Summary
Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che comporta
Abstract
Neuroni dopaminergici situati nel movimento mesencefalo ventrale di controllo, il comportamento emozionale e meccanismi di ricompensa 1-3. La disfunzione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale è implicata nella malattia di Parkinson, la schizofrenia, la depressione e la demenza 1-5. Così, studiando la regolazione della differenziazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo non ha potuto fornire solo informazioni importanti meccanismi che regolano lo sviluppo mesencefalo e il destino progenitrici neurali specifiche, ma anche contribuire a sviluppare nuove strategie terapeutiche per il trattamento di una varietà di malattie neurologiche umane.
Neuroni dopaminergici differenziarsi dai progenitori neurali che rivestono la zona ventricolare del embrionale mesencefalo ventrale. Lo sviluppo di progenitori neurali è controllato da programmi di espressione genetica 6,7. Qui segnaliamo che utilizzano tecniche di elettroporazione ad esprimere geni in particolare nel mesencefalo di Hamburger Hamilton (HH) stadio 11 (thsomiti irteen, 42 ore) 8,9 embrioni di pollo. Lo sviluppo degli embrioni di pollo esterna consente una comoda manipolazioni sperimentali in specifiche fasi embrionali, con gli effetti determinati in tempi successivi di sviluppo 10-13. Chick tubi embrionali neuronali precedenti alla fase di HH 13 (diciannove somiti, 48 ore) sono costituiti da multipotenti progenitori neurali che sono in grado di differenziarsi in diversi tipi di cellule del sistema nervoso. Il vettore pCAG, che contiene sia un promotore CMV e un pulcino β-actina enhancer, permette l'espressione solida di bandiera o di altri costrutti epitopo-tag in tubi neurali embrionali di pollo 14. In questa relazione, vogliamo sottolineare misure speciali per realizzare l'espressione genica regionalmente limitato embrionali progenitori dei neuroni dopaminergici del mesencefalo, tra cui come iniettare DNA costruisce in particolare nella regione del mesencefalo embrionale e come individuare elettroporazione con piccoli elettrodi di misura. Analisi cmesencefalo Hick nelle fasi successive fornisce un ottimo sistema di vivo per vettore plasmidico-mediata guadagno di funzione e la perdita di funzione studi di sviluppo mesencefalo. Modifica del sistema sperimentale può estendere il saggio in altre parti del sistema nervoso per eseguire la mappatura analisi destino e per indagare la regolazione dell'espressione genica.
Protocol
1. Preparazione di alimentazione (non in video)
- Preparare una diluizione fresca 1X della penicillina / streptomicina (Pen / Strep) in 1X PBS. Non più di 50 mL è necessario. Filtrare con un filtro di 0,22 micron siringa.
- Preparare costrutti iniezione combinando desiderati costrutti plasmidici. Abbiamo messo tutti i costrutti nel pCAG-Flag vettore con stechiometria appropriata per un volume finale di circa 10 L. Inoltre, pCAG GFP-14 o pCAG-mCherry dovrebbe essere aggiunto per il monitoraggio e l'efficienza elettroporazione cellule elettroporate. Usiamo pCAG-mCherry per questo esperimento. Infine, aggiungere 0,22 pm di colorante filtrata Fast Green nella miscela di DNA plasmidico ad una concentrazione finale di 0,05% per visualizzare l'efficienza di iniezione in midbrains pulcino embrionali.
2. Egg Preparazione (in video)
- Al fine di acquisire fase HH 11 embrioni, le uova devono essere incubate a 100 ° F (37,8 ° C) per circa 41 ore dopo la fecondazione con il 25-40% di umidità. Postouova dalla loro parte e segnare l'inizio di ciascuna con un trattino matita. Mettere vassoi in un pre-riscaldato, incubatore umidificato. Lentamente oscillare uova impostando la funzione di incubatore di svolta delle piattaforme su "Automatico". Controllare il livello di umidità e acqua ogni 24 ore.
- Proprio prima di iniziare l'esperimento, togliere le uova dal incubatore e lasciare a temperatura ambiente. Ciò contribuirà a rallentare lo sviluppo e prevenire sullo sviluppo.
- Pulire la superficie di ciascun uovo con il 70% di etanolo e pulire con un Kimwipe.
- Prendete due pezzi 4 cm di nastro adesivo e attaccarli side-by-side sulle uova per fare un grande rettangolo sopra il cruscotto matita. Lisciare il nastro contro l'uovo. Questa è la finestra in cui sarà fatto. Il nastro impedirà piccoli pezzi di guscio d'uovo di cadere quando la finestra è tagliata aperta.
- Utilizzare una siringa da 10 ml e 18 ½ gauge per disegnare 5 ml di fuori albumina dell'uovo. Dopo aver forato il guscio, inclinare l'ago dal tuorlo per non disturbareo danneggiare l'embrione durante la rimozione di albumina. Pulire l'ago con etanolo al 70% tra le uova, ma essere sicuri che l'ago sia asciutto prima di forare l'uovo successivo.
3. Glass Needle preparazione di iniezione (in video)
- Gli aghi da iniezione sono realizzati utilizzando le seguenti impostazioni su un Flaming / Brown Micropipetta Puller (modello Instrument Sutter P-97): Heat 670, Pull 120, Vel 40, ora 165. Mondiale Precision Instruments (API) 4 pollici 1,0 millimetri di vetro sottile parete capillare (API TW100F-4) è usato per fare gli aghi.
- Caricare un ago di vetro tirato con una pipetta P10 e la lunga punta capillare carico della punta di pipetta (Eppendorf 5.242.956,003). Caricare pl 5-10, a seconda di quanti uova deve essere iniettato. Riempire l'ago vetro lentamente, creando una colonna continua di soluzione plasmide assente di bolle d'aria.
- Posizionare l'ago caricato nel supporto dell'ago attaccato al micromanipolatore (Narishige MM3) e la Picospritzer III microiniettore. Visualizza l'ago sotto uno dissectiil microscopio e tagliare l'ago nel punto in cui il fluido verde si arresta. Aiuta ad utilizzare uno sfondo scuro per visualizzare meglio l'ago. Dell'ago corretta rifilatura viene con la pratica.
4. Mesencefalo / iniezione tubo neurale (in video)
- Usare le forbici per tagliare una molla finestra 2-2,5 cm di diametro nell'uovo. Avviare la finestra dal foro dell'ago precedente fatta al momento dell'elaborazione di albumina, e ruotare l'uovo in mano, come si taglia. Assicurarsi di pulire le forbici con un Kimwipe saturo in etanolo al 70% tra le uova.
- Visualizza embrioni di pollo al microscopio di dissezione. Può essere necessario formare gli occhi. Può essere utile per visualizzare l'embrione iniettando 0,22 micron-filtrata inchiostro del 20% in India PBS sotto dell'embrione di pollo. Tuttavia, abbiamo trovato che questo passo dovrebbe essere evitato se possibile, in quanto tende a diminuire sopravvivenza.
- Iniezione funziona meglio se l'embrione è posizionato parallelamente al percorso dell'ago, con la testa fuori dall'ago.Lentamente forare il tubo neurale con un angolo di 45 gradi al mesencefalo-rombencefalo giunzione. E 'molto critico di compilare solo la vescicola neurale che rappresenta il mesencefalo con il DNA plasmidico e Fast colorante verde, senza diffusione significativa nelle regioni del proencefalo e rombencefalo. Iniziare l'iniezione con la durata del set microiniettore Picospritzer presso 25 ms, che può essere necessario modificare a seconda del taglio dell'ago. In generale, utilizzare tra i 10-50 ms.
5. Elettroporazione (in video)
- Recuperare l'ago di iniezione. Luogo 3 gocce di 1X Pen / Strep in soluzione PBS nell'uovo sull'embrione.
- Controllare le impostazioni del elettroporatore BTX EMC830:
TENSIONE: 20 V PULSE LUNGHEZZA: 25 ms N. impulsi: 3 INTERVALLO: 500 ms POLARITA: - Posizionare gli elettrodi 2 mm platino lunghezza L forma allo stesso livello orizzontale il fondo del tubo neurale, con il mesencefalo embrionale seduto nel mezzo tra due 3 mm di distanza elettrodi. Allineamento gli elettrodi con il fondo del tubo neurale è critico per elettroporazione efficiente del mesencefalo ventrale. Per ottenere mesencefalo-specifica elettroporazione, abbiamo sostituito gli elettrodi originali BTX con due custom-made platino a forma di L-elettrodi con punte corte 2 mm di lunghezza. Questi elettrodi di platino sono fatti di fili di platino 0,5 mm di diametro (Alfa Aesar). Questi elettrodi di platino sono solo abbastanza a lungo per coprire il mesencefalo di un embrione stadio 11 pulcino, che è di circa 0,9 mm di lunghezza, senza prendere di mira la maggior parte del prosencefalo o le regioni rombencefalo. Premete l'interruttore a pedale BTX una volta. Le bolle d'aria deve essere generato attorno agli elettrodi con ogni elettroporazione di successo. Rimuovere con cautela gli elettrodi dall'uovo e pulire il elettrodi con un Kimwipe etanolo al 70% coperto. Posizionare un altro 3 gocce di 1X Pen / Strep soluzione nell'uovo, sull'embrione.
- Coprire la finestra con un 5 cm x 5 cm pezzo nastro da imballaggio trasparente. Accertarsi di sigillare l'uovo bene e che il contenuto delle uova non vengano a contatto con il nastro.
6. Incubare e Harvest
- Mettere le uova nuovamente dentro l'incubatrice. Assicurarsi che la svolta delle piattaforme incubatore è OFF. Incubare le uova fino allo stadio desiderato HH 23 è raggiunto.
- Harvest embrioni vivi e metterli in comune PBS-riempite piastre di Petri per ogni condizione. Schermo embrioni raccolti sotto un microscopio a fluorescenza dissezione, mantenendo solo gli embrioni con l'espressione mCherry.
- Trasferire embrioni nei pozzetti individuali di un piatto ben 24. Riempire ogni pozzetto con 1 mL di appena fatto paraformaldeide al 2% (PFA) e consentono di fissare 2-3 ore a 4 ° C.
- Lavare embrioni fissi tre volte per 10 minuti ciascuno in PBS. Embrioni Luogo in sequenza in 15% e 30% saccarosio fino equilibrata. Gli embrioni inizialmente galleggerà in saccarosio, ma affonderà sulla equilibrio.
- Controllare gli embrioni sotto un microscopio a fluorescenza dissezione, prendendo appunti sul modello di espressione mCherry e il livello per ogni embrione. Incorpora ogni embrione in ottobre E 'molto critico per orientare correttamente gli embrioni per generare ottime sezioni trasversali del mesencefalo per le analisi successive (Figura 1).
- Preparare 18 sezioni del mesencefalo micron di spessore utilizzando un criostato Leica CM3050S. Analizzare lo sviluppo mesencefalo e la differenziazione dei neuroni dopaminergici da immunocolorazione con i marcatori appropriati tipo di cellula.
7. Risultati rappresentativi
Una rappresentazione schematica di electroporating e analizzare mesencefalo embrionale pulcino è mostrato in Figura 1. In embrioni di pollo con successo iniettati ed elettroporati, espressione mCherry dovrebbe essere visibile nella regione del mesencefalo, dopo un ulteriore sviluppo (
Espressione mCherry insufficiente suggerisce che i geni ectopici sono probabilmente non ha espresso in modo efficiente. Gli embrioni in questa condizione non deve essere utilizzato per ulteriori studi. Allo stesso modo, gli embrioni chenon sopravvivono alla fine della procedura sperimentale non può essere utilizzata per la raccolta e l'analisi dei dati.
Figura 1. Illustrazione del mesencefalo pulcino embrionale nel test elettroporazione ovo. HH stadio 11 embrioni di pollo embrionali sono iniettati con pCAG-mCherry insieme a geni di interesse mescolato con il verde veloce per visualizzare il processo di iniezione (A). Dopo aver riempito di costrutti di DNA, sono midbrains elettroporate con un elettroporatore onda quadra. Gli embrioni sono ulteriormente incubati fino desiderata fase HH 23 è raggiunto. Poi mCherry-positivi embrioni vengono raccolte, fisso e integrato (B). Criosezioni mesencefalo sono preparati con taglio piani indicati dalla linea bianca in figura 1B, e analizzati mediante immunocolorazione con marcatori mesencefalo come tirosina idrossilasi (TH) (C). clic quiper ingrandire figura.
Figura 2. Preparazione di criosezioni da mesencefalo pulcino embrionale. Dopo 41 ore di incubazione, HH stadio 23 embrioni di pollo e mCherry esprimono geni di interesse vengono raccolte (A, B e C), fissato con PFA, trattata con saccarosio, e incorporato in OCT per criosezionamento. Embrioni di pollo sono accuratamente orientato da garantire la preparazione di sezioni mesencefalo. Una morfologia tipica embrione e il piano di taglio per ottenere sezioni del mesencefalo sono mostrati (D). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Analisi di sezioni elettroporate mesencefalo. Criosezioni da embrioni con alti livelli di espressione mCherry (A) sono preparati e colorati con anticorpiies che riconoscono il Flag-tag gene di interesse (B) e il mesencefalo marcatore dei neuroni dopaminergici TH (C). Midbrains embrionali elettroporate con pCAG-mCherry e pCAG-Flag vettore vuoto servono come controllo. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
L'elettroporazione in ovo di mesencefalo pulcino embrionale offre un basso costo e rapida alternativa alla generazione di animali transgenici o knockout per eseguire studio in vivo delle funzioni geniche in sviluppo mesencefalo dopaminergica neurone. Uso breve 2 millimetri elettrodi di platino lunghezza L-forma insieme embrionale mesencefalo-specifica iniezione del DNA è la chiave per ottenere l'espressione efficiente del gene di interesse in mesencefalo progenitori neuroni dopaminergici. Inoltre, l'uso corretto di scena HH 11 embrioni di pollo è un fattore critico. Questo perché prima, nella fase 11 HH, lo sviluppo di mesencefalo pulcino è sufficientemente avanzata tale che il proencefalo, il mesencefalo, e il romboencefalo sono morfologicamente distinguibili. Questo permette il posizionamento preciso dell'ago iniezione ed elettrodi in corrispondenza della regione del mesencefalo, e l'iniezione del DNA così efficiente e trasfezione. In secondo luogo, in fase di HH 11, il neuroporo anteriore dell'embrione di pollo non è ancora completamente chiudered, consentendo il DNA plasmidico iniettato per entrare facilmente specificamente nella regione mesencefalo. Le giunzioni strette tra prosencefalo embrionale, il mesencefalo e rombencefalo anche aiutare a prevenire la diffusione veloce di costrutti di DNA iniettato in particolare nel mesencefalo. Infine, gli embrioni in fasi successive tendono ad incurvarsi testa al lato dell'asse neurale, rendendo molto difficile per indirizzare l'elettrodo specificamente al mesencefalo. Il tempo di incubazione necessario per ottenere in scena HH 11 embrioni possono variare leggermente in risposta a variazioni della temperatura di incubazione, così come le differenze naturali tra uova. Nelle nostre condizioni sperimentali, ci vogliono circa 41 ore di incubazione a 100 ° F.
Per ottenere sezioni embrionali di pollo per l'analisi del mesencefalo, l'incorporamento e taglio midbrains al corretto orientamento è molto critica. Quarantuno ore dopo l'elettroporazione, embrioni di pollo spesso mostrano una morfologia simile alla figura 2D. Preparazione criosezioni condi taglio piano parallelo a quelli mostrati nella figura 2D massimizza la possibilità di ottenere sezioni del mesencefalo corrette per immunostaining ulteriori e quantificazione.
Il fatto che mesencefalo genica specifica ectopica può essere ottenuto mediante elettroporazione apre la possibilità che questo approccio può essere applicato ad altre regioni del sistema nervoso centrale. La posizione di iniezione, nonché il posizionamento degli elettrodi, potrebbero influenzare significativamente le regioni cerebrali che vengono efficacemente trasfettate con costrutti di DNA 7,15. Questa tecnica può anche rivelarsi utile nel ridurre l'espressione gene specifico nel mesencefalo da RNAi-mediato knockdown 16. Analogamente, le tecniche leggermente modificati possono essere implementati per studiare regolazione genica esprimendo esaltatori legati per identificare geni reporter, mappa, e caratterizzare le nuove regioni regolatrici dal geni del pulcino. Quando viene applicato a embrioni di topo, questa tecnica sarebbe molto più velocee più facile da usare rispetto classici approcci transgenici.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi in conflitto potenziale da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Takahiko Matsuda per la fornitura del pCAG-mCherry costruire. YCM è supportata da un Career Development Award da parte della Fondazione Schweppe e una sovvenzione dalla Fondazione Whitehall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
