Summary
Katarakt er den ledende årsak til blindhet i verden. Solar ultrafiolett stråling (UVR) er den viktigste risikofaktor for katarakt utvikling. En dyremodell for mye til UVR-B indusert katarakt ble utviklet. I denne artikkelen beskriver vi metoder for etterforskning av katarakt: eksponering for UVR, kvantitativ RT-PCR og immunhistokjemi.
Abstract
Katarakt er den ledende årsak til blindhet i verden en. The World Health Organization definerer katarakt som en uklarhet i linsen i øyet som hindrer overføring av lys. Grå stær er en multi-faktoriell sykdom forbundet med diabetes, røyking, ultrafiolett stråling (UVR), alkohol, ioniserende stråling, steroider og hypertensjon. Det er sterk eksperimentell 2-4 og epidemiologiske bevis 5,6 som UVR forårsaker grå stær. Vi utviklet en dyremodell for UVR B indusert katarakt både bedøvet 7 og ikke-bedøvede dyr 8.
Den eneste kur for katarakt er operasjon, men denne behandlingen er ikke tilgjengelig for alle. Det har blitt anslått at en forsinkelse på utbruddet av katarakt i 10 år kunne redusere behovet for kataraktoperasjon med 50% 9. Å forsinke forekomsten av katarakt, er det nødvendig å forstå mekanismene for katarakt og finne effektive forebyggende strategiegies. Blant mekanismer for katarakt utvikling, spiller apoptose en avgjørende rolle i initiering av katarakt hos mennesker og dyr 10. Vårt fokus har nylig vært apoptose i linsen som mekanisme for katarakt utvikling 8,11,12. Det er forventet at en bedre forståelse av virkningen av UVR på apoptose veien vil gi muligheter for oppdagelsen av nye legemidler for å forhindre katarakt.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan katarakt kan eksperimentelt indusert ved in vivo eksponering for UVR-B. Videre RT-PCR og immunhistokjemi presenteres som verktøy for å studere molekylære mekanismer for UVR-B indusert katarakt.
Protocol
1. Eksponering for ultrafiolett stråling
- 15 min før eksponeringen anesthetize en Sprague-Dawley rotte med en blanding av 90 mg / kg Ketalar (ketamin) og 10 mg / kg Rompun (xylazin) ved intraperitoneal injeksjon.
- Plasser dyret i en rotte restrainer og stram beltet før immobilisering av rotte uten å forårsake en koffert klemme 13.
- Innpode Mydriacyl (Tropicamide), 10 mg / ml, i begge øyne hos rotte for å indusere mydriasis.
- Plasser dyret slik at det ene øyet er plassert mot en smal stråle av UVR i 300 nm 14 med 10 nm full bredde ved halv maksimal og skjerme det kontralaterale øyet med svart tape.
- Utsett rotte ensidig å sub-terskel dose 1 kJ / m 2 UVR-B på 300 nm for 15 min 15.
2. Disseksjon
- Etter forutbestemt post eksponering intervall (1, 5, 24 og 120 timer), ofrer den seks ukers gamle rotte (vekt <200 g) ved carbon karbondioksid kvelning og dislokasjon av cervical vertebrae.
- Enucleate øyne. Deretter satte øyet hornhinnen ned, posterior opp. Deretter punsj en minimal hull ved å bruke en 27 gauge kanyle og skyv tangentialt til sclera å unngå å skade linse som er svært nær sclera. Da bruk et par oftalmiske kirurgi saks til å klippe periferisk rett bak Limbus inntil bakre delen av sclera kan løftes av. Løft på linsen med en stump buet tang.
- Fjern rester av ciliarkropp fra objektivet ekvator under et mikroskop, holde objektivet i balanserte saltløsning ikke lenger enn 5-10 min.
3. Kvantitativ RT-PCR
- Plasser en linse i en blanding av 350 pl RA1 lyseringsbuffer (NucleoSpin RNA II total RNA isolasjon kit) og 3,5 pl β-merkaptoetanol i en 2 ml Eppendorf-rør.
- Holde linsen i denne blandingen under 30 minutter ved romtemperatur.
- Homogenisere linsen meden nål til bare harde kjerne av linsen er igjen fra objektivet (cortex og kapsel av linsen lyseres i lyseringsbuffer). Fjern kjernen fra blanding.
- Oppbevar prøvene umiddelbart ved -70 ° C.
- Tine prøvene og følger protokoll "Total RNA rensing fra dyrkede celler og vev" (NucleoSpin RNA II total RNA isolasjon kit).
- Oppbevar RNA prøver ved -70 ° C.
- Å verifisere tilstrekkelig fjerning av DNA fra hver prøve, kjøre en PCR under følgende betingelser (trinn 1: 95 ° C i 2 min; trinn 2 for 40 sykluser: 95 ° C i 20 sek, 55 ° C i 20 sek, 72 ° C i 20 sek, trinn 3: 72 ° C i 7 minutter) med p53 DNA spesifikke primere, forover 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'og 5'-revers TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' og Taq DNA-polymerase (dNTPack), i henhold til fremstillingen protokoll. Den forventede PCR-produkt er 243 basepar.
- Kjør en 1,5% agarosegelelektroforese for å oppdage DNA spesifikke PCR-produkt av 243 basepar. Å forberede1,5% agarosegel i TBE-buffer ta 3,75 g agarose og løse det i 250 ml av TBE-buffer. Legg etidiumbromid (0,5 mg / ml) 500 pl i 500 ml 1,5% agarose gel løsning. Varm opp blandingen i en mikrobølgeovn Owen og omrør for å løse agarose.
Ingen av prøvene har for å avdekke eventuelle DNA spesifikke PCR produkter på 1,5% agarose-gelelektroforese.
- Måle konsentrasjonen av RNA prøver (1 pl) og forholdet for prøven absorbans ved 260 nm (RNA) og 280 nm (protein) i en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Dersom forholdet RNA til protein av RNA prøven absorbans er 2,0 eller mer enn RNA prøven er ren. Hvis forholdet av RNA prøven absorbans er lavere enn 2,0, redo RNA rensetrinn 3.5.
- Ta et volum på RNA prøve tilsvarende 1 mg og syntetisere cDNA etter protokoll 1 st Strand cDNA syntese Kit (1 st Strand cDNA syntese Kit for RT-PCR).
- Lagre cDNA prøver ved -20 ° C(I en periode på 1 og flere år, lagre ved -70 ° C).
- Kjør kvantitativ real-time PCR på iCycler MyiQ Ensfarget Real Time PCR deteksjon system. Belastning triplicates på 96-brønns plate med 1 ul cDNA prøven, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3, ifølge produsere instruksjoner. Belastning triplicates på en annen 96-brønns plate med 1 ul cDNA prøven, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay for 18 år, ifølge produsere instruksjoner (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Fortynn i serie en brøkdel av cDNA fra tre tilfeldig valgte ikke-eksponerte linser. Kjør seriefortynninger sammen med cDNA fra prøvene i en 96-brønns plate.
- Bruk standardkurven metode for kvantifisering av resultatene. Antallet sykluser ved terskel fluorescens brukes som målingen MyiQ programvare. En standardkurve uttrykker antall sykluser ved terskelen som funksjon av relative konsentrasjonen av kalibratoren er established for de serielle fortynninger i hver plate. cDNA fra tre uten behandlede linse prøvene ble anvendt for kalibrering. Relatere terskelen antall sykluser for hver prøve til standardkurven for å oppnå den relative konsentrasjonen av prøven cDNA målt. Endelig, får i nivået av målgener ved å relatere den relative konsentrasjonen av target cDNA i internkontrollen 18s cDNA.
4. Immunhistokjemisk farging
- Fiksering
- Dissekere øyet i PBS (fosfatbufret saltvann, pH 7,4).
- Sett øyet i et rør fylt med 4% paraformaldehyd (PFA) i iskaldt i 20 min. Forbered PFA 4% dagen før. Oppbevares ved 4 ° C før bruk. PFA er frisk for ca en uke.
- Fjern PFA med en mikropipette. Deretter vaskes med iskaldt PBS i 20 min.
- Sett øyet i sukrose 30% ved 4 ° C over natten.
- Sett øyet i en kopp fylt med Optimal Cutting Temperatur (OCT)-medium (Tissue-Tek). Sett øyet i en passende stilling for snitting.
- Fryse i OCT-medium over tørris.
- Oppbevares ved -70 ° C inntil bruk.
- Seksjonering
- Plasser øye for Cryo-snitting i en hensiktsmessig plan.
- Skar tre 5 mikrometer tykke midten sagittale seksjoner fra et sentralt parti av hver linse. Kast minst 6 seksjoner mellom sekvensielle seksjoner for å unngå flekker på samme kjerner i ulike seksjoner.
- Når en seksjon har blitt kuttet, forsiktig plasserer et lysbilde på toppen av det. Seksjonen skal da holde seg til lysbildet.
- La lysbilder lufttørke før bruk. Lysbilder kan lagres ved -20 ° C inntil behov.
- Fluorescens immunhistokjemi
- La prøvene oppnå romtemperatur (5-10 min).
- Tegn kantene rundt prøvene med en PAP-penn (Invitrogen).
- La grensen tørke en stund (10 min).
- Merke objektglass.
- Rehydrate inn 1 × PBS i 15 min.
- Permeabilize i standard blokk løsning i 30 min.
- Legg primære antistoff (kanin polyklonale, kløyvde caspase-3-antistoff Asp175 9661; Cell Signalering Technology, Inc) fortynnet 1:3,000 i standard blokk løsning.
- Lagres på et fuktet kammer ved 4 ° C over natten.
- Vask i PBS ved å pipettere (3 x 5 min), eller ved å dyppe i et stort bad (> 15 min, 1-2 endringer).
- Legg sekundært antistoff (antikanin sekundært antistoff med en spesifikk absorpsjon / emisjonsspektrum) fortynnet 1:300 i standard blokken løsningen.
- Vask i PBS ved å pipettere (3 x 5 min), eller ved å dyppe i et stort bad (> 15 min, 1-2 endringer).
- Tørk av PAP-penn flekker.
- Lagre i en fuktet kammer ved romtemperatur i 3 timer. Unngå eksponering for lys.
- Legg en dråpe Vectashield og plassere en dekkglass på lysbildet. Unngå å gjøre bobler.
- La Vectashield hardner (~ 20 min).
- Hold seksjonene in den mørke inntil analyse.
- Alle kontroll delene behandles i fravær av primære antistoff.
- Se etter resultater innen få timer under en fluorescens mikroskop.
- Telle epitelceller 'kjerner fra den ene siden kjernefysisk baug til andre siden kjernefysisk baugen hver linse. Anvende standarden blått filter for å se alle linse epitelial kjerner i blått og en standard filter som passer utslipp av den sekundære antistoff for å se caspase-3 positive kjerner i grønt.
- Registrere antall alle linse epitelial kjerner og antall positive kjerner. Telle celler tre ganger for hver del.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forskjellige kilder til variasjon i målingene ble beregnet med en analyse av varians og det ble funnet at vurderer tre målinger pr dyr variansen for målinger var av størrelsesorden 15% av det for dyr. Således, tatt i betraktning hel linse analyse, er det ikke mulig å øke presisjonen. Ortogonale testing belyst en statistisk signifikant kontrast for caspase-3-melding mellom 120 hr latency intervall versus kortere ventetid intervaller.
In vivo UVR eksponering induserer caspase-3 uttrykk.
Figur 1. Skjematisk av flyten av eksponering for ultrafiolett stråling.
Figur 2. Evolution of caspase-3 (casp3) ekspresjon i den krystallinske linse etter in vivo eksponering for 1 kJ / m 2 UVR ved 300 nm. Feilfelt er 95% konfidensintervall for gjennomsnittlig forholdet casp3 mRNA/18s rRNA mellom eksponert linse og kontralateral ikke utsatt linse. Midlene, over og under den sorte linjen en rel. enhet, henholdsvis representerer opp-og ned-regulering av casp3 genet.
Figur 3. Caspase-3 ekspresjon (A) i en eksponert linse, 24 hr etter eksponering og (B) i et ikke-eksponert linse. Piler viser merkede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette notatet beskriver metoder som gjør det mulig å studere molekylære hendelser oppstår under UVR-B indusert katarakt.
Betraktning, at de fleste informasjon tilgjengelig for in vivo UVR indusert katarakt ble avledet fra eksperimenter på albino Sprague-Dawley rotter 7, 16, 17, 18, 19, bestemte vi å bruke albino Sprague-Dawley rotte i studien. Alder av rottene var seks uker gammel. Kjønnet ble valgt til å være kvinnelige fordi, i motsetning til menn, kvinner har mindre allergifremkallende urin. Videre, er det ingen forskjell i kjønn i forhold til alvorligheten av UVR indusert katarakt 20.
Alle dyrene ble holdt og behandlet i henhold til Arvo erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research. Etisk tillatelse er innhentet fra Uppsala Animal Experiments komité, protokoll nummer C 29/10. Rotter blir oppnådd fra en kommersiell oppdretter (Taconic, Danmark).
telt "> En smalbånds UVR kilde ble valgt for at UVR skal spektralt veldefinert. Maksimum sensitivitet av rotte objektivet til UVR-B er rundt 300 nm. Dosen 1 kJ / m 2 ble valgt til å være under terskelen dosen 15. eksponeringstiden på 15 minutter ble valgt å indusere maksimal skade på linsen 21. Dosen av eksponering for UVR-B og post-eksponering kan variere avhengig eksperimentell design.Organ som øyet har sin fordel i form av statistikk og etikk i bruk av dyr i forskning. Ensidig eksponering av øyet muliggjør å bruke en side som eksponert og en annen side som kontroll i en dyr dermed reduserer antall dyr ved halvparten sammenlignet med uparet orgel.
I denne protokollen brukte vi anestesi som en metode for dyr immobilisering. Men andre alternativ kan rotte 13 restrainer, som vi designet i vårt laboratorium, brukes til immobilisering av unanaesthetized dyr. Rats må kondisjonert til rotte restrainer før UV eksponering. Denne enheten kan godt kontrollert gjentatte eksponeringer når anestesi er ikke anbefalt på grunn av sine bivirkninger. Her har vi brukt rotte restrainer som en posisjonering og holding enhet for bedøvede dyr.
Rotte restrainer er laget av tre og er tilgjengelig i flere elementer i vårt laboratorium. Vi rense våre besøksforbud enheten før hvert dyr er plassert på den. Tre blokker, renner og tre krisesentre blir brukt som berikelse i rotte bur. Slik berikelse er godkjent av Uppsala Animal Experiments komité og Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA).
Linsen må dissekert i BSS i løpet av kort tid (5-10 minutter). Denne begrensningen gjør at objektivet til å bli klar og gjennomsiktig.
QRT-PCR
Tidspunktet for 30 min for å holde linsen i RA1 lyseringsbuffer er noough å forstyrre linsekapsel og cortex. Linsen kjernen forblir hardt innen 30 min. Linsen kjernen eller organeller sone anses å være en transkripsjon ikke-aktive del av linsen. Derfor, blir kjernen fjernes fra prøven for å øke signal / støy-forhold mRNA ekspresjon.
DNA spesifikk primer brukes for RNA renhet (fravær av DNA) kontroll ble valgt vilkårlig å være p53-primer. Eventuelle generelt forekommende kodede sekvenser av DNA av bestemt dyr genom kunne velges. Begge objektivene ble analysert med PCR for 10 dyr per post-eksponering intervall og for hvert objektiv, ble caspase-3 RNA innhold bestemmes i tre uavhengige målinger.
RT-PCR muliggjør å måle mRNA av interesse. Reverstranskriptase konverterer mRNA inn komplementær DNA som deretter forsterkes ved PCR. Målinger ble kvantifisert ved hjelp av standard kurve oppnådd ved å forsterke seriefortynnet prøver av cDNA av interest. Fordelene med å bruke en standardkurve er at standard kurven gir en pålitelig metode for å beregne usikkerheten av konsentrasjon, og at den standardkurven gir kvantitative målinger av mRNA av interesse. Alternativt kunne den relative innholdet av mRNA av interesse beregnes ved direkte å sammenligne antallet sykluser som kreves for å oppnå en standardisert fluorescens signal, Ct-metoden. Den største ulempen med kalibreringskurven er at det krever bruk av flere genomisk produkter enn Ct metoden.
Immunhistokjemisk farging
Immunhistokjemi ble benyttet for å studere romlig fordeling av aktiv caspase-3 i linse epitelceller.
Øynene ble frosset umiddelbart til -70 ° C for å stoppe alle pågående biokjemi. Øynene ble så lagret ved den samme temperatur for bevaring.
Immunhistokjemi er assosiert med to generelle problemer; Spesifisiteten av det primære antistoff og uspesifikk binding av antistoffet. Antistoffet skal være kjøpt fra en godt kontrollert kilde, og dermed garantere spesifisitet. Hvis mulig bør vev inneholdende epitopen være farget som en positiv kontroll. For å outrule ikke-spesifikk farging, hvis mulig, bør epitopen blokkeres før farging med det spesifikke antistoff, negativ kontroll. Videre, ikke spesifikk farging kan minimeres ved å etablere den optimale antistoffkonsentrasjon og reaksjonstid. Ved farging både vev eksponert for UVR og vev ikke utsatt for UVR, er det mulig å etablere UVR indusert epitop, her caspase-3. For å lette telling av celler som uttrykker caspapse-3 signal fluorescens mikroskop bildet ble digitalt innspilt. For å minimalisere variasjonen av bakgrunnsstøy, vi brukte faste innstillinger for alle mikroskop fotografier.
Intensiteten av signalet til bakgrunnsfluorescens varierer på en continuous skala. Derfor har en terskel for betydelig farging å bli satt. Imidlertid, kan den gjennomsnittlige fluorescens variere romlig innenfor seksjonen observert gjør det vanskelig å bruke en absolutt terskel for betydelig farging. Derfor vanligvis dom spesifikk farging er avhengig av en erfaren observatør og den absolutte utfallet av spesifikk farging avhenger av den oppfatning at erfarne observatør, men vil være konsistent for at observatør. Av denne grunn ble bare en erfaren observatør brukes. For å forbedre signalet forårsaket av den eksperimentelle variabelen, eksponering for UVR sammenlignet med støy, ble bildet av hver seksjon telles tre ganger.
Hvis mulig bør immunhistokjemi verifiseres av Western blot dermed bekrefter eksistensen av epitoper med forventet molekylstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Karolinska Institutet KID-midler, svensk strålevern, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, St. Erik Øye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 | |
|
|||
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
- Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
