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Medicine

Caratterizzazione dei meccanismi molecolari di doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo. Radiazione ultravioletta solare (UVR) è il principale fattore di rischio per lo sviluppo della cataratta. Un modello animale di gran lunga raggi UV-B indotta da cataratta è stato sviluppato. In questo articolo si descrivono i metodi di indagine della cataratta: l'esposizione a raggi UV, RT-PCR e immunoistochimica.

Abstract

La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo 1. L'Organizzazione Mondiale della Sanità definisce cataratta come una opacità del cristallino dell'occhio che impedisce il trasferimento della luce. La cataratta è una patologia multifattoriale associata al diabete, il fumo, le radiazioni ultraviolette (UVR), alcool, radiazioni ionizzanti, gli steroidi e l'ipertensione. Vi è una forte evidenza sperimentale 2-4 e 5,6 epidemiologica che UVR causa della cataratta. Abbiamo sviluppato un modello animale per UVR B cataratta indotta sia anestetizzati 7 e non animali anestetizzati 8.

L'unica cura per la cataratta è l'intervento chirurgico, ma questo trattamento non è accessibile a tutti. È stato stimato che un ritardo di insorgenza della cataratta per 10 anni potrebbe ridurre la necessità di chirurgia della cataratta del 50% 9. Per ritardare l'incidenza di cataratta, è necessario per comprendere i meccanismi di formazione della cataratta e trovare strategia efficace di prevenzionegie. Tra i meccanismi di sviluppo della cataratta, apoptosi svolge un ruolo cruciale nella apertura di cataratta nell'uomo e negli animali 10. La nostra attenzione è stata recentemente apoptosi nella lente come meccanismo per la cataratta sviluppo 8,11,12. Si prevede che una migliore comprensione dell'effetto della UVR sul percorso apoptosi fornirà possibilità per la scoperta di nuovi farmaci per prevenire la cataratta.

In questo articolo, si descrive come la cataratta può essere indotta sperimentalmente dalla esposizione in vivo a raggi UV-B. Inoltre RT-PCR e immunoistochimica sono presentati come strumenti per lo studio dei meccanismi molecolari di raggi UV-B indotta da cataratta.

Protocol

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1. L'esposizione alle radiazioni ultraviolette

  1. 15 minuti prima dell'esposizione, anestetizzare una femmina Sprague-Dawley di ratto con una miscela di 90 mg / kg Ketalar (ketamina) e 10 mg / kg Rompun (xilazina) mediante iniezione intraperitoneale.
  2. Posizionare l'animale in un dispositivo di immobilizzazione ratto e tendere le cinghie fino immobilizzazione del ratto senza provocare una compressione del tronco 13.
  3. Instillare Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, in entrambi gli occhi di ratto per indurre midriasi.
  4. Posizionare l'animale in modo che un occhio è posizionato contro un fascio di raggi UV a 300 nm 14 con larghezza di 10 nm a metà del massimo e schermare l'occhio controlaterale con nastro nero.
  5. Esporre il ratto unilateralmente sub-dose soglia 1 kJ / m 2 raggi UV-B a 300 nm per 15 min 15.

2. Dissezione

  1. Dopo intervallo predeterminato post esposizione (1, 5, 24 e 120 ore), sacrificare il topo sei settimane di età (peso <200 g) da carbon biossido di asfissia e dislocazione delle vertebre cervicali.
  2. Enucleare gli occhi. Successivamente, inserire la cornea degli occhi verso il basso, lato posteriore in alto. Poi, un buco minima applicando una cannula 27 gauge e spingere tangenzialmente alla sclera per evitare di danneggiare la lente che è molto vicino alla sclera. Quindi utilizzare un paio di forbici per tagliare chirurgia oftalmica circonferenzialmente appena dietro il limbus finché la parte posteriore della sclera può essere sollevato. Quindi, sollevare la lente con una pinza contundenti curve.
  3. Rimuovere residui del corpo ciliare dall'equatore lente al microscopio, mantenendo la lente in soluzione salina bilanciata di non più di 5-10 minuti.

3. RT-PCR quantitativa

  1. Inserire un obiettivo in una miscela di 350 microlitri RA1 tampone di lisi (II NucleoSpin RNA totale isolamento dell'RNA kit) e 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo in una provetta Eppendorf da 2 ml.
  2. Mantenere l'obiettivo in questa miscela per 30 min a temperatura ambiente.
  3. Omogeneizzare la lente conun ago fino solo nucleo duro della lente viene lasciata dalla lente (corteccia e della capsula della lente vengono lisate in tampone di lisi). Rimuovere il nucleo dal mix.
  4. Conservare i campioni immediatamente a -70 ° C.
  5. Scongelare i campioni e seguire la "purificazione RNA totale da cellule in coltura e tessuti" protocollo (NucleoSpin RNA II RNA totale Kit di isolamento).
  6. Conservare i campioni di RNA a -70 ° C.
  7. Per verificare sufficiente asportazione di DNA da ogni campione, eseguire una PCR nelle seguenti condizioni (passo 1: 95 ° C per 2 min; step 2 per 40 cicli: 95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 20 sec; passaggio 3: 72 ° C per 7 min) con primers specifici DNA di p53, forward 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'e 5'-inversa TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' e la DNA polimerasi Taq (dNTPack), secondo la fabbricazione protocollo. Il prodotto di PCR previsto è lungo 243 coppie di basi.
  8. Eseguire un 1,5% elettroforesi su gel di agarosio per rilevare il DNA specifico prodotto di PCR di 243 paia di basi. Per preparare1,5% gel di agarosio in tampone TBE tener 3,75 g di agarosio e risolvere in 250 ml di tampone TBE. Aggiungi etidio bromuro (0,5 mg / ml) 500 microlitri in 500 ml di soluzione 1,5% gel di agarosio. Riscaldare il miscuglio in un forno a microonde e mescolare per risolvere l'agarosio.

Nessuno dei campioni deve rivelare eventuali specifiche di DNA prodotti PCR su 1,5% gel di agarosio.

  1. Misurare la concentrazione di campioni di RNA (1 microlitri) e il rapporto di assorbanza del campione a 260 nm (RNA) e 280 nm (proteina) in una NanoDrop ND-1000 spettrofotometro. Se l'RNA rapporto alle proteine ​​di densità ottica dei campioni di RNA è di 2,0 o più, quindi il campione di RNA è puro. Se il rapporto di assorbanza del campione RNA è inferiore a 2,0, ripetere RNA purificazione 3,5.
  2. Prendere un volume di campione di RNA corrispondenti a 1 ug e sintetizzare cDNA seguito Kit 1 Strand protocollo di sintesi di cDNA st (1 st Strand cDNA Kit sintesi per RT-PCR).
  3. Conservare campioni di cDNA a -20 ° C(Per un periodo di 1 o più anni, conservare a -70 ° C).
  4. Eseguire quantitativa real-time PCR su iCycler Colore unico MyiQ sistema in tempo reale di rilevamento PCR. Triplica carico su piastra a 96 pozzetti con 1 campione microlitri di cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay per caspasi 3, secondo le istruzioni fabbricazione. Carico triplica su un'altra piastra a 96 pozzetti con 1 campione microlitri di cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, saggio TaqMan Gene Expression per minori di 18 anni, secondo le istruzioni per la produzione (Protocollo TaqMan Gene Expression Assay). Diluire in serie una frazione di cDNA da tre scelte a caso non esposti lenti. Eseguire diluizioni seriali insieme con il cDNA da campioni in una piastra a 96 pozzetti.
  5. Utilizzare il metodo standard della curva per la quantificazione dei risultati. Il numero di cicli a fluorescenza soglia viene utilizzata come misura nel software MyiQ. Una curva standard che esprime il numero di cicli al livello di soglia in funzione della concentrazione relativa di calibratore è esnoltre stabilito per le diluizioni seriali in ogni piatto. cDNA da tre campioni non trattati lente è stato utilizzato per la calibrazione. Riguardano il numero di cicli di soglia per ciascun campione per la curva standard per ottenere la concentrazione relativa del campione di cDNA misurata. Infine, ottenere il livello di espressione dei geni bersaglio mediante la relativa concentrazione relativa del bersaglio cDNA ai 18s controllo interno cDNA.

4. Colorazione immunoistochimica

  1. Fissazione
    1. Staccare l'occhio in PBS (tampone fosfato salino, pH 7,4).
    2. Messo l'occhio in un tubo riempito con 4% paraformaldeide (PFA) in freddo ghiaccio per 20 min. Preparare PFA 4% il giorno prima. Conservare a +4 ° C fino all'uso. PFA è fresco per circa una settimana.
    3. Rimuovere PFA con una micropipetta. Poi, lavare con PBS freddo ghiaccio per 20 min.
    4. Mettere l'occhio in saccarosio 30% a +4 ° C durante la notte.
    5. Mettere l'occhio in una tazza piena di temperatura di taglio ottimale (OCT)-medio (Tissue-Tek). Messo l'occhio in una posizione adatta per il sezionamento.
    6. Congelare in OCT-media a ghiaccio secco.
    7. Conservare a -70 ° C fino all'uso.
  2. Sezionamento
    1. Posizionare l'occhio per la crio-sezionamento in un piano adeguato.
    2. Tagliare tre 5 micron di spessore sagittale sezioni da una porzione centrale di ciascuna lente. Scartare almeno 6 sezioni tra sezioni sequenziali per evitare di macchiare i nuclei stessa in diverse sezioni.
    3. Una volta che una sezione è stata tagliata, delicatamente posizionare un vetrino su di esso. La sezione deve quindi attenersi alla diapositiva.
    4. Lasciare i vetrini asciugare all'aria prima dell'uso. Vetrini possono essere conservati a -20 ° C fino all'utilizzo.
  3. Fluorescenza immunoistochimica
    1. Lasciate che i campioni raggiungere temperatura ambiente (5-10 minuti).
    2. Disegnare bordi attorno ai campioni con un PAP-pen (Invitrogen).
    3. Lasciate che il confine a secco per un po '(10 min).
    4. Etichettare i vetrini da microscopio.
    5. Reidratare in 1 × PBS per 15 min.
    6. Permeabilize in soluzione standard di blocco per 30 min.
    7. Aggiungere l'anticorpo primario (policlonale di coniglio, spaccati caspasi-3 anticorpo Asp175 9661; segnalazione Cell Technology, Inc) diluito 1:3000 in soluzione standard di blocco.
    8. Conservare in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte.
    9. Lavare in PBS pipettando (3 × 5 min) o immergendolo in un bagno di grandi dimensioni (> 15 min, 1-2 modifiche).
    10. Aggiungi anticorpo secondario (anticorpo di coniglio anti secondaria con un assorbimento specifico / spettro di emissione) diluito 1:300 nella soluzione standard di blocco.
    11. Lavare in PBS pipettando (3 × 5 min) o immergendolo in un bagno di grandi dimensioni (> 15 min, 1-2 modifiche).
    12. Pulire PAP-penna strisci.
    13. Memorizzare in una camera umidificata a temperatura ambiente per 3 ore. Evitare l'esposizione alla luce.
    14. Aggiungere una goccia di Vectashield e mettere un coprioggetto sul vetrino. Evita di fare le bolle.
    15. Lasciare indurire Vectashield (~ 20 min).
    16. Tenere sezioni in al buio fino al momento dell'analisi.
    17. Tutte le sezioni di controllo vengono elaborati in assenza di anticorpo primario.
    18. Cercare i risultati in poche ore sotto un microscopio a fluorescenza.
    19. Contare nuclei delle cellule epiteliali 'da un fiocco laterale nucleare a prua dall'altra parte nucleare di ogni lente. Applicare il filtro blu standard per vedere tutte nuclei epiteliale lente in blu e un filtro standard che si inserisce l'emissione dell'anticorpo secondario per vedere la caspasi-3 nuclei positivi in ​​verde.
    20. Registrare il numero di tutti i nuclei lente epiteliale e il numero di nuclei positivi. Contare le cellule tre volte per ogni sezione.

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Representative Results

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Le varie fonti di variazione delle misurazioni sono stati stimati con l'analisi della varianza e si è constatato che, considerando tre misurazioni per animale, la varianza per misure era dell'ordine del 15% di quella per gli animali. Pertanto, considerando intera analisi lente, non è possibile aumentare la precisione. Test ortogonale chiarito un contrasto statisticamente significativo per la caspasi-3 messaggio tra 120 intervallo di latenza ore rispetto intervalli di latenza inferiori.

In esposizione in vivo raggi UV induce espressione di caspasi-3.

Figura 1
Figura 1. Schema del flusso di esposizione alla radiazione ultravioletta.

Figura 2
Figura 2. Evoluzione della caspasi-3 (CASP3) espressione di mRNA nella lente cristallina dopo l'esposizione in vivo a 1 kJ / m 2 raggi UV a 300 nm. Le barre di errore sono gli intervalli di confidenza al 95% per il rapporto medio di CASP3 mRNA/18s rRNA tra l'obiettivo esposti e controlaterale obiettivo non esposti. I mezzi, sopra e sotto la linea nera a 1 rel. unità, rispettivamente, rappresentano up-e down-regolazione del gene CASP3.

Figura 3
Figura 3. Caspasi-3 espressione (A) in una lente esposta, 24 ore dopo l'esposizione e (B) in un non esposto lente. Le frecce indicano cellule marcate.

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Discussion

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Questo articolo descrive i metodi che consentono di studiare gli eventi molecolari che si verificano durante raggi UV-B indotta da cataratta.

Considerando, che più le informazioni disponibili in vivo UVR cataratta indotta è stato derivato da esperimenti su albino Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, abbiamo deciso di utilizzare l'albino ratto Sprague-Dawley nel presente studio. Età dei ratti aveva sei settimana fa. Il genere è stato scelto per essere femminile perché, in contrasto con i maschi, le femmine hanno l'urina meno allergizzanti. Inoltre, non vi è alcuna differenza di genere in relazione alla gravità della cataratta indotta UVR 20.

Tutti gli animali sono stati mantenuti e trattati conformemente alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nel Oftalmica e Vision Research. Consenso etico è stato ottenuto dalla Uppsala Animal Experiments Comitato Etico, numero di protocollo C 29/10. I ratti sono ottenuti da un allevatore commerciale (Taconic, Danimarca).

tenda "> Una fonte UVR banda stretta è stata scelta in modo che la UVR da spettralmente ben definito. sensibilità massima della lente di ratto UVR-B è di circa 300 nm. La dose 1 kJ / m 2 è stato scelto per essere al di sotto della dose soglia 15. Il tempo di esposizione di 15 minuti è stato scelto per indurre massimo danno alla lente 21. La dose di esposizione a raggi UV-B e post-esposizione tempo può variare a seconda del disegno sperimentale.

Occhio organo accoppiato ha il suo vantaggio in termini di statistiche e di etica in uso di animali nella ricerca. Esposizione unilaterale degli occhi consente di utilizzare una parte come esposti e un altro lato, come controllo in un animale così si riduce il numero di animali della metà rispetto ai organo spaiato.

In questo protocollo abbiamo usato anestesia come metodo per l'immobilizzazione degli animali. Tuttavia, altra alternativa, ratto restrainer 13, che abbiamo progettato nel nostro laboratorio, può essere utilizzato per l'immobilizzazione degli animali unanaesthetized. Rats devono essere condizionati a il limitatore ratto prima della esposizione ai raggi UV. Questo dispositivo permette di ben controllati esposizioni ripetute quando l'anestesia non è raccomandato a causa dei suoi effetti collaterali. Qui, abbiamo usato il limitatore ratto come un dispositivo di posizionamento e svolgimento per animali anestetizzati.

Il restrainer ratto è in legno ed è disponibile in diversi elementi nel nostro laboratorio. Puliamo il nostro dispositivo di ritenuta prima di ogni animale è posizionato su di esso. Blocchi di legno, grondaie e rifugi in legno sono utilizzati come arricchimento nelle gabbie ratto. Tale arricchimento è approvato da Animal Experiments Uppsala Comitato Etico e la Federazione delle associazioni scientifiche europee di laboratorio sugli animali (FELASA).

La lente deve essere sezionato in BSS in breve periodo di tempo (5-10 minuti). Questa restrizione consente l'obiettivo di rimanere chiaro e trasparente.

qRT-PCR

Il tempo di 30 min per mantenere la lente nel tampone di lisi RA1 è enough di interrompere la capsula del cristallino e la corteccia. Il nucleo della lente rimane difficile in 30 minuti. Il nucleo della lente, o organello zona libera è considerato un non-parte attiva trascrizione della lente. Pertanto, il nucleo viene rimosso dal campione per aumentare il rapporto segnale / rumore espressione di mRNA.

Il primer DNA specifico utilizzato per la purezza dell'RNA (assenza di DNA) controllo è stato selezionato per essere arbitrariamente p53-primer. Tutte le sequenze che si verificano generalmente codificati di DNA del genoma animale particolare potrebbe essere scelto. Entrambe le lenti sono state analizzate con PCR per 10 animali per post-esposizione intervallo e per ogni lente, caspasi-3 contenuti RNA è stato determinato in tre misurazioni indipendenti.

RT-PCR consente di misurare l'mRNA di interesse. La trascrittasi inversa converte mRNA nel DNA complementare che viene poi amplificato mediante PCR. Misurazioni sono state quantificate usando la curva standard ottenuta amplificando campioni diluiti serialmente del cDNA di intcresta. I vantaggi di applicare una curva standard sono che la curva standard fornisce un modo affidabile per calcolare l'incertezza della concentrazione, e che la curva standard fornisce misurazioni quantitative del mRNA di interesse. In alternativa, il contenuto relativo del mRNA di interesse può essere stimata confrontando direttamente il numero di cicli necessari per ottenere un segnale di fluorescenza normalizzato, il Ct-metodo. Il principale inconveniente della curva di calibrazione è che richiede l'utilizzo di più prodotti genomici rispetto al metodo Ct.

Colorazione immunoistochimica

L'immunoistochimica è stata utilizzata per studiare la distribuzione spaziale dei attiva caspasi-3 nelle cellule epiteliali lente.

Gli occhi sono stati immediatamente congelati a -70 ° C per arrestare tutti biochimica in corso. Gli occhi sono stati quindi conservati alla stessa temperatura per la conservazione.

Immunoistochimica è associato a due generale problemi, la specificità dell'anticorpo primario e non legame specifico dell'anticorpo. L'anticorpo deve essere acquisita da una fonte ben controllata, garantendo così la specificità. Se possibile, il tessuto contenente l'epitopo dovrebbe essere trattata come controllo positivo. Per outrule marcatura non specifica, se possibile, l'epitopo deve essere bloccato prima colorazione con l'anticorpo specifico, controllo negativo. Inoltre, la colorazione non specifica può essere minimizzata stabilire la concentrazione ottimale di anticorpi e tempo di reazione. Dalla colorazione del tessuto sia esposto a UVR e tessuti non esposto a UVR, è possibile stabilire la UVR indotta epitopo, qui caspasi-3. Per facilitare il conteggio di cellule esprimenti caspapse-3 segnale dell'immagine microscopio a fluorescenza è stata registrata digitalmente. Per minimizzare variazione del rumore di fondo, abbiamo utilizzato impostazioni fisse per tutte fotografie al microscopio.

L'intensità del segnale di fluorescenza di base varia in una coscala continua che. Pertanto, una soglia per la colorazione significativa deve essere impostato. Tuttavia, la fluorescenza media può variare spazialmente all'interno della sezione osservato che rende difficile utilizzare una soglia assoluta per la colorazione significativa. Pertanto, di solito il giudizio di colorazione specifica si basa su di un osservatore esperto e l'esito assoluto della colorazione specifica dipende dal parere del osservatore esperto, ma sarà coerente per questo osservatore. Per questo motivo, un osservatore esperto è stato utilizzato. Per migliorare il segnale causata dalla variabile sperimentale, l'esposizione a raggi UV, rispetto al rumore, la fotografia di ogni sezione è stato contato tre volte.

Se possibile, l'immunoistochimica vanno verificate mediante western blot che conferma l'esistenza di epitopi con la dimensione molecolare atteso.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Karolinska Institutet KID-finanziamento, Autorità svedese per la protezione dalle radiazioni, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Occhio di St. Erik Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

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References

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Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

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