Summary
Katarakt är den vanligaste orsaken till blindhet i världen. Ultraviolett solstrålning (UVR) är den viktigaste riskfaktorn för grå starr utveckling. En djurmodell för långt UVR-B-inducerad katarakt utvecklades. I den här artikeln beskriver vi metoder för undersökning av grå starr: exponering för UVR, kvantitativ RT-PCR och immunohistokemi.
Abstract
Katarakt är den vanligaste orsaken till blindhet i världen 1. Världshälsoorganisationen definierar katarakt som en grumling av linsen i ögat som hindrar överföring av ljus. Katarakt är en multifaktoriell sjukdom associerad med diabetes, rökning, ultraviolett strålning (UVR), alkohol, joniserande strålning, steroider och hypertoni. Det finns en stark experimentell 2-4 och epidemiologiska bevis 5,6 att UVR orsakar katarakt. Vi utvecklade en djurmodell för UVR B inducerad katarakt i både sövda 7 och icke-sövda djur 8.
Den enda botemedel mot grå starr är operation, men denna behandling är inte tillgänglig för alla. Man har uppskattat att en fördröjning av början av katarakt under 10 år kan minska behovet av kataraktkirurgi med 50% 9. Att fördröja förekomsten av katarakt, är det nödvändigt att förstå mekanismerna för kataraktbildning och hitta effektiva förebyggande strategier. Bland mekanismerna för katarakt utveckling spelar apoptos en avgörande roll i initiering av katarakt hos människor och djur 10. Vårt fokus har nyligen apoptos i linsen som mekanismen för katarakt utveckling 8,11,12. Det förväntas att en bättre förståelse av effekten av UVR på apoptos vägen kommer att ge möjligheter för upptäckt av nya läkemedel för att förhindra grå starr.
I den här artikeln beskriver vi hur katarakt experimentellt kan induceras genom in vivo-exponering UVR-B. Ytterligare RT-PCR och immunohistokemi presenteras som verktyg för att studera molekylära mekanismer UVR-B-inducerad katarakt.
Protocol
1. Exponering för ultraviolett strålning
- 15 min före exponeringen, söva en Sprague-Dawley-råtta med en blandning av 90 mg / kg Ketalar (ketamin) och 10 mg / kg Rompun (xylazin) genom intraperitoneal injektion.
- Placera djuret i en råtta fixeringsutrustning och dra åt remmarna tills immobilisering av råttan utan att orsaka en trunk squeeze 13.
- Ingjuta Mydriacyl (tropikamid), 10 mg / ml, i båda ögonen hos råtta för att inducera mydriasis.
- Placera djuret så att det ena ögat är placerad mot en smal stråle av UVR vid 300 nm 14 med 10 nm full bredd vid halva maximum och skydda den kontralaterala ögat med svart tejp.
- Exponera råttan ensidigt sub-tröskeldos 1 kJ / m 2 UVR-B vid 300 nm i 15 min 15.
2. Dissektion
- Efter förutbestämt efter exponering intervall (1, 5, 24 och 120 timmar), offra den sex veckor gammal råtta (vikt <200 g) genom karbon koldioxid kvävning och dislokation av halskotorna.
- Enucleate ögon. Därefter lade öga hornhinna ner bakre sidan uppåt. Därefter, stansa en minimal hål genom att applicera en 27 gauge kanyl och tryck tangentiellt till sklera att undvika skador på linsen som är mycket nära till sklera. Använd sedan en sax ögonkirurgi att skära omkretsled strax bakom limbus tills den bakre delen av sklera kan lyftas av. Lyft sedan linsen med en trubbig böjd tång.
- Avlägsna resterna av ciliarkroppen från linsens ekvator under ett mikroskop, hålla linsen i balanserad saltlösning ej längre än 5-10 min.
3. Kvantitativ RT-PCR
- Placera en lins i en blandning av 350 pl RA1 lysbuffert (NucleoSpin RNA-II totalt RNA isoleringskit) och 3,5 pl β-merkaptoetanol i en 2 ml Eppendorf-rör.
- Hålla linsen i denna blandning under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Homogenisera linsen meden nål tills endast hårt kärna av linsen är kvar från linsen (cortex och kapsel av linsen lyseras i lysbuffert). Avlägsna kärnan från blandningen.
- Förvara proverna omedelbart vid -70 ° C.
- Tina proverna och följ protokollet "Total RNA rening från odlade celler och vävnader" (NucleoSpin RNA II totalt RNA isolering kit).
- Förvara RNA-prov vid -70 ° C.
- För att verifiera tillräckligt avlägsnande av DNA från varje prov, kör en PCR under följande betingelser (steg 1: 95 ° C under 2 min, steg 2 för 40 cykler: 95 ° C under 20 sekunder, 55 ° C under 20 sekunder, 72 ° C 20 sek, steg 3: 72 ° C under 7 minuter) med specifika p53 DNA-primers, framåt 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'och omvänt 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' och Taq-DNA-polymeras (dNTPack), enligt tillverkarens protokoll. Den förväntade PCR-produkten är 243 baspar.
- Kör en 1,5% agarosgelelektrofores för att detektera DNA-specifik PCR-produkt av 243 baspar. För att framställa1,5% agarosgel i TBE-buffert tar 3,75 g agaros och lösa det i 250 ml TBE-buffert. Lägg etidiumbromid (0,5 mg / ml) 500 ul i 500 ml 1,5% agaros-gel-lösning. Värm blandningen i en mikrovågsugn och rör för att lösa agarosen.
Inget av proverna måste avslöja eventuella DNA specifika PCR-produkter på 1,5% agarosgelelektrofores.
- Mäta koncentrationen av RNA-prover (1 pl) och förhållandet mellan provets absorbans vid 260 nm (RNA) och 280 nm (protein) i ett NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Om förhållandet RNA till protein av RNA-prov absorbans är 2,0 eller mer då RNA-provet är ren. Om förhållandet RNA-provet absorbans är lägre än 2,0, göra om RNA reningssteg 3,5.
- Ta en volym av RNA-provet motsvarande 1 pg och syntetisera cDNA enligt det protokoll 1: a cDNA-syntes kit (1 st Strand cDNA Synthesis Kit för RT-PCR).
- Förvara cDNA prover vid -20 ° C(För en period av 1 år eller mer, förvara vid -70 ° C).
- Kör kvantitativ realtids-PCR på iCycler MyiQ enfärgade Real Time PCR detektionssystem. Belastning triplikat på 96-brunnars platta med 1 | il cDNA-prov, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression analys för kaspas 3, enligt tillverka instruktioner. Belastning triplikat på en annan 96-brunnars platta med 1 | il cDNA-prov, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression analys för 18 år, enligt tillverka instruktioner (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Späd i serie en bråkdel av cDNA från tre slumpvis utvalda icke exponerade linser. Kör seriespädningar tillsammans med cDNA från prov i en 96-brunnsplatta.
- Använd standardkurvan metoden för kvantifiering av resultaten. Antalet cykler vid tröskel fluorescens används som mått i MyiQ programvara. En standardkurva uttryckande antal cykler vid tröskeln som funktion av relativ koncentration av kalibrator är esdades för serieutspädningar i varje platta. cDNA från tre behandlade icke objektiv prover användes för kalibrering. Relatera tröskelvärdet antalet cykler för varje prov med standardkurvan för att erhålla den relativa koncentrationen av provet cDNA mättes. Slutligen får uttryck nivån av målgener genom att relatera den relativa koncentrationen av mål-cDNA för den interna kontrollen 18s cDNA.
4. Immunhistokemisk färgning
- Fixering
- Dissekera ögat i PBS (fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4).
- Sätt ögat i ett rör fyllt med 4% paraformaldehyd (PFA) i iskall under 20 min. Förbered PFA 4% dagen innan. Lagra vid +4 ° C tills användning. PFA är färskt i cirka en vecka.
- Avlägsna PFA med en mikropipett. Därefter, tvätta med iskall PBS under 20 minuter.
- Sätt ögat i sackaros 30% vid +4 ° C över natten.
- Sätt ögat i en kopp fylld med Optimal Cutting Temperature (oktober)-medium (Tissue-Tek). Sätt ögat i en lämplig position för sektionering.
- Frys i oktober-medium över torris.
- Lagra vid -70 ° C tills användning.
- Sektionering
- Placera öga för kryo-sektionering i ett lämpligt plan.
- Skär tre 5 ^ m tjocka mitten sagittala sektioner från en central del av varje lins. Kasta minst 6 sektioner mellan på varandra sektioner för att undvika färgning av samma kärnor i olika sektioner.
- När en del har skurits, försiktigt placera en bild ovanpå det. Avsnittet ska sedan hålla sig till bilden.
- Låt bilderna lufttorka före användning. Objektglasen kan lagras vid -20 ° C tills de behövdes.
- Fluorescens immunohistokemi
- Låt proverna uppnå rumstemperatur (5-10 min).
- Rita kanter runt prover med en PAP-penna (Invitrogen).
- Låt torka gränsen för ett tag (10 minuter).
- Märk objektglas.
- Rehydrera i 1 × PBS under 15 min.
- Permeabilisering i standard blocket lösning under 30 min.
- Lägg primär antikropp (kanin polyklonala, kluvna kaspas-3-antikroppen Asp175 9661, Cell signalering Technology, Inc.) utspädd 1:3000 i standard blocket lösning.
- Lagra i en befuktad kammare vid +4 ° C över natten.
- Tvätta i PBS genom pipettering (3 × 5 min) eller genom nedsänkning i ett stort badkar (> 15 min, 1-2 förändringar).
- Lägg sekundär antikropp (anti-kanin sekundär antikropp med en specifik absorptions / emissionsspektrumet) utspädd 1:300 i standard blocket lösningen.
- Tvätta i PBS genom pipettering (3 × 5 min) eller genom nedsänkning i ett stort badkar (> 15 min, 1-2 förändringar).
- Torka av PAP-penna utstryk.
- Förvara i en fuktad kammare vid rumstemperatur under 3 timmar. Undvik exponering för ljus.
- Lägg en droppe Vectashield och placera ett täckglas på bilden. Undvik att bubblor.
- Låt Vectashield hårdnar (~ 20 min).
- Håll avsnitten In mörkret fram till analysen.
- Samtliga styrsektioner bearbetas i frånvaro av primär antikropp.
- Leta efter resultat inom ett par timmar under ett fluorescensmikroskop.
- Räkna epitelceller "kärnor från en sida kärnkraft båge till andra sidan nukleära båge på varje lins. Applicera standard blå filter för att se alla objektiv epitelial kärnor i blått och ett standardfilter som passar utsläppen av den sekundära antikroppen för att se kaspas-3 positiva kärnor i grönt.
- Registrera antalet alla objektiv epitelial kärnor och antalet positiva kärnor. Räkna cellerna tre gånger för varje avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De olika källorna till variation i mätningarna uppskattades med en variansanalys och det visade sig att överväga tre mätningar per djur variansen för mätningar var av storleksordningen 15% av den för djur. Sålunda, med tanke på hela objektivet analys, är det inte möjligt att öka precisionen. Ortogonal tester klarlagd en statistiskt signifikant skillnad för kaspas-3 meddelande mellan 120 HR latens intervall kontra kortare intervaller latens.
In vivo UVR exponering inducerar kaspas-3-uttryck.
Figur 1. Schematisk av flödet av exponering för ultraviolett strålning.
Figur 2. Utvecklingen av kaspas-3 (casp3) mRNA-expression i den kristallina linsen efter in vivo-exponering för 1 kJ / m 2 UVR vid 300 nm. Felstaplar är 95% konfidensintervall för medelvärdet förhållande casp3 mRNA/18s rRNA mellan exponerad lins och kontralaterala inte utsätts linsen. Medlen, över och under den svarta linjen vid 1 rel. enhet respektive utgöra upp-och nedreglering av casp3 genen.
Figur 3. Kaspas-3-uttryck (A) i en exponerad lins, 24 h efter exponering och (B) i en icke-exponerad lins. Pilarna visar märkta celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver metoder som möjliggör studier molekylära händelser som inträffar under UVR-B inducerade katarakt.
Med tanke på att de flesta angiven för in vivo-UVR inducerad katarakt härrör från försök på albino Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, bestämde vi oss för att använda albino Sprague-Dawley råtta i den aktuella studien. Ålder råttorna var sex veckor gammal. Kön valdes till kvinnlig eftersom, i motsats till män, kvinnor har mindre allergiframkallande urin. Dessutom finns det ingen skillnad i kön i relation till graden av UVR inducerad katarakt 20.
Alla djur hölls och behandlas i enlighet med ARVO uttalande för användning av djur i Ophthalmic och Vision Research. Etisk tillstånd erhölls från Uppsala Animal Experiments etikkommittén, protokoll nr K 29/10. Råttor erhålles från en kommersiell uppfödare (Taconic, Danmark).
tält "> En smalbandig UVR källa har valts för att UVR att spektralt väl definierade. Maximal känslighet av rått linsen UVR-B är omkring 300 nm. Dosen 1 kJ / m 2 valdes ligga under tröskeldosen 15. Exponeringstiden av 15 minuter valdes för att inducera maximal skada på linsen 21. Dosen av exponering för UVR-B och efter exponering tid kan variera beroende på den experimentella utformningen.Kopplade orgel öga har sin fördel i form av statistik och etik i användningen av djur i forskningen. Ensidigt exponering av ögat gör att använda en sida som exponeras och en annan sida som kontroll i ett djur så det minskar antalet djur med hälften jämfört med oparade orgel.
I detta protokoll använde vi anestesi som en metod för immobilisering djur. Men, andra alternativ kan råtta fixeringsutrustning 13, som vi utvecklat i vårt laboratorium, användas för immobilisering av unanaesthetized djur. RATS måste vara anpassade till råtta förband innan den UV-exponering. Denna enhet möjliggör välkontrollerade upprepad exponering när anestesi rekommenderas inte på grund av dess biverkningar. Här har vi använt råttan fixeringsutrustning som positionering och hållare för sövda djur.
Råttan förband är gjord av trä och finns i flera poster i vårt laboratorium. Vi rena våra Förankringsanordningen innan varje djur är placerad på den. Trä block, rännor och vindskydd trä används som anrikning i råtta burar. Sådan anrikning är godkänd av Uppsala djurförsök etikkommittén och Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA).
Linsen måste dissekeras i BSS under kort tid (5-10 minuter). Denna begränsning gör linsen att stanna tydlig och öppen.
QRT-PCR
Tiden för 30 minuter för att hålla linsen i RA1 lyseringsbuffert är engrundlig att störa linskapseln och cortex. Den linscellkärnan förblir hårt inom 30 minuter. Linsen kärnan, eller organell-fri zon anses vara en transkription icke-aktiv del av linsen. Därför är kärnan avlägsnas från provet för att öka signal / brusförhållandet mRNA-expression.
Den DNA-primer som används för RNA-renhet (frånvaro av DNA) kontroll valdes godtyckligt för att vara p53-primer. Alla generellt förekommande kodade sekvenser av DNA särskilt djur genomet kan väljas. Båda linserna analyserades med PCR för 10 djur per efterexponering intervall och för varje lins, var caspas-3-RNA som bestäms i tre oberoende mätningar.
RT-PCR gör det möjligt att mäta mRNA av intresse. Det omvända transkriptaset omvandlar mRNA till komplementärt DNA som sedan amplifieras genom PCR. Mätningar kvantifieras med hjälp av standardkurva erhållen genom amplifiering serieutspädda prover av cDNA av interest. Fördelarna med att applicera en standardkurva är att standardkurvan ger ett tillförlitligt sätt att beräkna osäkerheten av koncentrationen, och att standardkurvan ger kvantitativa mätningar av mRNA av intresse. Alternativt, kan den relativa halten av mRNA av intresse uppskattas genom direkt jämföra antalet cykler som krävs för att erhålla en standardiserad fluorescenssignal, Ct-metoden. Den huvudsakliga nackdelen med kalibreringskurvan är att det kräver användning av mer genomiska produkter än Ct metoden.
Immunhistokemisk färgning
Immunohistokemi användes för att studera rumsliga fördelningen av aktiv caspas-3 i linsepitelceller.
Ögonen frystes omedelbart till -70 ° C för att stoppa alla pågående biokemi. Ögonen lagrades sedan vid samma temperatur under konservering.
Immunohistokemi är associerad med två allmänna Problem, specificiteten för den primära antikroppen och icke-specifik bindning av antikroppen. Antikroppen bör förvärvas från en väl kontrollerad källa, vilket garanterar specificitet. Om möjligt bör vävnad som innehåller epitopen färgas som en positiv kontroll. För att outrule icke-specifik färgning, om möjligt, bör epitopen blockeras innan färgning med den specifika antikroppen, negativ kontroll. Vidare, icke specifik färgning kan minimeras genom att den optimala koncentrationen av antikroppar och reaktionstid. Genom färgning både vävnad utsätts för UVR och vävnad inte utsätts för UVR, är det möjligt att fastställa UVR inducerade epitopen, här kaspas-3. För att underlätta räkningen av celler som uttrycker caspapse-3 signal fluorescensmikroskop bilden var digitalt inspelade. För att minimera variation av bakgrundsljud, använde vi fasta inställningar för alla mikroskop fotografier.
Intensiteten av signalen till bakgrundsfluorescens varierar på ett samarbeteen fortlöpande skala. Därför har ett tröskelvärde för betydande färgning ställas in. Emellertid, kan den genomsnittliga fluorescensen variera rumsligt inom sektionen observerade gör det svårt att använda en absolut tröskel för betydande färgning. Därför brukar dom specifik färgning bygger på en erfaren observatör och den absoluta resultatet av specifik färgning beror på yttrande från erfaren observatör, men kommer att vara konsekvent för den observatör. Av denna anledning har endast en erfaren observatör används. För att förbättra signalen som orsakas av den experimentella variabeln, exponering för UVR, jämfört med brus, var fotografi av varje sektion räknades tre gånger.
Om möjligt bör immunohistokemi verifieras genom western blöt vilket bekräftar förekomsten av epitoper med den förväntade molekylstorlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Karolinska Institutets KID-medel, svenska strålskyddsinstitut, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun OCH Bertil Stohnes Stiftelse, St Eriks Ögonsjukhus Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s OCH Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 | |
|
|||
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
- Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
