Summary
Katarakt er den førende årsag til blindhed i verden. Ultraviolet stråling (UVR) er den vigtigste risikofaktor for katarakt udvikling. En dyremodel for langt UVR-B-induceret katarakt blev udviklet. I denne artikel beskriver vi metoder til undersøgelse af kataraktdannelse: eksponering for UVR, kvantitativ RT-PCR og immunhistokemi.
Abstract
Cataract er den hyppigste årsag til blindhed i verden 1. Verdenssundhedsorganisationen definerer katarakt som en uklarhed af linsen i øjet, som hindrer overførslen af lys. Grå stær er en multifaktoriel sygdom associeret med diabetes, rygning, ultraviolet stråling (UVR), alkohol, ioniserende stråling, steroider og hypertension. Der er et stærkt eksperimenterende 2-4 og epidemiologiske beviser 5,6 at UVR forårsager grå stær. Udviklede vi en dyremodel for UVR B induceret katarakt i både bedøvet 7 og ikke-bedøvede dyr 8.
Den eneste kur mod grå stær er operation, men denne behandling er ikke tilgængelig for alle. Det er blevet anslået, at en forsinkelse af indtræden af katarakt i 10 år kan reducere behovet for kataraktoperation med 50% 9. For at udskyde forekomsten af grå stær, er det nødvendigt at forstå de mekanismer, kataraktdannelse og finde en effektiv forebyggelse Strattegier. Blandt de mekanismer for kataraktudvikling, spiller apoptose en afgørende rolle i initiering af katarakt hos mennesker og dyr 10. Vores fokus har for nylig været apoptose i linsen som den mekanisme for grå stær udvikling 8,11,12. Det forventes, at en bedre forståelse af virkningen af UVR på apoptosis pathway giver muligheder for opdagelsen af nye lægemidler for at forebygge katarakt.
I denne artikel beskriver vi, hvordan katarakt kan eksperimentelt fremkaldt af in vivo-eksponering for UVR-B. Yderligere RT-PCR og immunohistokemi præsenteres som redskaber til at undersøge molekylære mekanismer for UVR-B induceret katarakt.
Protocol
1. Udsættelse for ultraviolet stråling
- 15 min før eksponeringen, bedøver en Sprague-Dawley rotte med en blanding af 90 mg / kg Ketalar (Ketamin) og 10 mg / kg Rompun (xylazin) ved intraperitoneal injektion.
- Placer dyret i en rotte harpiksstopperen og spænd selerne indtil immobilisering af rotte uden at forårsage en kuffert squeeze 13.
- Instill Mydriacyl (tropicamid), 10 mg / ml, i begge øjne af rotte at inducere mydriasis.
- Sende dyret, således at det ene øje er anbragt mod en smal stråle af UVR ved 300 nm 14 med 10 nm fulde bredde ved halvt maksimum og afskærme kontralaterale øje med sort tape.
- Expose rotten ensidigt at sub-threshold dosis 1 kJ / m 2 UVR-B ved 300 nm i 15 min 15.
2. Dissection
- Efter forudbestemt efter eksponering interval (1, 5, 24 og 120 timer), ofre seks uger gamle rotter (vægt <200 g) ved carbon dioxide asphyxiation og dislokation af halshvirvlerne.
- Enucleate øjne. Derefter satte øje hornhinde ned, posterior side op. Derefter dorn en minimal hul ved at anvende en 27 gauge kanyle og tryk tangentielt til sclera at undgå beskadigelse af linsen, som er meget tæt på sclera. Derefter bruge et par øjenkirurgi saks til at klippe langs omkredsen lige bag limbus, indtil den bageste del af sclera kan løftes af. Derefter løfte linsen med en stump buede pincet.
- Fjerne resterne af det ciliære legeme fra linsens ækvator under et mikroskop, holde linsen i afbalanceret saltopløsning ikke længere end 5-10 min.
3. Kvantitativ RT-PCR
- Anbring en linse i en blanding af 350 pi RA1 lysisbuffer (NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit) og 3,5 pi β-mercaptoethanol i en 2 ml Eppendorf-rør.
- Holde linsen i denne blanding i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Homogeniser linsen meden nål, indtil der kun hårde kerne af objektivet er fra linsen (cortex og kapsel af linsen lyseres i lysispuffer). Fjern kernen fra blandingen.
- Store prøver straks ved -70 ° C.
- Optø prøverne og følge protokollen "Total RNA oprensning fra dyrkede celler og væv" (NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit).
- Store RNA prøver ved -70 ° C.
- At verificere tilstrækkelig fjernelse af DNA fra hver prøve, køre en PCR under følgende betingelser (trin 1: 95 ° C i 2 minutter, trin 2 i 40 cykler: 95 ° C i 20 sekunder, 55 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 20 sekunder, trin 3: 72 ° C i 7 min) med p53 DNA primere, frem 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'og revers 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' og Taq-DNA-polymerase (dNTPack) ifølge fremstillingen protokol. Det forventede PCR-produkt er 243 basepar.
- Køre en 1,5% agarosegel-elektroforese til påvisning af DNA-specifikt PCR-produkt på 243 basepar. Til fremstilling1,5% agarosegel i TBE-puffer tage 3,75 g agarose og løse den i 250 ml TBE-buffer. Tilføj ethidiumbromid (0,5 mg / ml) 500 pi i 500 ml 1,5% agarosegel opløsning. Blandingen opvarmes i en mikrobølgeovn owen og rør til at løse agarosen.
Ingen af prøverne skal afsløre DNA specifikke PCR-produkter på 1,5% agarosegelelektroforese.
- Måling af koncentrationen af RNA-prøver (1 pi), og forholdet mellem prøven absorbans ved 260 nm (RNA) og 280 nm (protein) i et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Hvis forholdet RNA til protein af RNA-prøve absorbans er 2,0 eller mere så er RNA-prøven er ren. Hvis forholdet mellem RNA-prøve absorbansen er mindre end 2,0, redo RNA oprensningstrin 3.5.
- Tag et volumen på RNA-prøve svarende til 1 ug og syntetisere cDNA ifølge protokollen 1. cDNA-syntese kit (1. cDNA-syntese kit for RT-PCR).
- Opbevares cDNA-prøver ved -20 ° C(For en periode på 1 år eller derover, opbevares ved -70 ° C).
- Kør kvantitativ real-time PCR på iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR-detektion system. Belastning triplikater på plade med 96 brønde med 1 ul cDNA prøve, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay for caspase-3, i henhold til fremstilling instruktioner. Belastning triplikater på en anden plade med 96 brønde med 1 ul cDNA prøve, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay for 18s, i overensstemmelse med fremstilling instruktioner (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Fortyndes i serier en brøkdel af cDNA fra tre tilfældigt udvalgte ikke-eksponerede linser. Kør seriefortyndinger sammen med cDNA fra prøverne i en 96-brønds plade.
- Brug af standardkurven metode til kvantificering af resultaterne. Antallet af cyklusser ved tærskelværdi fluorescens anvendes som måling i MyiQ software. En standardkurve udtrykker antal cyklusser ved tærsklen som funktion af den relative koncentration af kalibrator er esfastslår samtidigt for de serielle fortyndinger i hver plade. cDNA fra tre ubehandlede linse prøver blev anvendt til kalibrering. Relatere tærsklen antal cyklusser for hver prøve med standardkurven for at opnå den relative koncentration af prøven cDNA måles. Endelig får ekspressionsniveauet af målgener ved at relatere den relative koncentration af mål-cDNA med de interne kontrolsystemer 18s cDNA.
4. Immunohistokemisk farvning
- Fiksering
- Dissekere øjet i PBS (phosphatpufret saltvand, pH 7,4).
- Put øjet i et rør fyldt med 4% paraformaldehyd (PFA) i iskoldt i 20 min. Forbered PFA 4% dagen før. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse. PFA er frisk i cirka en uge.
- Fjern PFA med en mikropipette. Derefter vaskes med iskold PBS i 20 min.
- Put øjet i saccharose 30% ved +4 ° C natten over.
- Put øjet i en kop fyldt med Optimal Cutting temperatur (OLT)-medium (Tissue-Tek). Put øjet i en passende stilling til skæring.
- Frys i OCT-medium over tøris.
- Opbevares ved -70 ° C indtil brug.
- Sektionering
- Placer øje for cryo-sektionering i et passende plan.
- Skåret tre 5 um tykt mid-sagittale sektioner fra en central del af hver linse. Skille mindst 6 sektioner mellem delsektioner at undgå farvning samme kerner i forskellige sektioner.
- Når en sektion er blevet skåret, forsigtigt placere en slide på toppen af det. Afsnittet skal derefter holde sig til diaset.
- Lad objektglassene lufttørre inden brug. Objektglassene kan opbevares ved -20 ° C indtil brug.
- Fluorescens immunhistokemi
- Lad prøver nå stuetemperatur (5-10 min).
- Trække kanterne omkring enhederne med PAP-pen (Invitrogen).
- Lad grænsen tørre i et stykke tid (10 min).
- Mærk de objektglas.
- Rehydrere i 1 × PBS i 15 min.
- Permeabilisere i standard blok opløsning i 30 minutter.
- Tilsættes primært antistof (polyklonalt kanin, kløvet caspase-3-antistof Asp175 9661, Cell Signalling Technology, Inc.) fortyndet 1:3000 i standard blokopløsning.
- Opbevares i et fugtigt kammer ved 4 ° C natten over.
- Vask i PBS ved pipettering (3 x 5 min) eller ved nedsænkning i et stort bad (> 15 min, 1-2 ændringer).
- Tilføj sekundært antistof (anti-kanin sekundært antistof med en specifik absorptions / emissionsspektret) fortyndet 1:300 i standard blokopløsning.
- Vask i PBS ved pipettering (3 x 5 min) eller ved nedsænkning i et stort bad (> 15 min, 1-2 ændringer).
- Tør PAP-pen udstrygninger.
- Opbevares i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 3 timer. Undgå udsættelse for lys.
- Tilføj en dråbe Vectashield og læg et dækglas på diaset. Undgå at lave bobler.
- Lad Vectashield hærde (~ 20 min).
- Hold sektioner in den mørke indtil analyse.
- Alle kontrolsnit behandles i fravær af primært antistof.
- Se efter resultaterne inden for få timer under et fluorescensmikroskop.
- Tæl epitelcelle 'kerner fra den ene side nukleare bue til anden side nukleare bue af hver linse. Anvende standard blåt filter for at se alle linsen epithelial kerner i blåt og et standardfilter, der passer emission af det sekundære antistof for at se caspase-3 positive kerner i grøn.
- Registrerer antallet af hele linsen epithelial kerner og antallet af positive kerner. Tæl cellerne tre gange for hver sektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forskellige kilder til variation i målingerne blev estimeret med en variansanalyse, og det konstateredes, at i betragtning af tre målinger pr dyr variansen for målinger var i størrelsesordenen 15% af den for dyr. Således betragtning af hele linse analyse, er det ikke muligt at øge præcisionen. Orthogonal test belyst en statistisk signifikant kontrast til caspase-3 besked mellem 120 hr latency interval i forhold til kortere latenstid mellemrum.
In vivo UVR eksponeringen inducerer caspase-3 ekspression.
Fig. 1. Skematisk af strømmen af eksponering for ultraviolet stråling.
Figur 2. Udviklingen i caspase-3 (casp3) mRNA-ekspression i den krystallinske linse efter in vivo eksponering for 1 kJ / m 2 UVR ved 300 nm. Fejlbjælker er 95% konfidensintervaller for den gennemsnitlige forhold mellem casp3 mRNA/18s rRNA mellem udsatte linse og kontralaterale ikke er udsat linse. De midler, over og under den sorte linje på 1 rel. enhed henholdsvis repræsentere op-og ned-regulering af casp3 genet.
Figur 3. Caspase-3-ekspression (A) i et udsat linse, 24 timer efter eksponering og (B) i en ikke-udsat linse. Pile viser mærkede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver metoder, der gør det muligt at studere molekylære begivenheder i UVR-B induceret katarakt.
I betragtning af, at de fleste oplysninger til rådighed for in vivo UVR induceret katarakt stammer fra eksperimenter på albino Sprague-Dawley rotter 7, 16, 17, 18, 19, besluttede vi at bruge den albino Sprague-Dawley rotte i den aktuelle undersøgelse. Alder rotterne var seks uger gamle. Den kønsmæssige blev valgt til at være kvinde, fordi i modsætning til mænd, kvinder har mindre allergifremkaldende urin. Desuden er der ingen forskel i køn i forhold til sværhedsgraden af UVR-induceret katarakt 20.
Alle dyr blev holdt, og behandles efter ARVO erklæring for anvendelse af dyr i Oftalmologiske og Vision Research. Etisk tilladelse blev opnået fra Uppsala dyreforsøgslov etisk komité, protokol nummer C 29/10. Rotter er opnået fra en kommerciel avler (Taconic, Danmark).
telt "> A smalbåndede UVR kilde blev valgt, for at UVR kan spektralt veldefineret. maksimal følsomhed af rotte-linse til UVR-B er omkring 300 nm. Dosis 1 kJ / m 2 blev valgt til at være under grænseværdien dosis 15. en eksponeringstid på 15 min blev udvalgt til at inducere maksimal beskadigelse af linsen 21. Dosen af eksponering for UVR-B og post-eksponeringstid kan variere afhængigt af forsøgets udformning.Parret orgel øje har sin fordel i form af statistikker og etik i anvendelsen af dyr inden for forskning. Ensidig udsættelse af øjet gør det muligt at anvende den ene side som eksponerede og en anden side som kontrol i et dyr således det reducerer antallet af dyr med halvdelen sammenlignet med uparret organ.
I denne protokol anvendte vi anæstesi som en fremgangsmåde til dyr immobilisering. Imidlertid andet alternativ kan rotte-harpiksstopperen 13, som vi konstrueret i vort laboratorium, kan anvendes til immobilisering af ikke-bedøvede dyr. RATS skal konditioneres rotte harpiksstopperen forud UV eksponering. Denne enhed tillader velkontrollerede gentagne eksponeringer, når anæstesi anbefales ikke på grund af dets bivirkninger. Her brugte vi rotten harpiksstopperen som en positionering og fastholdelsesindretningen til bedøvede dyr.
Rotten harpiksstopperen er lavet af træ og fås i flere punkter i vores laboratorium. Vi rense vores fastholdelsesanordningen før hvert dyr er anbragt på det. Træklodser, tagrender og træ krisecentre bruges som tilsætning i rotte bure. En sådan berigelse er godkendt af Uppsala dyreforsøgsloven etisk komité og Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA).
Linsen skal dissekeret i BSS i kort tid (5-10 minutter). Denne begrænsning gør det muligt for linsen at forblive klar og gennemsigtig.
qRT-PCR
Tidspunktet på 30 min for at holde linsen i RA1 lysisbuffer er engående at afbryde linsekapslen og cortex. Linsenucleus forbliver hårde inden for 30 min. Linsenucleus eller organel-zone anses for at være en transskription ikke-aktiv del af linsen. Derfor er kernen fjernes fra prøven for at øge signal / støj-mRNA-ekspression ratio.
DNA'et specifik primer, der anvendes til RNA renhed (fravær af DNA) kontrol blev valgt vilkårligt til at være p53-primer. Til almindeligt forekommende kodede sekvenser af DNA bestemt dyr genomet kunne vælges. Begge objektiver blev analyseret med PCR for 10 dyr pr post-eksponering interval og for hver linse, blev caspase-3 RNA-indhold bestemmes i tre uafhængige målinger.
RT-PCR muligt at måle mRNA af interesse. Revers transkriptase konverterer mRNA til komplementært DNA, som derefter amplificeres ved PCR. Målinger blev kvantificeret ved anvendelse af standardkurven opnået ved amplificering af seriefortyndede prøver af cDNA'et af intpåløbne renter. Fordelene ved anvendelsen af en standardkurve er at standardkurven tilvejebringer en pålidelig måde at beregne usikkerheden af fusionen, og at standardkurven tilvejebringer kvantitative målinger af mRNA'et af interesse. Alternativt kan det relative indhold af mRNA'et af interesse bestemmes ved direkte sammenligning af antallet af cykler, der kræves for at opnå en standardiseret fluorescenssignal, Ct-metoden. Den største ulempe ved Kalibreringskurven er, at den kræver anvendelse af mere genomiske produkter end Ct metoden.
Immunohistokemisk farvning
Immunhistokemi blev anvendt til at undersøge den rumlige fordeling af aktiv caspase-3 i linseepitelceller.
Øjnene blev frosset straks til -70 ° C for at stoppe alle løbende biokemi. Øjnene blev derefter lagret ved den samme temperatur i konservering.
Immunhistokemi er forbundet med to generelle problemer, specificiteten af det primære antistof og ikke-specifik binding af antistoffet. Antistoffet bør erhverves fra et velkontrolleret kilde, hvilket garanterer specificiteten. Om muligt skal væv, der indeholder epitopen farves som en positiv kontrol. For at outrule uspecifik farvning, om muligt bør epitopen blokeres før farvning med det specifikke antistof, negativ kontrol. Yderligere, ikke-specifik farvning kan minimeres ved at etablere den optimale antistofkoncentration og reaktionstid. Ved farvning både væv udsat for UVR og væv ikke udsættes for UVR er det muligt at fastslå UVR epitopgenfinding, her caspase-3. For at lette optælling af celler, der udtrykker caspapse-3 signal fluorescensmikroskop billedet blev optages digitalt. For at minimere variation af baggrundsstøj, anvendte vi faste indstillinger for alle mikroskop fotografier.
Intensiteten af signalet til baggrundsfluorescens varierer på en continuous skala. Derfor er en tærskel for betydelig farvning skal indstilles. Imidlertid kan den gennemsnitlige fluorescens variere rumligt i afsnittet observeret gør det vanskeligt at bruge en absolut grænse for betydelig farvning. Derfor sædvanligvis dom af specifik farvning bygger på en erfaren iagttager og den absolutte resultat af specifik farvning afhænger udtalelse fra erfarne observatør, men vil være i overensstemmelse for denne observatør. Af denne grund blev kun en erfaren observatør brugt. For at forbedre signal forårsaget af den eksperimentelle variable, eksponering for UVR i forhold til støj, blev billedet af hver sektion talt tre gange.
Hvis det er muligt, bør immunhistokemi verificeres ved western blot hvilket bekræfter eksistensen af epitoper med den forventede molekylære størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Karolinska Institutet KID-finansiering, svensk Radiation Protection Authority, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun and Bertil Stohnes Stiftelse, St. Eriks Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 | |
|
|||
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
- Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
