Summary
Um die Funktion und die Regulation von Genen während der Entwicklung der dopaminergen Neurone im Mittelhirn zu bewerten, beschreiben wir eine Methode, die beinhaltet
Abstract
Dopaminergen Neuronen in der ventralen Mittelhirn Kontrolle Bewegung befindet, emotionales Verhalten und Belohnung Mechanismen 3.1. Die Dysfunktion des ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen in der Parkinson-Krankheit, Schizophrenie, Depression und Demenz 5.1 verwickelt. So konnte die Untersuchung der Regulation der dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Differenzierung nicht nur liefern wichtige Einblicke in die Mechanismen, die Mittelhirn Entwicklung und neuronale Vorläuferzellen Schicksal Spezifikation, sondern auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung einer Vielzahl von humanen neurologischen Erkrankungen.
Dopaminergen Neuronen differenzieren aus neuralen Vorläuferzellen entlang der ventrikulären Zone der embryonalen ventralen Mittelhirn. Die Entwicklung von neuralen Vorläuferzellen wird durch Genexpression 6,7 gesteuert. Hier berichten wir über Techniken der Verwendung von Elektroporation, um Gene gezielt zum Ausdruck bringen im Mittelhirn der Hamburger Hamilton (HH) Stufe 11 (thirteen Somiten, 42 Stunden) Hühnerembryonen 8,9. Die externe Entwicklung von Hühnerembryonen ermöglicht die komfortable experimentelle Manipulationen an bestimmten embryonalen Stadien, mit den Auswirkungen auf späteren Entwicklungsstadien Zeitpunkten 10-13 bestimmt. Küken embryonalen neuralen Röhren früher als HH Stadium 13 (neunzehn Somiten, 48 Stunden) bestehen aus multipotenten neuralen Vorläuferzellen zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen des Nervensystems sind. Die pCAG Vektor, der sowohl einen CMV-Promotor und ein Küken β-Actin-Enhancer enthält, kann für robuste Expression des Flag oder andere Epitop-markierten Konstrukte in Embryonenküken neuronalen Röhren 14. In diesem Bericht möchten wir betonen, besondere Maßnahmen zur regional begrenzten Gen-Expression in embryonalen dopaminergen Mittelhirn-Neuronen-Vorläuferzellen, einschließlich wie man injizieren DNA-Konstrukte gezielt in den embryonalen Mittelhirns Gegend und wie Elektroporation mit kleinen maßgeschneiderten Elektroden lokalisieren zu erreichen. Analysieren von chick Mittelhirn in späteren Stadien eine hervorragende in vivo für Plasmid-Vektor-vermittelte gain-of-Funktion und Loss-of-Funktions-Untersuchungen der Mittelhirn Entwicklung. Modifizierung des experimentellen System kann des Assays, anderen Teilen des Nervensystems erstrecken zum Durchführen Gastrula-Analyse und zur Untersuchung der Regulation der Genexpression.
Protocol
1. Versorgung Vorbereitung (nicht im Video)
- Bereiten Sie einen frischen 1X Verdünnung von Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) in 1X PBS. Nicht mehr als 50 ml notwendig sind. Filter mit einer Spritze 0,22 um-Filter.
- Bereiten Injektion Konstrukte durch die Kombination von gewünschten Plasmid-Konstrukte. Wir haben alle Konstrukte in der pCAG-Flag-Vektor mit geeigneter Stöchiometrie bis zu einem Endvolumen von ~ 10 l. Außerdem sollte pCAG-GFP 14 oder pCAG-mCherry zum Verfolgen Elektroporation Effizienz und elektroporierten Zellen gegeben werden. Wir verwenden pCAG-mCherry für dieses Experiment. Schließlich werden 0,22 um filtriert Fast Green-Farbstoff in der Plasmid-DNA Mischung bei einer Endkonzentration von 0,05%, um die Einkoppeleffizienz in Embryonenküken midbrains visualisieren.
2. Egg Vorbereitung (im Video)
- Um erwerben HH Stadium 11 Embryonen, brauchen Eier bebrütet werden bei 100 ° F (37,8 ° C) für etwa 41 Stunden nach der Befruchtung mit 25-40% Luftfeuchtigkeit. OrtEier auf ihrer Seite und markieren die Spitze jeder Strich mit einem Bleistift. Platzieren Sie Trays in einer vorgewärmten, befeuchteten Inkubator. Langsam Eier schaukeln, indem Sie die Drehfunktion des Inkubator-Plattformen auf "Automatisch". Überprüfen Sie die Feuchtigkeit und Wasserstand alle 24 Stunden.
- Kurz vor Beginn des Versuchs, zu entfernen Eier aus dem Inkubator verlassen und bei Raumtemperatur. Dies wird dazu beitragen, die Entwicklung verlangsamen und verhindern, dass über die Entwicklung.
- Reinigen Sie die Oberfläche der einzelnen Eier mit 70% Ethanol und wischen Sie mit einem Kimwipe.
- Nehmen Sie zwei 4 cm Stücke von Klebeband und kleben Sie diese Seite an Seite auf dem Ei, ein großes Rechteck über den Bleistift Strich zu machen. Glätten Sie das Band vor dem Ei. Dies ist, wo das Fenster gemacht werden. Das Band wird kleine Stücke von Schalen abfällt, wenn das Fenster aufgeschnitten zu verhindern.
- Verwenden Sie eine 10 ml-Spritze und 18-Gauge-Nadel ½ bis 5 ml Albumin aus dem Ei zu ziehen. Nach dem Durchstechen der Schale, winkeln Sie die Nadel weg von der Dotter nicht zu stören, umoder Schäden am Embryo beim Entfernen Albumin. Reinigen Sie die Nadel mit 70% Ethanol zwischen Eiern, aber sicher sein, die Nadel ist vor Durchstechen der nächste Ei trocken.
3. Glass Injektionsnadel Vorbereitung (im Video)
- Injektionsnadeln sind gemacht mit den folgenden Einstellungen auf einem lodernden / Braun Feinpipettenziehvorrichtung (Sutter Instrument Modell P-97): Heat 670, Pull-120, Vel 40, 165 Zeit. World Precision Instruments (API) 4 Zoll 1,0 mm dünnen Wand Kapillargläser (API TW100F-4) wird verwendet, um Nadeln zu machen.
- Laden Sie ein Glas gezogen Nadel mit einer P10-Pipette und die lange Spitze Kapillare Laden Pipettenspitze (Eppendorf 5242956,003). Legen 5-10 ul, je nachdem wie viele Eier sind, die injiziert werden. Füllen Sie das Glas langsam Nadel, die Schaffung eines durchgehenden Spalte von Plasmid-Lösung abwesend von Luftblasen.
- Platzieren Sie die geladene Nadel in den Nadelhalter an dem Mikromanipulator (Narishige MM3) und dem Picospritzer III Mikroinjektorkopfs. Sehen Sie sich die Nadel unter einem dissectiMikroskop auf und schneiden Sie die Nadel an der Stelle, wo die grüne Flüssigkeit stoppt. Es hilft, einen dunklen Hintergrund zu verwenden, um besser zu visualisieren Sie die Nadel. Die richtige Nadel Trimmen kommt mit der Praxis.
4. Mittelhirn / Neuralrohr Injection (im Video)
- Verwenden Sie eine Schere Frühjahr 2-2,5 cm Durchmesser Fenster im Ei geschnitten. Starten Sie das Fenster aus dem vorigen Stichloch machte beim Zeichnen von Albumin, und drehen Sie das Ei in der Hand, wie Sie abgeschnitten. Seien Sie sicher zu reinigen Sie die Schere mit einem Kimwipe in 70% Ethanol zwischen Eiern gesättigt.
- Alle Hühnerembryonen unter einem Dissektionsmikroskop. Es kann notwendig sein, um die Augen zu trainieren. Es kann helfen, den Embryo durch Einspritzen von 0,22 um-gefiltert 20% Tusche in PBS unter dem Hühnerembryo zu visualisieren. Wir haben jedoch gefunden, dass dieser Schritt vermieden werden sollte, wenn möglich, wie es für das Überleben tendenziell abnimmt.
- Injektion funktioniert am besten, wenn der Embryo in parallel zu dem Weg der Nadel angeordnet ist, wobei der Kopf von der Nadel.Langsam dringen das Neuralrohr in einem 45 Grad Winkel zum Mittelhirn-Hinterhirn Kreuzung. Es ist sehr wichtig, nur füllen die neuronale Vesikel, die den Mittelhirn mit Plasmid-DNA und Fast Green Farbstoff, ohne nennenswerte Diffusion in die Vorderhirn und Hinterhirn Regionen. Starten Sie mit der Injektion von Picospritzer Mikroinjektor die Dauer Satz bei 25 ms, das eventuell verändert je nach Nadel Trimmen werden. In der Regel zwischen 10-50 ms verwenden.
5. Elektroporation (im Video)
- Rufen Sie die Injektionsnadel. Platz 3 Tropfen 1X Pen / Strep in PBS-Lösung in das Ei auf den Embryo.
- Überprüfen Sie die Einstellungen des BTX EMC830 Elektroporator:
SPANNUNG: 20 V PULSLÄNGE: 25 ms # Impulse: 3 INTERVAL: 500 ms POLARITÄT: - Die 2 mm langen L-förmigen Platinelektroden auf der gleichen horizontalen Niveau wie der Boden des Neuralrohrs, mit der embryonalen Mittelhirn sitzt in der Mitte zwischen zwei beabstandeten Elektroden 3 mm. Ausrichten der Elektroden mit dem Boden des Neuralrohrs ist entscheidend für eine effiziente Elektroporation des ventralen Mittelhirn. Um Mittelhirn-spezifische Elektroporation zu erreichen, ersetzten wir die Original-BTX-Elektroden mit zwei maßgeschneiderten Platin L-förmigen Elektroden mit kurzen 2 mm langen Spitzen. Diese Platin-Elektroden von 0,5 mm Durchmesser Platindrähte (Alfa Aesar) hergestellt. Diese Platin-Elektroden sind gerade lang genug, um das Mittelhirn eines Stufe 11 Hühnerembryonen, die etwa 0,9 mm lang, ohne Targeting viel von dem Vorderhirn oder den Rautenhirn Regionen ist zu decken. Drücken Sie die BTX-Fußschalter einmal. Luftblasen um die Elektroden mit jedem erfolgreichen Elektroporation erzeugt werden. Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden aus dem Ei und wischen Sie die elektrOden mit einem 70% igen Ethanol-Kimwipe abgedeckt. Setzen Sie noch 3 Tropfen 1X Pen / Strep-Lösung im Ei, auf den Embryo.
- Decken Sie das Fenster mit einem 5 cm x 5 cm großes Stück klar Packband. Achten Sie darauf, um das Ei gut und zu versiegeln, dass die Ei-Inhalte nicht in Kontakt mit der Band zu kommen.
6. Inkubieren und Ernte
- Legen Sie die Eier wieder in den Inkubator. Stellen Sie sicher, das Drehen des Inkubator-Plattformen ist AUS. Inkubieren Eier, bis die gewünschte HH 23 wird erreicht.
- Ernte lebende Embryonen und sie in gemeinsamen PBS gefüllten Petrischalen für jede Bedingung. Bildschirm geerntet Embryonen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop Dissektion und behielt nur Embryonen mit mCherry Ausdruck.
- Übertragen Embryonen in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Füllen Sie jede gut mit 1 ml frisch zubereiteten 2% Paraformaldehyd (PFA) und lassen Sie sie 2-3 Stunden bei 4 ° C fixieren
- Waschen fixierte Embryonen dreimal für jeweils 10 Minuten in PBS. Ort Embryonen nacheinander in 15% und 30% Saccharose, bis ins Gleichgewicht gebracht. Die Embryonen werden zunächst in Saccharose zu schweben, wird aber beim Äquilibrierung sinken.
- Überprüfen Embryonen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop Dissektion, sich Notizen auf dem mCherry Expressionsmuster und Niveau für jeden Embryo. Einbetten jedes Embryo im Oktober Es ist sehr kritisch zu orientieren Embryonen richtig optimale Mittelhirn Querschnitte für nachfolgende Analysen (1) zu erzeugen.
- Bereiten 18 um dicken Mittelhirn Abschnitten mit einem Leica CM3050S Kryostaten. Analysieren Mittelhirn Entwicklung und Differenzierung von dopaminergen Neuronen Immunfärbung mit geeigneten Zelltyp Marker.
7. Repräsentative Ergebnisse
Eine schematische Darstellung der Elektroporation und Analyse Embryonenküken Mittelhirn ist in Abbildung 1 dargestellt. In den erfolgreich injiziert und elektroporiert Hühnerembryonen, sollte Ausdruck sein mCherry im Mittelhirn Region sichtbar nach weiteren Entwicklung (
Zu wenig mCherry Ausdruck legt nahe, dass ektopische Gene wahrscheinlich nicht effizient ausgedrückt. Embryonen unter dieser Bedingung nicht für weitere Untersuchungen verwendet werden. Ebenso, dass Embryonennicht bis zum Ende des experimentellen Verfahrens überleben können nicht für die Datensammlung und Analyse verwendet werden.
Abbildung 1. Illustration der Embryonenküken Mittelhirn in ovo Elektroporation Assay. HH Stadium 11 embryonalen Hühnerembryonen mit pCAG-mCherry zusammen mit Genen von Interesse mit schnellen Grün gemischt, um die Einspritzung zu visualisieren (A) injiziert. Nach mit DNA-Konstrukten gefüllt sind, midbrains mit einer Rechteckwelle Elektroporator elektroporiert. Die Embryonen werden weiter inkubiert, bis die gewünschte HH Stufe 23 erreicht ist. Dann mCherry-positiven Embryonen werden geerntet, fixiert und Embedded (B). Mittelhirn Kryoschnitten sind mit Schnittebenen durch die weiße Linie in Abbildung 1B angegeben vorbereitet und analysiert durch Immunfärbung mit Mittelhirn Marker wie Tyrosin-Hydroxylase (TH) (C). Klicken Sie hierfür eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Vorbereitung der Gefrierschnitte aus Embryonenküken Mittelhirn. Nach 41 Stunden Inkubation werden HH Stadium 23 Hühnerembryonen auszudrücken mCherry und Gene von Interesse geerntet (A, B und C), mit PFA fixiert, behandelt mit Saccharose, und eingebettet in Oktober für Kryoschneiden. Hühnerembryonen werden sorgfältig ausgerichtet, um die Vorbereitung des Mittelhirns Abschnitten zu gewährleisten. Eine typische Embryo Morphologie und die Schnittebene für den Erhalt von Mittelhirn Abschnitte werden gezeigt (D). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Analyse der elektroporierte Mittelhirn Abschnitten. Gefrierschnitte von Embryonen mit hoher mCherry Ausdruck (A) werden hergestellt und mit Antikör gefärbten, die die Flag-markierte Gen von Interesse (B) und dopaminergen Mittelhirn Neuronenmarkers TH (C) zu erkennen. Embryonale midbrains mit pCAG-mCherry und pCAG-Flag leeren Vektor als Kontrolle dienen elektroporiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Die in-ovo-Elektroporation von Embryonenküken Mittelhirn bietet eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung von transgenen oder Knockout-Tieren in vivo-Studie von Genfunktionen in dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Entwicklung durchzuführen. Verwendet man die 2 mm langen L-förmigen Platinelektroden mit embryonalen Mittelhirn-spezifischen DNA-Injektion ist der Schlüssel für eine effiziente Expression des Gens von Interesse in dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Vorläuferzellen. Darüber hinaus verwenden richtige HH Stadium 11 Hühnerembryonen ist kritisch. Dies liegt daran, zunächst bei HH Stufe 11, die Entwicklung des Kükens Mittelhirn ist weit genug fortgeschritten ist, so dass das Vorderhirn, das Mittelhirn und Rautenhirn morphologisch unterscheidbar sind. Dies ermöglicht die genaue Positionierung der Injektionsnadel und Elektroden auf der Mittelhirn Region, und somit eine effiziente DNA-Injektion und Transfektion. Zweitens, bei HH Stadium 11, ist der vordere Neuroporus des Hühnerembryos noch nicht vollständig schließend, so dass das injizierte Plasmid-DNA auf einfache Weise gezielt einzugehen Region des Mittelhirns. Die engen Verbindungen zwischen embryonalen Vorderhirn, Mittelhirn und Hinterhirn auch dazu beitragen, schnelle Diffusion von DNA-Konstrukten spezifisch in das Mittelhirn injiziert zu verhindern. Schließlich neigen Embryonen in späteren Stadien, um die Köpfe der Seite der neuralen Achse zu kräuseln, was es sehr schwierig, die Elektrode gezielteren Mittelhirn. Die Inkubationszeit zur Erlangung HH Stadium 11 Embryonen können leicht variieren in Reaktion auf Abweichungen in der Inkubationstemperatur, sowie natürliche Unterschiede zwischen den Eiern. Unter unseren experimentellen Bedingungen, dauert es etwa 41 Stunden Inkubation bei 100 ° F.
Um Embryonenküken Mittelhirn Abschnitte für die Analyse zu erhalten, Einbettung und Schneiden midbrains bei der korrekten Ausrichtung ist sehr kritisch. Einundvierzig Stunden nach der Elektroporation, Hühnerembryonen zeigen oft eine Morphologie ähnlich der Abbildung 2D. Vorbereiten Kryoschnitten mit einemSchnittebene parallel zu jenen, die in 2D gezeigt ist die Chance, immer korrekt Mittelhirn Abschnitte für weitere Immunfärbung und Quantifizierung.
Die Tatsache, dass Mittelhirn-spezifischen ektopische Genexpression durch Elektroporation erreicht werden kann eröffnet die Möglichkeit, dass dieser Ansatz auf andere Regionen des zentralen Nervensystems angewendet werden kann. Die Lage der Injektionsstelle, sowie die Positionierung der Elektroden, beeinträchtigt werden könnte, Hirnregionen, die effizient mit DNA-Konstrukten 7,15 transfiziert werden. Diese Technik kann auch nützlich sein bei der Verringerung der Genexpression im Mittelhirn durch RNAi-vermittelte Knockdown 16. In ähnlicher Weise können leicht modifizierte Techniken implementiert, um Genregulation durch Expression Enhancer verknüpft Reportergene zu ermitteln, kartieren und charakterisieren neuen regulatorischen Regionen von Genen in der Küken zu studieren. Wenn die Maus-Embryonen angewendet, würde diese Technik viel schnellerund einfacher zu bedienen als klassische transgene Ansätze zu verwenden.
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Disclosures
Die Autoren haben keinerlei potenzielle Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Takahiko Matsuda für die Bereitstellung der pCAG-mCherry konstruieren. YCM wird durch einen Career Development Award der Schweppe-Stiftung und ein Stipendium der Whitehall-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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