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Medicine

Caractérisation des mécanismes moléculaires de la doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

La cataracte est la principale cause de cécité dans le monde. Rayonnement solaire ultraviolet (UV) est le principal facteur de risque pour le développement de la cataracte. Un modèle animal de loin la cataracte rayons UV-B induite a été développé. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d'enquête de la formation de la cataracte: l'exposition aux rayons UV, RT-PCR quantitative et immunohistochimie.

Abstract

La cataracte est la principale cause de cécité dans le monde 1. L'Organisation mondiale de la santé définit la cataracte comme une opacification du cristallin de l'œil qui empêche le transfert de la lumière. La cataracte est une maladie multifactorielle associée au diabète, le tabagisme, le rayonnement ultraviolet (UV), l'alcool, les radiations ionisantes, les stéroïdes et l'hypertension. Il existe des preuves expérimentales 2-4 et épidémiologique 5,6 que le rayonnement UV provoque la cataracte. Nous avons développé un modèle animal pour les rayons UV B de la cataracte induite dans les deux 7 anesthésiés et non anesthésiés animaux 8.

Le seul remède est la chirurgie de la cataracte, mais ce traitement n'est pas accessible à tous. Il a été estimé qu'un délai d'apparition de la cataracte pendant 10 ans pourrait réduire le besoin de chirurgie de la cataracte de 50% 9. Pour retarder l'incidence de la cataracte, il est nécessaire de comprendre les mécanismes de formation de la cataracte et de trouver stratégie de prévention efficacegies. Parmi les mécanismes de développement de la cataracte, l'apoptose joue un rôle crucial dans l'initiation de la cataracte chez les humains et les animaux 10. Notre objectif a récemment été l'apoptose dans l'objectif comme le mécanisme de développement de la cataracte 8,11,12. Il est prévu qu'une meilleure compréhension de l'effet des rayons UV sur la voie de l'apoptose offrira des possibilités pour la découverte de nouveaux médicaments pour prévenir la cataracte.

Dans cet article, nous décrivons comment la cataracte peut être induite expérimentalement par l'exposition in vivo au rayonnement UV-B. En outre RT-PCR et immunohistochimie sont présentés comme des outils pour étudier les mécanismes moléculaires des rayons UV-B induite par la cataracte.

Protocol

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1. L'exposition au rayonnement ultraviolet

  1. 15 min avant l'exposition, anesthésier une femelle rat Sprague-Dawley avec un mélange de 90 mg / kg Ketalar (kétamine) et 10 mg / kg Rompun (xylazine) par injection intrapéritonéale.
  2. Placez l'animal dans un dispositif de contention rat et serrer les courroies jusqu'à l'immobilisation du rat sans provoquer un resserrement du tronc 13.
  3. Instiller Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, dans les deux yeux du rat pour induire une mydriase.
  4. Placez l'animal de sorte que l'œil on est placé contre un faisceau étroit de rayons UV à 300 nm 14 avec une largeur de 10 nm à mi-hauteur et protéger l'oeil controlatéral avec un ruban noir.
  5. Exposer le rat unilatéralement de sous-seuil de dose 1 kJ / m 2 rayons UV-B à 300 nm pour 15 min 15.

2. Dissection

  1. Après prédéterminé intervalle post-exposition (1, 5, 24 et 120 h), sacrifiez le rat âgé de six semaines (poids <200 g) par carboasphyxie au dioxyde de n et la dislocation des vertèbres cervicales.
  2. Énucléer les yeux. Par la suite, mettre la cornée de l'oeil vers le bas, jusqu'à la face postérieure. Ensuite, faites un trou minimum en appliquant une canule de calibre 27 et pousser tangentiellement à la sclérotique pour éviter d'endommager la lentille qui est très proche de la sclérotique. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pour couper la chirurgie ophtalmique circonférence juste derrière le limbe jusqu'à ce que la partie postérieure de la sclérotique peut être enlevé. Ensuite, soulevez la lentille avec un forceps émoussé courbes.
  3. Enlever les restes du corps ciliaire de l'équateur au microscope optique, en maintenant la lentille dans une solution saline équilibrée de pas plus de 5-10 min.

3. RT-PCR quantitative

  1. Placez une lentille dans un mélange de 350 pi de tampon de lyse RA1 (NucleoSpin RNA II ARN total kit d'isolement) et 3,5 ul β-mercaptoéthanol dans un tube Eppendorf de 2 ml.
  2. Maintenir l'objectif dans ce mélange pendant 30 min à température ambiante.
  3. Homogénéiser l'objectif avecune aiguille jusqu'à ce que le noyau dur de la lentille est à gauche de la lentille (cortex et la capsule de la lentille sont lysées dans le tampon de lyse). Retirer le noyau du mixage.
  4. Conserver les échantillons immédiatement à -70 ° C.
  5. Décongeler les échantillons et de suivre le protocole de "purification d'ARN total à partir de cellules cultivées et des tissus" (NucleoSpin RNA II ARN total kit d'isolement).
  6. Boutique échantillons d'ARN à -70 ° C.
  7. Pour vérifier élimination suffisante de l'ADN de chaque échantillon, exécutez une PCR dans les conditions suivantes (étape 1: 95 ° C pendant 2 min; étape 2 pour 40 cycles: 95 ° C pendant 20 sec, 55 ° C pendant 20 sec, 72 ° C pendant 20 s; étape 3: 72 ° C pendant 7 min) avec des amorces d'ADN spécifiques de p53, de l'avant-5'ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'et 5'-inverse TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' et la Taq ADN polymérase (dNTPack), en fonction de la fabrication protocole. Le produit attendu PCR est de 243 paires de bases.
  8. Exécuter une électrophorèse sur gel d'agarose 1,5% pour détecter l'ADN produit de PCR spécifique de 243 paires de bases. Pour préparer1,5% gel d'agarose dans du tampon TBE prendre 3,75 g d'agarose et de le résoudre dans 250 ml de tampon TBE. Ajouter au bromure d'éthidium (0,5 mg / ml) 500 pl dans 500 ml de solution de gel d'agarose 1,5%. Chauffer le mélange dans un four à micro-ondes et remuer pour résoudre le agarose.

Aucun des échantillons n'a révélé aucun d'ADN spécifiques des produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%.

  1. Mesurer la concentration des échantillons d'ARN (1 pi) et le rapport de l'absorbance à 260 nm échantillon (ARN) et 280 nm (protéines) dans un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre. Si l'ARN rapport aux protéines du absorbance de l'échantillon d'ARN est de 2,0 ou plus, l'échantillon d'ARN est pur. Si le rapport d'absorbance de l'échantillon d'ARN est inférieur à 2,0, 3,5 refaire ARN étape de purification.
  2. Prenez un volume d'échantillon d'ARN correspondant à 1 ug et de synthétiser l'ADNc suivant le protocole 1 Kit Strand er synthèse de l'ADNc (1 er volet de synthèse d'ADNc pour kit RT-PCR).
  3. Conserver les échantillons d'ADNc à -20 ° C(Pour une période de 1 ans voire plus, conserver à -70 ° C).
  4. Exécuter quantitative PCR en temps réel sur iCycler MyiQ Real Color système unique de détection par PCR en temps. Charge en triple sur une plaque de 96 puits avec 1 échantillon d'ADNc ul, TaqMan Gene Expression Master Mix, essai TaqMan Gene Expression de la caspase 3, selon les instructions pour la fabrication. Charge en triple sur une autre plaque de 96 puits avec 1 échantillon d'ADNc ul, TaqMan Gene Expression Master Mix, essai TaqMan Gene Expression de 18 ans, selon les instructions pour fabriquer TaqMan Gene (Protocole de dosage Expression). Diluer en série d'une fraction d'ADNc à partir de trois choisis au hasard non exposés lentilles. Exécuter des dilutions en série avec l'ADNc à partir d'échantillons dans une plaque de 96 puits.
  5. Utilisez la méthode de la courbe standard pour la quantification des résultats. Le nombre de cycles de fluorescence de seuil est utilisé en tant que mesure de logiciel MyiQ. Une courbe d'étalonnage exprimant le nombre de cycles au seuil comme fonction de la concentration relative de calibreur est esétabli aux dilutions en série dans chaque plaque. ADNc à partir de trois échantillons non traités lentille a été utilisé pour l'étalonnage. Rapporter le nombre de cycles de seuil pour chaque échantillon à la courbe standard pour obtenir la concentration relative de l'échantillon d'ADNc mesurée. Enfin, obtenir le niveau d'expression des gènes cibles en rapportant la concentration relative de la cible d'ADNc pour les 18 ADNc de contrôle interne.

4. Coloration immunohistochimique

  1. Fixation
    1. Disséquer l'œil dans du PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,4).
    2. Mettez l'oeil dans un tube rempli avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans le froid de la glace pendant 20 min. Préparer PFA 4% la veille. Stocker à +4 ° C jusqu'à utilisation. PFA est frais pendant environ une semaine.
    3. Retirer PFA avec une micropipette. Ensuite, laver avec du PBS glacé pendant 20 min.
    4. Mettez l'œil de saccharose à 30% à +4 ° C pendant la nuit.
    5. Mettez l'oeil dans une tasse remplie avec la température de coupe optimale (PTOM) à moyenne (Tissue-Tek). Mettez l'œil dans une position appropriée pour la coupe.
    6. Congeler dans OCT-support de la glace sèche.
    7. Conserver à -70 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Sectionnement
    1. Positionnez l'œil pour cryo-coupe dans un plan approprié.
    2. Couper trois 5 um d'épaisseur à mi-sagittal articles à partir d'une partie centrale de chaque lentille. Rejeter au moins 6 sections entre les sections successives pour éviter de tacher les mêmes noyaux dans des sections différentes.
    3. Une fois qu'un article a été coupé, placez délicatement une lame sur le dessus de celui-ci. La section devrait alors s'en tenir à la diapositive.
    4. Laisser les lames sécher à l'air avant de l'utiliser. Les diapositives peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation.
  3. Fluorescence immunohistochimie
    1. Laissez échantillons atteindre la température ambiante (5-10 min).
    2. Dessinez bords autour des spécimens avec un PAP-stylo (Invitrogen).
    3. Laissez la frontière sec pendant un certain temps (10 min).
    4. Étiqueter les lames de microscope.
    5. Réhydrater dans 1 x PBS pendant 15 min.
    6. Perméabiliser en solution standard de bloc de 30 min.
    7. Ajouter l'anticorps primaire (anticorps polyclonal de lapin, la caspase-3 clivée anticorps Asp175 9661; Technologie Signalisation cellulaire, Inc) dilué dans une solution de 1:3,000 bloc standard.
    8. Conserver dans une chambre humidifiée à +4 ° C pendant la nuit.
    9. Laver dans du PBS par pipetage (3 x 5 min) ou par trempage dans un bain de grande taille (> 15 min, 1-2 changements).
    10. Ajouter anticorps secondaire (anticorps de lapin anti secondaire avec un spécifique d'absorption / émission de spectre) dilué 1:300 dans la solution de bloc standard.
    11. Laver dans du PBS par pipetage (3 x 5 min) ou par trempage dans un bain de grande taille (> 15 min, 1-2 changements).
    12. Essuyez PAP-stylo frottis.
    13. Stocker dans une chambre humide à température ambiante pendant 3 heures. Éviter l'exposition à la lumière.
    14. Ajouter une goutte de Vectashield et placer une lamelle sur la lame. Évitez de faire des bulles.
    15. Laisser durcir Vectashield (~ 20 min).
    16. Gardez sections in l'obscurité jusqu'à l'analyse.
    17. Toutes les sections de commande sont traités en l'absence de l'anticorps primaire.
    18. Recherchez les résultats dans quelques heures sous un microscope à fluorescence.
    19. Compter les noyaux des cellules épithéliales chez un arceau latéral nucléaire à arc autre côté de chaque lentille nucléaire. Appliquer le filtre bleu standard pour voir tous les noyaux épithéliales du cristallin en bleu et un filtre standard qui correspond à l'émission de l'anticorps secondaire pour voir la caspase-3 noyaux positifs en vert.
    20. Notez le nombre de tous les noyaux lentille épithéliale et le nombre de noyaux positifs. Compter les cellules trois fois pour chaque section.

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Representative Results

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Les différentes sources de variation dans les mesures ont été estimés par une analyse de variance et il a été constaté que, compte tenu trois mesures par animal pour les mesures de la variance était de l'ordre de 15% de celui des animaux. Ainsi, compte tenu de l'analyse lentille entière, il n'est pas possible d'augmenter la précision. Test orthogonal élucidé un contraste statistiquement significative de la caspase-3 messages entre 120 intervalle de latence par rapport h des intervalles de latence nettement réduits.

In vivo induit l'exposition aux rayons UV caspase-3 expression.

Figure 1
Figure 1. Schéma de l'écoulement de l'exposition à un rayonnement ultraviolet.

Figure 2
Figure 2. Evolution de la caspase-3 expression de l'ARNm (casp3) dans le cristallin après exposition in vivo à 1 kJ / m 2 UV à 300 nm. Les barres d'erreur correspondent à des intervalles de confiance à 95% pour le ratio moyen de casp3 mRNA/18s ARNr entre l'objectif exposé et non exposé objectif controlatéral. Les moyens, au-dessus et au-dessous de la ligne noire au 1 rel. unité, elles représentent respectivement vers le haut et vers le bas la régulation du gène casp3.

Figure 3
La figure 3. Caspase-3 expression (A) en une lentille exposée, 24 heures après l'exposition et (B) dans un objectif de non-exposée. Les flèches indiquent les cellules marquées.

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Discussion

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Cet article décrit les méthodes qui permettent à étudier les événements moléculaires qui se produisent au cours de rayons UV-B induite par la cataracte.

Considérant que la plupart des informations disponibles pour in vivo induite par les rayons UV de la cataracte a été dérivée à partir d'expériences sur les albinos Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, nous avons décidé d'utiliser l'albinos Sprague-Dawley rats dans l'étude actuelle. Âge des rats était de six semaine auparavant. Le sexe a été choisi pour être une femme parce que, contrairement aux hommes, les femmes ont moins d'urine allergène. En outre, il n'existe pas de différence de sexe par rapport à la gravité de la cataracte induite par les rayons UV 20.

Tous les animaux ont été gardés et traités conformément à la Déclaration ARVO pour l'utilisation des animaux en recherche sur la vision et ophtalmologie. L'autorisation éthique a été obtenue à partir de l'expérimentation animale Uppsala comité d'éthique, le numéro de protocole C 29/10. Les rats sont obtenus à partir d'un éleveur commercial (Taconic, Danemark).

tente "> Une source de rayons UV à bande étroite a été choisi pour que le rayonnement UV à spectre bien défini. sensibilité maximale de l'objectif rat aux rayons UV-B est d'environ 300 nm. La dose de 1 kJ / m 2 a été choisie pour être inférieure à la dose seuil 15. Le temps d'exposition de 15 min a été choisi pour induire un maximum de dommages à la lentille 21. La dose d'exposition aux rayons UV-B et post-exposition délai peut varier en fonction de la conception expérimentale.

Oeil organe pair a son avantage en termes de statistiques et d'éthique dans l'utilisation des animaux en recherche. Exposition unilatérale de l'œil permet d'utiliser un côté comme exposée et d'un autre côté que le contrôle chez un animal donc il réduit le nombre d'animaux de moitié par rapport à un organe non apparié.

Dans ce protocole, nous avons utilisé l'anesthésie en tant que méthode pour l'immobilisation des animaux. Cependant, autre alternative, rat restrainer 13, que nous avons conçu dans notre laboratoire, peut être utilisé pour l'immobilisation des animaux non anesthésiés. Rats doivent être conditionnés à le limiteur de rat avant l'exposition aux UV. Ce dispositif permet ainsi le contrôle des expositions répétées lorsque l'anesthésie n'est pas recommandée en raison de ses effets secondaires. Ici, nous avons utilisé le limiteur de rat comme un dispositif de positionnement et de maintien des animaux anesthésiés.

Le dispositif de retenue rat est en bois et est disponible en plusieurs éléments dans notre laboratoire. Nous nettoyons notre dispositif de retenue avant chaque animal est placé sur celui-ci. Blocs de bois, gouttières et des abris en bois sont utilisés comme enrichissement dans les cages de rats. Cet enrichissement est approuvé par l'expérimentation animale Uppsala comité d'éthique et Fédération des associations européennes de laboratoire Sciences de l'Animal (FELASA).

L'objectif doit être disséqué dans BSS en peu de temps (5-10 minutes). Cette restriction permet à la lentille de rester clair et transparent.

qRT-PCR

Le temps de 30 min pour maintenir la lentille dans le tampon de lyse est en RA1ough de perturber la capsule du cristallin et le cortex. Le noyau du cristallin reste difficile dans les 30 minutes. Le noyau du cristallin, ou une zone exempte d'organite est considérée comme une transcription partie non active de la lentille. Par conséquent, le noyau est enlevé de l'échantillon afin d'augmenter le rapport signal / bruit expression d'ARNm.

L'amorce d'ADN spécifique utilisé pour la pureté ARN (absence d'ADN) de contrôle a été choisi arbitrairement comme p53-amorce. Toutes les séquences qui se produisent généralement codées de l'ADN du génome de l'animal particulier peut être choisi. Ces deux objectifs ont été analysés par PCR pour 10 animaux par intervalle post-exposition et pour chaque objectif, la caspase-3 contenu en ARN a été déterminée dans trois mesures indépendantes.

RT-PCR permet de mesurer l'ARNm d'intérêt. La transcriptase inverse convertit l'ARNm en ADN complémentaire qui est ensuite amplifié par PCR. Les mesures ont été quantifiés à l'aide de la courbe étalon obtenue en amplifiant les échantillons dilués en série de l'ADNc de l'interest. Les avantages de l'application d'une courbe standard est que la courbe standard fournit un moyen fiable pour calculer l'incertitude de la concentration, et que la courbe standard fournit des mesures quantitatives de l'ARNm d'intérêt. En variante, la teneur relative de l'ARNm d'intérêt peut être estimée en comparant directement le nombre de cycles nécessaires pour obtenir un signal de fluorescence normalisée, la méthode Ct-. Le principal inconvénient de la courbe d'étalonnage est qu'il nécessite l'utilisation de plusieurs produits génomiques que la méthode Ct.

Coloration immunohistochimique

L'immunohistochimie a été utilisée pour étudier la distribution spatiale de la caspase-3 dans les cellules épithéliales du cristallin.

Les yeux ont été immédiatement congelés à -70 ° C pour arrêter tous biochimie en cours. Les yeux ont ensuite été conservés à la même température pour la conservation.

Immunohistochimie est associé à deux pro généraleblèmes, la spécificité de l'anticorps primaire et liaison non spécifique de l'anticorps. L'anticorps doit être acquise auprès d'une source bien contrôlée, garantissant ainsi la spécificité. Si possible, les tissus contenant l'épitope doivent être colorés comme témoin positif. Pour outrule coloration non spécifique, si possible, l'épitope doit être bloquée avant que la coloration avec l'anticorps, spécifique de contrôle négatif. En outre, la coloration non spécifique peut être minimisé en instituant la concentration d'anticorps optimal et temps de réaction. Par coloration à la fois des tissus exposés à des rayons UV et des tissus non exposés aux rayons UV, il est possible d'établir l'épitope induite par les rayons UV, voici la caspase-3. Pour faciliter le comptage des cellules exprimant caspapse-3 signal de l'image microscope à fluorescence a été enregistré numériquement. Afin de minimiser les variations du bruit de fond, nous avons utilisé les paramètres fixes pour toutes les photographies au microscope.

L'intensité du signal de fluorescence de fond varie sur une continuous échelle. Par conséquent, un seuil significatif pour la coloration doit être réglé. Cependant, la fluorescence moyenne peut varier dans l'espace intérieur de la section observé ce qui rend difficile d'utiliser un seuil absolu pour la coloration importante. Par conséquent, généralement le jugement de la coloration spécifique repose sur un observateur expérimenté et le résultat absolu de la coloration spécifique dépend de l'opinion de l'observateur expérimenté, mais seront conformes à cet observateur. Pour cette raison, seul un observateur expérimenté a été utilisé. Pour améliorer le rapport signal causée par la variable, l'exposition aux rayons UV expérimentale, par rapport au bruit, à la photographie de chaque section a été compté trois fois.

Si possible, l'immunohistochimie doit être vérifiée par western blot confirmant ainsi l'existence d'épitopes avec la taille moléculaire attendue.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Karolinska Institutet KID-financement, Autorité suédoise de protection contre les radiations, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Saint-Erik Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

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References

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Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

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