Summary
Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem tarif
Abstract
Ventral orta beyin kontrolü hareketi bulunan dopaminerjik nöronlar, duygusal davranış ve ödül mekanizmaları 1-3. Ventral orta beyin dopaminerjik nöronların disfonksiyon, Parkinson hastalığı, şizofreni, depresyon, demans ve 1-5 rol oynar. Böylece, orta beyin dopaminerjik nöron farklılaşma yönetmelik okuyan orta beyin gelişimi ve nöral progenitör kaderi özellikleri düzenleyen mekanizmalar çok önemli ipuçları sadece sağlamaz, ama aynı zamanda insan nörolojik bozukluklar çeşitli tedavisi için yeni tedavi stratejileri geliştirmelerine yardımcı olur.
Dopaminerjik nöronların embriyonik ventral orta beyin içinde, ventriküler zon döşeyen sinirsel öncü hücrelerden ayırt. Sinir progenitörlerin gelişimi gen ifadesi programları 6,7 tarafından kontrol edilir. Burada (th Hamburger Hamilton (HH) evre 11 Ortabeyin özellikle genleri ifade elektroporasyon kullanan teknikleri raporirteen Somitlerin, 42 saat) civciv embriyolarının 8,9. Civciv embriyo gelişimi dış sonraki gelişim zaman noktalarında 10-13 belirlenen etkileri ile özgün embriyonik aşamalarında uygun deneysel manipülasyonlar, sağlar. Erken evre HH 13 (ondokuz Somitlerin, 48 saat) daha Chick embriyonik nöral tüp sinir sisteminin farklı hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptirler multipotent nöral progenitörlerin oluşur. Bir CMV organizatörü ve bir civciv β-aktin artırıcı hem de içeren pCAG vektör, Bayrak veya embriyonik civciv nöral tüp 14 diğer epitop etiketli yapıları sağlam bir ifade verir. Bu yazıda, DNA embriyonik Ortabeyin bölgeye özel olarak inşa ve nasıl küçük ısmarlama elektrotlar ile elektroporasyon saptamak için nasıl enjekte dahil embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron ataları, bölgesel açıdan kısıtlı gen elde etmek için özel önlemler üzerinde durulmuştur. C AnaliziDaha sonraki aşamalarda hödük Ortabeyin plazmid vektör aracılı kazanç fonksiyon-ve orta beyin gelişimi kaybı fonksiyon-çalışmaları için in vivo sistemde mükemmel bir sağlar. Deneysel sistem modifikasyonu kaderi haritalama analizi gerçekleştirmek için ve gen ifadesinin düzenlenmesinde araştırmak için sinir sisteminin diğer bölümlerine tahlil uzatabilir.
Protocol
1. (Değil video) Hazırlık Tedarik
- 1X PBS içinde Penisilin / Streptomisin (Kalem / Strep) taze bir 1X seyreltme hazırlayın. En fazla 50 ml gereklidir. 0.22 um bir şırınga filtresi ile filtreleme.
- Istenilen plazmid yapıları birleştirerek enjeksiyon yapıları hazırlayın. Biz, ~ 10 ul'lik bir son hacim için uygun olan stokiyometri pCAG-bayrak vektör içinde hepsi yapıları koydu. Ayrıca, pCAG-GFP 14 ya pCAG-mCherry izleme elektroporasyon verimliliği ve electroporated hücreleri için ilave edilmelidir. Bu deney için pCAG-mCherry kullanın. Son olarak, embriyonik chick midbrains içine enjeksiyon verim görselleştirme% 0.05 nihai bir konsantrasyon plazmid DNA karışımı içine 0,22 um-süzüldü Fast Green boya ekleyin.
2. Yumurta Hazırlama (video)
- HH aşaması 11 embriyo elde etmek için, yumurta 100 inkübe edilmesi gerekir ° F (37.8 ° C)% 25-40 nem ile döllenme sonra yaklaşık 41 saat boyunca. Yerve onların tarafında yumurta bir kalemle çizgi ile her üst işaretleyin. Bir önceden ısıtılmış, nemlendirilmiş inkübatörde tepsiler yerleştirin. Yavaşça için inkübatör platformları dönüm işlevini ayarlayarak yumurta sallayın "Otomatik". Nem ve su seviyesi her 24 saatte bir kontrol edin.
- Sağ deney başlamadan önce, kuluçka yumurta çıkarıp oda sıcaklığında bekletin. Bu gelişme yavaşlatmak ve kalkınma üzerinde önlemek için yardımcı olacaktır.
- % 70 etanol ile her yumurta yüzeyi temizleyin ve bir Kimwipe ile silin.
- Seloteyip iki adet 4 cm al ve kalemle çizgi üzerinde büyük bir dikdörtgen yapmak için yumurta bunları yan yana sopa. Yumurta karşı bant Pürüzsüz. Penceresi yapılacaktır yerdir. Bant pencere açık kesildiğinde kapalı düşmesini kabuğu küçük parçalar önleyecektir.
- 10 ml şırınga ve 18 ½ yumurta albümin üzerinden 5 ml çizmek için iğne kullanın. Rahatsız etmek gibi kabuğu delip sonra sarısı uzak iğne açıalbümin çıkarırken ya da embriyo zarar verebilir. Yumurtalar arasındaki% 70 etanol ile iğne temizleyin, ancak iğne sonraki yumurtaya delerek önce kuru olduğundan emin olun.
3. Cam Enjeksiyon İğnesi Hazırlama (video)
- Enjeksiyon iğne aşağıdaki ayarları kullanarak yapılan bir Kahverengi Mikropipet Çektirme (Sutter Enstrüman Model P-97) / Flaming: Isı 670, Pull 120, Vel 40, Zaman 165. Dünya Precision Instruments (API) 4 inç 1.0 mm cam kılcal ince duvarlı (API TW100F-4) iğneler hale getirmek için kullanılır.
- Bir P10 pipet ve uzun ucu kapiller yükleme pipet (Eppendorf 5.242.956,003) kullanarak çekti cam iğne yükleyin. Enjekte edilecek kaç yumurta bağlı olarak, 5-10 uL yükleyin. Hava kabarcıklarının yokluğu plazmid çözeltisi sürekli bir sütun oluşturarak, yavaş cam iğne doldurun.
- Mikromanipülatör (Narishige mm3) ve Picospritzer III mikroenjektör bağlı iğne tutucuya yüklenen iğne yerleştirin. Bir dissecti altında iğne görüntülemekmikroskop ve yeşil sıvı durur noktada iğne kırpın. Daha iyi iğne görselleştirmek için karanlık bir arka plan kullanmanıza yardımcı olur. Kırparak Uygun iğne uygulaması ile birlikte geliyor.
4. Ortabeyin / Nöral Tüp Enjeksiyon (video)
- Yumurta bir 2-2.5 cm çapında pencere kesmek için bahar makas kullanın. Albümin çizerken yapılan önceki iğne deliğinden pencereyi başlatın ve kesmek gibi elinizde yumurta döndürün. Yumurtalar arasındaki% 70 etanol içinde doymuş bir Kimwipe ile makas kapalı temiz emin olun.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında civciv embriyosu görüntüle. Bu gözler yetiştirmek için gerekli olabilir. Bu civciv embriyo altında PBS 0.22 um-filtre% 20 Türkiye mürekkep enjekte edilerek embriyo görselleştirmek için yardımcı olabilir. Bununla birlikte, mümkünse de sağkalım azaltma eğilimdedir olarak, bu basamak, kaçınılmalıdır olduğunu bulduk.
- Embriyo iğne yoluna paralel olarak konumlandırılmış eğer Enjeksiyon uzak iğne başı, en iyi çalışır.Yavaşça delip Ortabeyin-arka beyin kavşağına 45 derecelik bir açıyla nöral tüp. Sadece ön beyin ve arka beyin bölgeye önemli difüzyon olmadan, plazmid DNA ve Fast Green boya ile Ortabeyin temsil nöral vezikül doldurmak için çok önemlidir. 25 ms Picospritzer mikroenjektör süresini set ile enjekte başlayın; bu iğne kırparak bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Genel olarak, 10-50 ms arasında kullanılacak.
5.. Elektroporasyon (video)
- Enjeksiyon iğnesi alın. Yer embriyo üzerinde yumurta PBS çözüm 1X Kalem / Strep 3 damla.
- BTX EMC830 elektroporatörün ayarlarını da kontrol edin:
GERİLİM: 20 V PULSE UZUNLUĞU: 25 ms # BAKLİYAT: 3 ARALIK: 500 ms POLARİTESİ: - İki ayrı 3 mm elektrotlar arasındaki orta oturan embriyonik Ortabeyin ile, sinirsel tüpün alt aynı yatay bir seviyede 2 mm uzunluğunda L-şekilli platin elektrotlar yerleştirin. Nöral tüp alt ile elektrotlar hizalama ventral orta beynin verimli elektroporasyon için önemlidir. Orta beyin özel elektroporasyon başarmak için, kısa 2 mm uzunluğunda uçları ile iki ısmarlama platin L şeklinde elektrotlar ile orijinal BTX elektrotlar yerini aldı. Bu platin elektrot çapı 0.5mm platin teller (Alfa Aesar) yapılır. Bu platin elektrot yeterli uzunlukta çok ön beyin veya arka beyin bölgelerinin hedef olmadan uzun yaklaşık 0.9 mm olup, bir sahne 11 civciv embriyo, bir orta beyin fazlasını kapsamaktadır. BTX ayak pedalı bir kez basın. Hava kabarcıkları her başarılı elektroporasyon ile elektrot etrafında oluşturulmuş edilmelidir. Dikkatlice yumurtadan elektrotlar ve elektrikli silin% 70 etanol kaplı Kimwipe ile kapalı niteliğindeki dizelerde. Embriyo üzerinde yumurta 1X Kalem / Strep çözüm, başka bir 3 damla yerleştirin.
- Şeffaf koli bandı x 5 cm parça 5 cm ile pencereyi kapatın. Iyi ve yumurta mühür yumurta içeriğini bant ile temas olmadığından emin olun.
6. Inkübe ve Hasat
- Inkübatör geri yumurta yerleştirin. Inkübatör platformların dönüm kapalı olduğundan emin olun. İstenen HH aşaması 23 elde edilene kadar, yumurtalar inkübe.
- Hasat canlı embriyo ve her bir durum için ortak PBS dolu Petri içine yerleştirin. Ekran mCherry ifade ile yalnızca embriyolar tutarak, bir floresan diseksiyon mikroskop altında embriyo biçilir.
- 24-iyi çanak bireysel kuyulara embriyo transferi. Taze yapılmış% 2 paraformaldehid (PFA) ile 1 mL, her sıra doldurmak ve 4 2-3 saat sabitlemek için izin ° C.
- 10 dakika PBS içerisinde her biri için sabit bir embriyo üç kez yıkanır. Yer embriyolar sırayla in% 15 ve dengelenir kadar% 30 sakkaroz. Embriyolar ilk sakkaroz uçuyorlar, ama denge üzerine batar.
- Her embriyo için mCherry ifade desen ve düzeyde notlar alarak, bir floresan diseksiyon mikroskop altında embriyo kontrol edin. OCT her embriyo Embed. Bu şekilde sonraki analizlerde (Şekil 1) için en uygun orta beyin kesitleri oluşturmak için şark embriyo çok önemlidir.
- Leica CM3050S kriyostat kullanan 18 mikron kalınlığında orta beyin kesitler hazırlayın. Uygun hücre tipi işaretleri ile immünboyama tarafından orta beyin gelişimi ve dopaminerjik hücre farklılaşması analiz edin.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Embriyonik chick Ortabeyin electroporating ve analiz şematik bir temsilini Şekil 1 'de gösterilmiştir. Başarılı bir şekilde enjekte edilir ve electroporated civciv embriyolarının, mCherry ifadesi daha da geliştirilmesi sonra orta beyin bölgesinde görünür olmalıdır (
Yetersiz mCherry ifade ektopik genlerin olasılıkla verimli ifade olmadığını göstermektedir. Bu koşul altında Embriyolar ileri çalışmalar için kullanılmamalıdır. Benzer şekilde, embriyolardeneysel işlemin sonuna kadar ayakta kalmadı veri toplama ve analiz için kullanılamaz.
Şekil 1. Ovo elektroporasyon deneyde embriyonik civciv Ortabeyin çizimi. HH aşamada 11 embriyonik civciv embriyo (A) enjeksiyon işlemi görselleştirmek için hızlı yeşil karışık ilgi genler ile birlikte pCAG-mCherry ile enjekte edilir. DNA yapıları ile dolu sonra midbrains bir kare dalga elektroporatörün ile electroporated edilir. İstenen HH aşamada 23 ulaşılana kadar embriyolar daha inkübe edilir. Sonra mCherry pozitif embriyolar, hasat sabit ve gömülü (B) vardır. Orta beyin cryosections Şekil 1B beyaz çizgi ile gösterilen uçak kesim ile hazırlanmış ve bu Tirozin hidroksilaz (TH) (C) gibi orta beyin işaretleri ile immünboyama ile analiz edilir. tıklayınızbüyük rakam görüntülemek için.
Şekil 2,. Embriyonik chick Ortabeyin gelen cryosections hazırlanması. 41 saat inkübasyondan sonra, mCherry ve faiz genleri ifade HH aşamada 23 civciv embriyosu, PFA ile sabit sakaroz ile tedavi ve cryosectioning için OCT gömülü, (A, B ve C) hasat edilir. Chick embriyosu dikkatle Ortabeyin bölümlerin hazırlanması sağlamak üzere yönlendirilmektedir. Orta beyin bölümleri elde etmek için tipik bir embriyo morfolojisi ve kesme düzlemi (D) gösterilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. Electroporated Ortabeyin kesitler. MCherry ifade düzeyi yüksek olan embriyolardan Cryosections (A) antibod ile hazırlanan ve boyananilgi Bayrağı etiketli geni (B) ve orta beyin dopaminerjik nöron işaretleyici TH (C) kabul ler. PCAG-mCherry ve pCAG-Bayrak boş vektör kontrolü görevi ile electroporated Embriyonik midbrains. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embriyonik civciv orta beyin ve ovo elektroporasyon de düşük maliyet ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişiminde gen fonksiyonlarının in vivo çalışma gerçekleştirmek için transgenik veya bayıltıcı hayvanların nesli hızlı bir alternatif sunuyor. Embriyonik orta beyin-spesifik DNA enjeksiyonu ile birlikte kısa 2 mm L şeklinde uzun bir platin elektrot kullanarak orta beyin dopaminerjik nöron progenitörlerin ilgi geninin etkin ifadesi ulaşmak için anahtardır. Buna ek olarak, HH doğru aşamalı 11 chick embriyosu kullanılarak kritik önem taşır. İlk, HH aşamada 11 at, civciv orta beyin gelişimi ön beyin, orta beyin ve arka beyin morfolojik olarak ayırt edilebilir olması yeterli gibi gelişmiş olmasıdır. Bu enjeksiyon iğne ve elektrotlar Ortabeyin bölgede, ve böylece verimli bir DNA enjeksiyon ve Transfeksiyon doğru konumlandırılması için olanak sağlar. İkincisi, HH aşamada 11 yaşında, civciv embriyo ön neuropore henüz tamamen kapatmak değild, enjekte edilen plazmid DNA kolayca orta beyin bölgesi içine spesifik olarak girmesine izin verir. Embriyonik ön beyin, orta beyin ve arka beyin arasındaki dar kavşakları da hızlı DNA difüzyon orta beynin içine özellikle enjekte inşa önlemeye yardımcı olur. Son olarak, daha sonraki aşamalarında embriyo çok zor Ortabeyin de özellikle elektrot hedef yapmak, nöral yan başlarını kıvrılmasına eğilimindedir. 11 embriyo elde HH rijit olarak gerekli inkübasyon süresi kuluçka ısısı sapmalar yanı sıra, yumurtalar arasındaki doğal farklılıklar karşısında biraz farklılık gösterebilir. Bizim deneysel koşullar altında, 100 41 saat inkübasyon sürer ° F.
Analizi için embriyonik civciv Ortabeyin bölümleri elde etmek için, gömme ve doğru yönlendirme de midbrains kesim çok önemlidir. Kırk bir saat elektroporasyon sonra, civciv embriyosu genellikle 2D Şekil benzer bir morfolojiye sahiptir. Bir ile cryosections hazırlanmasıŞekil 2B olarak gösterilir olanları uçakla paralel kesim daha da immun ve miktar tayini için doğru orta beyin bölümlerini bulabilme şansını artırır.
Ortabeyin spesifik ektopik gen ifadesi elektroporasyon ile elde edilebilir olması, bu yaklaşım, merkezi sinir sisteminin diğer bölgeleri de uygulanabilir olması ihtimalini açılır. Enjeksiyon konumu yanı sıra elektrotların konumlandırılması, önemli ölçüde verimli bir DNA yapıları 7,15 ile transfekte edilir beyin bölgeleri etkileyebilir. Bu teknik aynı zamanda RNAi aracılı Knockdown 16 orta beyindeki belirli gen ekspresyonu azaltılmasında yararlı olabilir. Benzer şekilde, biraz değiştirilmiş teknikleri, harita, tanımlamak ve civciv genlerin yeni düzenleyici bölgeler karakterize etmek muhabiri genine bağlı arttırıcılar ifade ederek gen regülasyonu okumak için uygulanabilir. Fare embriyoları uygulandığında, bu tekniğin çok daha hızlı olurdukolay ve klasik transgenik yaklaşımlar daha kullanmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek, potansiyel hiçbir çıkar çatışmaları var.
Acknowledgments
Biz pCAG-mCherry inşa sağlamak için Dr Takahiko Matsuda teşekkür ederim. YCM Schweppe Vakfı'ndan bir Kariyer Geliştirme Ödülü ve Whitehall Foundation'ın tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
