の時間の投与量は、実験的なデザインによって異なります。対器官の目は、研究における動物の使用統計情報と倫理の観点から、その利点を持っています。目の一方的な露出は、露出と一匹でコントロールとして別の側面は、このようにそれが対になっていない臓器に比べて半減した動物の数を減らすように片側を使用することができます。
このプロトコルでは、我々は動物の固定化のための方法として、麻酔を使用していました。しかし、他の選択肢は、我々は我々の研究室で設計されたラット拘束13は 、unanaesthetized動物の固定に使用することができます。 RATSはラット拘束する前にUV露光を調整しなければならない。このデバイスは、麻酔は、その副作用のために推奨されていない場合によく繰り返されるエクスポージャーを制御することができます。ここでは、麻酔をかけた動物のための位置決めおよび保持装置としてラット拘束を使用していました。
ラットの拘束は木で作られており、我々の研究室では、いくつかの項目で提供されます。それぞれの動物は、それ上に配置される前に、私達は私達の拘束具をきれいにしてください。ウッドブロック、雨樋と木シェルターはラットケージの中で濃縮として使用されています。このような濃縮は欧州の実験動物学協会のウプサラ動物実験倫理委員会と連邦（FELASA）によって承認されています。
レンズは、短時間（5〜10分）でBSSに解剖しなければならない。この制限は、レンズはクリアで透明な滞在することができます。
定量RT-PCR
RA1の溶解緩衝液でレンズを保持するための30分の時間はenです水晶体嚢と皮質を破壊するウワーッ。レンズ核は30分以内に硬いままです。レンズ核、またはオルガネラフリーゾーンは、レンズの転写非アクティブな部分であると考えられる。したがって、核は信号/ノイズmRNA発現率を高めるために、サンプルから除去される。
RNA純度（DNAの不在）制御に用いるDNA特異的プライマーは、p53-プライマーように任意に選ばれた。特定の動物のゲノムDNAの任意の一般的に発生してコード化された配列を選択することができた。両方のレンズは、カスパーゼ-3のRNA含量は、3つの独立した測定値で決定された、ポスト露光間隔あたり10匹と各レンズのためのPCRで解析した。
RT-PCRは、目的のmRNAを測定することができます。逆転写酵素は、その後のPCRで増幅された相補DNAにmRNAを変換します。測定値がint型のcDNAの連続希釈した試料を増幅することにより得られた標準曲線を用いて定量したerest。標準曲線を適用することの利点は、標準曲線は濃度の不確かさを計算するために信頼性の高い方法を提供し、標準曲線は目的のmRNAの定量的な測定を提供することである。あるいは、目的のmRNAの相対的なコンテンツは標準化された蛍光シグナルは、Ct法を得るために必要なサイクル数を比較することによって推定することができる。検量線の主な欠点は、それがCt法よりゲノム製品の使用を必要とすることです。
免疫組織化学的染色
免疫組織化学は、水晶体上皮細胞における活性カスパーゼ3の空間的分布を研究するために使用されました。
目が-70℃に直ちに凍結した℃のすべての進行中の生化学を停止します。目が次に保全のため、同じ温度で保存した。
免疫組織化学は、2つの一般的なプロに関連付けられているblems、一次抗体、抗体の非特異的結合の特異性。抗体は、このように特異性を保証し、よく管理されたソースから取得されるべきである。可能であれば、エピトープを含む組織を陽性対照として染色されるべきである。可能であれば、非特異的染色をoutruleするためには、エピトープは、特異的な抗体、ネガティブコントロールで染色する前にブロックする必要があります。さらに、非特異的染色が最適な抗体濃度と反応時間を確立することによって最小限に抑えることができます。 UVRとUVRにさらされていない組織にさらされる両方の組織を染色することによって、それはここにカスパーゼ-3 UVR誘発エピトープを、確立することが可能である。 caspapse-3信号を発現する細胞の計数を容易にするための蛍光顕微鏡像をデジタルで記録された。バックグラウンドノイズの変化を最小限にするために、我々はすべての顕微鏡写真用の固定設定を使用しました。
バックグラウンド蛍光の信号の強度が共同で異なりますntinuousスケール。したがって、重要な染色のためのしきい値を設定する必要があります。しかし、平均蛍光は、それが困難な重要な染色の絶対しきい値を使用することが観察セクション内で空間的に異なる場合があります。したがって、通常、特定の染色の判断は、経験豊富な観察者に依存しており、特異的な染色の絶対的な結果は、経験豊富な観察者の意見に依存しますが、その観測者のために一貫しています。この理由のために、唯一の経験豊富なオブザーバーが使用されました。 、UVRへの暴露を実験変数による信号を改善するには、ノイズに比較して、各セクションの写真は三回を数えた。
可能であれば、免疫組織化学は、このように予想される分子サイズのエピトープの存在を確認するウェスタンブロットで検証する必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
sのOCH Drottning Viktorias Frimurarstiftelse：この作品は、カロリンスカ研究所KID-資金調達、スウェーデン放射線防護機関、カロリンスカ研究所アイ研究財団、ガンOCH BERTIL Stohnes Stiftelse、聖エリックの眼科病院研究財団、Ögonfonden、KonungグスタフVによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 | |
|
|||
References
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