I ovo electroporation i Chick midbrain for å studere gen-funksjon i dopaminerg Neuron Development

Summary

For å vurdere funksjon og regulering av gener under utviklingen av midbrain dopaminerge nevroner, beskriver vi en metode som involverer

Abstract

Dopaminerge nevroner lokalisert i ventrale midbrain kontroll bevegelse, emosjonell atferd og belønne mekanismer ^1-3. Dysfunksjon i ventral midbrain dopaminerge nevroner er innblandet i Parkinsons sykdom, schizofreni, depresjon, og demens ^1-5. Dermed kunne studere reguleringen av midbrain dopaminerge nevroner differensiering ikke bare gi viktig innsikt i mekanismene som regulerer midbrain utvikling og nevrale stamceller skjebne spesifikasjonen, men også bidra til å utvikle nye terapeutiske strategier for behandling av en rekke menneskelige nevrologiske lidelser.

Dopaminerge nevroner skille fra nevrale stamceller langs ventrikulære sonen embryonale ventral midbrain. Utviklingen av nevrale stamceller styres av genuttrykk programmer ^6,7. Her rapporterer vi teknikker som utnytter electroporation å uttrykke gener spesifikt i midbrain av Hamburger Hamilton (HH) stadium 11 (thirteen somites, 42 timer) kyllingembryo ^8,9. Den eksterne utviklingen av kyllingembryo gir praktiske eksperimentelle manipulasjoner på bestemte embryonale stadier, med de effektene som fastlegges ved senere utviklingsmessige tidspunkter ^10-13. Chick embryonale nevrale rør tidligere enn HH stadium 13 (nitten somites, 48 ​​timer) består av multipotent nevrale stamceller som er i stand til å differensiere til forskjellige celletyper i nervesystemet. Den pCAG vektor, som inneholder både en CMV promoter og en kylling β-actin enhancer, åpner for robust uttrykk av flagg eller andre epitop-merket konstruksjoner i embryonale chick nevrale rør ^14. I denne rapporten legger vi vekt på spesielle tiltak for å oppnå regionalt begrenset genuttrykk i embryonale midbrain dopaminerge nevroner stamfedre, inkludert hvordan du injiserer DNA konstruerer spesifikt inn på embryonale midbrain regionen og hvordan finne electroporation med små skreddersydde elektroder. Analysere cHick midbrain på senere stadier gir en utmerket in vivo system for plasmid vektor-mediert gain-of-funksjon og tap-av-funksjon studier av midbrain utvikling. Endring av den eksperimentelle systemet kan utvide analysen til andre deler av nervesystemet for å utføre skjebne kartlegging analyse og for å undersøke regulering av genuttrykk.

Protocol

1. Tilførsel Forberedelse (ikke i video)

1. Forbered en fersk 1X utvanning av Penicillin / Streptomycin (penn / Strep) i 1X PBS. Ikke mer enn 50 ml er nødvendig. Filter med en 0,22 mikrometer sprøyte filter.
2. Forbered injeksjon konstruksjoner ved å kombinere ønskede Plasmid konstruksjoner. Vi legger alle konstruksjoner i pCAG-Flag vektor med passende støkiometri til en endelig volum på ~ 10 mL. I tillegg bør pCAG-GFP ¹⁴ eller pCAG-mCherry legges til sporing electroporation effektivitet og electroporated celler. Vi bruker pCAG-mCherry for dette eksperimentet. Til slutt, legg 0,22 mikrometer-filtrert Fast grønt fargestoff inn i plasmidet DNA blandingen på en endelig konsentrasjon på 0,05% for å visualisere injeksjon effektiviteten til embryonale chick midbrains.

2. Egg Forberedelse (i video)

1. For å få HH scenen 11 embryoer, egg må inkuberes ved 100 ° F (37,8 ° C) i ca 41 timer etter befruktning med 25-40% luftfuktighet. Placeegg på sin side og markere toppen av hver med en blyant strek. Plasser skuffer i en forvarmes, fuktet inkubator. Sakte rocke egg ved å sette skru funksjonen av inkubatoren plattformer til "Automatisk". Sjekk fuktighet og vannstanden hver 24. time.
2. Rett før du starter eksperimentet, fjerne egg fra inkubatoren og la ved romtemperatur. Dette vil bidra til å forsinke utviklingen og forebygge over utviklingen.
3. Rengjør overflaten av hvert egg med 70% etanol og tørke ned med en Kimwipe.
4. Ta to 4 cm stykker av teip og henge dem side ved side på egg for å lage en stor rektangel over blyanten dashbordet. Glatt tape mot egget. Dette er hvor vinduet vil bli gjort. Båndet vil hindre små biter av eggeskall faller av når vinduet er åpnet.
5. Bruk en 10 ml sprøyte og 18 ½ kanyle å trekke 5 mL av albumin ut av egget. Etter piercing skallet, vinkle nålen bort fra eggeplomme som å ikke forstyrreeller skade embryoet mens du fjerner albumin. Rengjør kanylen med 70% etanol mellom egg, men pass på at nålen er tørr før piercing neste egg.

3. Glass injeksjonsnål Forberedelse (i video)

1. Injeksjonsnåler er laget ved hjelp av følgende innstillinger på en Flaming / Brown mikropipette Puller (Sutter Instrument modell P-97): 670 Heat, Pull 120, Vel 40, Time 165. Verden Precision Instruments (API) 4 tommers 1,0 mm tynn vegg kapillær glass (API TW100F-4) blir brukt til å lage nåler.
2. Legg en trakk glass nål med en P10 pipette og lang spiss kapillær loading pipettespissen (Eppendorf 5242956.003). Load 5-10 mL, avhengig av hvor mange egg som skal injiseres. Fyll glasset nålen sakte, skaper en kontinuerlig kolonne av plasmid løsning fraværende av luftbobler.
3. Plasser den lastede nålen i nålen holderen festet til micromanipulator (Narishige MM3) og Picospritzer III microinjector. Vis nålen under en dissectipå mikroskop og trim nålen på det punktet der den grønne væsken stopper. Det hjelper å bruke en mørk bakgrunn for å bedre visualisere nålen. Riktig nål trimming kommer med praksis.

4. Midbrain / nevralrøret Injection (i video)

1. Bruk våren saks til å klippe en 2 til 2,5 cm diameter vindu i egget. Start vinduet fra forrige nålen hull laget når tegning albumin, og roter egg i hånden din når du klippe. Sørg for å rense seg saksen med en Kimwipe mettet i 70% etanol mellom egg.
2. Vis kyllingembryo under et disseksjon mikroskop. Det kan være nødvendig å trene øynene. Det kan hjelpe å visualisere fosteret ved å injisere 0,22 mikrometer-filtrert 20% tusj i PBS under kylling embryo. Vi har imidlertid funnet ut at dette trinnet bør unngås hvis mulig, slik det pleier å redusere overlevelse.
3. Injeksjon virker best hvis fosteret er plassert parallelt med banen av nålen, med hodet vekk fra nålen.Sakte pierce nevralrøret i en 45 graders vinkel til midbrain-hindbrain veikryss. Det er svært kritisk til bare fylle nevrale vesicle representerer midbrain med plasmid DNA og Fast grønt fargestoff, uten betydelig diffusjon inn i forebrain og hindbrain regioner. Begynn å injisere med Picospritzer microinjector varighet på 25 ms, dette må endres avhengig nål trimming. Generelt sett bruker mellom 10-50 ms.

5. Electroporation (i video)

1. Hent kanylen. Place 3 dråper 1X Pen / Strep i PBS løsning i egget på fosteret.
2. Sjekk innstillingene for BTX EMC830 electroporator:

   SPENNING:	20 V
   PULS LENGDE:	25 ms
   Nr pulser:	3
   Intervall:	500 ms
   Polaritet:

3. Plasser to mm lange L-formet platina elektroder på samme horisontale nivå som bunnen av nevralrøret, med embryonale midbrain sitter midt mellom to 3 mm fra hverandre elektroder. Justere elektrodene med bunnen av nevralrøret er kritisk for effektiv electroporation av ventrale midbrain. For å oppnå midbrain-spesifikk electroporation, erstattet vi de opprinnelige BTX elektrodene med to skreddersydde platina L-formede elektrodene med korte 2 mm lange tips. Disse platina elektroder er laget av 0,5 mm diameter platina ledninger (Alfa Aesar). Disse platina elektroder er akkurat lenge nok til å dekke midbrain av en scene 11 kylling embryo, som er ca 0,9 mm lang, uten målretting mye av forebrain eller hindbrain regionene. Trykk på BTX fotbryter gang. Luftbobler skal genereres rundt elektrodene med hver vellykket electroporation. Fjern forsiktig elektroder fra egget og tørk av elektroder av med en 70% etanol-dekket Kimwipe. Plasser en 3 dråper 1X Pen / Strep løsning i egget, på embryo.
4. Dekk vinduet med en 5 cm x 5 cm stykke av klar pakketape. Sørg for å forsegle egg godt og at egginholdet ikke kommer i kontakt med tape.

6. Inkuber og hausting

1. Ha eggene tilbake i inkubatoren. Pass på svingen av inkubatoren plattformer er OFF. Ruge egg til ønsket HH scenen 23 er oppnådd.
2. Harvests levende embryoer og plassere dem i vanlige PBS-fylt petriskåler for hver tilstand. Screen høstes embryoer under et fluorescerende disseksjon mikroskop, holder bare embryo med mCherry uttrykk.
3. Overfør embryoer inn i individuelle brønner på en 24-brønn parabolen. Fyll hver brønn med 1 mL av nystekte 2% paraformaldehyde (PFA) og la til å fikse 2-3 timer ved 4 ° C.
4. Vask faste embryoer tre ganger i 10 minutter hver i PBS. Plasser embryoer sekvensielt in 15% og 30% sukrose til likevekt. Embryoet vil i første omgang flyter i sukrose, men vil synke ved likevekt.
5. Sjekk embryoer under et fluorescerende disseksjon mikroskop, ta notater på mCherry uttrykket mønster og nivå for hvert embryo. Bygge hvert embryo i oktober Det er svært kritisk til orientere embryoer riktig å generere optimale midbrain tverrsnitt for senere analyser (Figur 1).
6. Forbered 18 mikrometer tykke midbrain seksjoner ved hjelp av en Leica CM3050S cryostat. Analyser midbrain utvikling og dopaminerge nevroner differensiering ved farging med passende celletype markører.

7. Representative Resultater

En diagrammatisk representasjon av electroporating og analysere embryonal chick midbrain er vist i Figur 1. I vellykket injisert og electroporated kyllingembryo, bør mCherry uttrykk være synlig i midbrain regionen etter videreutvikling ( (Figur 2D). Vanligvis kan omtrent 50% av ventrale midbrain nevrale stamceller bli effektivt tilført med ovennevnte protokollen. Spesifikasjonen av dopaminerg skjebne i electroporated nevrale stamceller kan undersøkes ved samlokalisering av mCherry, Flag-merket genet, med dopaminerge nevroner markører som Tyrosin hydroksylase (TH) (figur 3). Den fordelingen av progenitor domener i ventral midbrain kan bli etterforsket av co-immnostaining cryosections med ulike progenitor domene markører.

Utilstrekkelig mCherry uttrykk antyder at ektopiske gener er sannsynligvis ikke effektivt uttrykt. Embryoer under denne tilstanden bør ikke brukes til videre studier. Tilsvarende embryoer somikke overleve til slutten av den eksperimentelle prosedyren kan ikke brukes for datainnsamling og analyse.

Figur 1. Illustrasjon av embryonale dama midbrain i ovo electroporation analysen. HH scene 11 embryonale kyllingembryo er injisert med pCAG-mCherry sammen med gener av interesse blandet med rask grønn å visualisere injeksjon prosess (A). Etter fylt med DNA konstruerer, er midbrains electroporated med en firkantet bølge electroporator. Embryoer er videre inkuberes til ønsket HH scenen 23 er nådd. Deretter mCherry-positive embryoer høstes, fast, og innebygd (B). Midbrain cryosections er utarbeidet med å kutte fly indikert av den hvite linjen i figur 1B, og analysert ved farging med midbrain markører som Tyrosin hydroksylase (TH) (C). Klikk herfor å se større figur.

Figur 2. Utarbeidelse av cryosections fra embryonale chick midbrain. Etter 41 timer inkubering, er HH stage 23 kyllingembryo uttrykker mCherry og gener av interesse høstet (A, B og C), festet med PFA, behandlet med sukrose, og innebygd i oktober for cryosectioning. Kyllingembryo er nøye orientert for å sikre utarbeidelse av midbrain seksjoner. En typisk embryo morfologi og skjæring flyet for å skaffe midbrain seksjoner er vist (D). Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Analyse av electroporated midbrain seksjoner. Cryosections fra embryoer med høye nivåer av mCherry uttrykk (A) er utarbeidet og farget med antibodtallet som anerkjenner Flag-merket genet av interesse (B) og midbrain dopaminerge nevroner markør TH (C). Embryonale midbrains electroporated med pCAG-mCherry og pCAG-Flag tom vektor tjene som kontroll. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Den i ovo electroporation av embryonale dama midbrain tilbyr en lav pris og rask alternativ til generering av transgene eller knockout dyr til å utføre in vivo studier av gen-funksjoner i midbrain dopaminerge nevroner utvikling. Bruke kort 2 mm lange L-formet platina elektroder sammen med embryonale midbrain-spesifikk DNA injeksjon er nøkkelen for å oppnå effektiv uttrykk av genet av interesse i midbrain dopaminerge nevroner stamfedre. I tillegg bruker riktige HH sceniske 11 kyllingembryo er kritisk. Dette er fordi første, ved HH stadium 11, er utvikling av dama midbrain avansert nok slik at forebrain, midbrain, og hindbrain er morfologisk gjenkjennelig. Dette gir mulighet for nøyaktig posisjonering av kanyle og elektroder på midbrain regionen, og dermed effektiv DNA injeksjon og transfeksjon. Second, ved HH scene 11, er den fremre neuropore av kylling embryo enda ikke helt lukked, slik at den injiserte plasmid DNA enkelt gå inn spesifikt inn midbrain regionen. De smale veikryss mellom embryonale forebrain, midbrain og hindbrain også bidra til å hindre rask spredning av DNA konstruerer injisert spesifikt inn midbrain. Endelig embryo på senere stadier har en tendens til å krølle hodet til siden av nevrale aksen, noe som gjør det svært vanskelig å målrette elektroden spesifikt på midbrain. Inkubasjonstiden er nødvendig for å oppnå HH iscenesette 11 embryoer kan variere noe i respons til avvik i inkubasjonstemperatur, samt naturlige forskjeller mellom egg. Under våre eksperimentelle forhold, tar det ca 41 timer inkubering ved 100 ° C.

For å oppnå embryonale chick midbrain seksjoner for analyse, innebygging og kutte midbrains i riktig retning er svært kritisk. Førtien timer etter electroporation, kyllingembryo ofte vise en morfologi som ligner på Figur 2D. Forbereder cryosections med enkutte plan parallelt med de vist i figur 2D maksimerer sjansen for å få riktige midbrain seksjoner for videre farging og kvantifisering.

Det faktum at midbrain-spesifikk ektopisk genuttrykk kan oppnås ved electroporation åpner opp muligheten for at denne tilnærmingen kan brukes til andre regioner i det sentrale nervesystemet. Plasseringen av injeksjon, samt plassering av elektrodene, kan påvirke hjernen regioner som effektivt transfekterte med DNA konstruksjoner ^7,15. Denne teknikken kan også vise seg nyttig for å redusere spesifikke genuttrykk i midbrain av RNAi-mediert knockdown ^16. Tilsvarende kan lett modifiserte teknikker iverksettes for å studere genregulering ved å uttrykke enhancers knyttet til reporter gener for å identifisere, kart og karakterisere nye regulatoriske regioner fra gener i den dama. Da gjaldt mus embryoer, ville denne teknikken være mye raskereog enklere å bruke enn klassiske transgene tilnærminger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized chicken eggs	Charles River Laboratories
Egg incubator	GQF Manufacturing	1502 Sportsman
BTX Electroporator	BTX Harvard Apparatus	ECM830
Electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0162 L-shaped genetrodes	For use with ECM830 electroporator
Platinum iridium wire	Alfa Aesar	#10056	0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes
Glass capillary tube	World Precision Instrument	TW100F-4
Microloader pipette tip	Eppendorf	5242 956.003
India ink	Staples		Filter 20% before use
Microinjector	Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation	Picospritzer III
Fluorescent dissection microscope	Leica	MZ16F
Micropipette puller	Sutter Instrument	D-97