Summary
Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste en
Abstract
Las neuronas dopaminérgicas en el movimiento del mesencéfalo ventral de control, el comportamiento emocional y los mecanismos de recompensa 1-3. La disfunción de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral, está implicado en la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, la depresión y la demencia 1-5. De este modo, el estudio de la regulación de la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, no sólo podría proporcionar información importante sobre los mecanismos que regulan el desarrollo del cerebro medio y la especificación progenitoras neurales destino, sino también ayudar a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de una variedad de trastornos neurológicos humanos.
Las neuronas dopaminérgicas diferenciarse de progenitores neurales que recubren la zona ventricular del cerebro medio ventral embrionario. El desarrollo de progenitores neurales está controlado por programas de expresión génica 6,7. Aquí mostramos las técnicas que utilizan la electroporación para expresar los genes específicamente en el cerebro medio de Hamburger y Hamilton (HH) la 11 ª etapa (tsomitas irteen, 42 horas), los embriones de pollo 8,9. El desarrollo de embriones de pollo externa permite convenientes manipulaciones experimentales en determinadas etapas embrionarias, con los efectos determinados en los puntos de tiempo posteriores del desarrollo 10-13. Polluelo de tubos neurales embrionarias antes del estadio HH 13 (diecinueve somitas, 48 horas) consistirá en multipotenciales progenitoras neuronales que son capaces de diferenciarse en distintos tipos de células del sistema nervioso. El vector pCAG, que contiene tanto un promotor de CMV y un polluelo β-actina potenciador, permite la expresión robusta de la bandera o otras construcciones etiquetados epítopo en tubos de embriones de pollo neural 14. En este informe, hacemos hincapié en las medidas especiales para lograr la expresión de genes regional restringido en mesencéfalo dopaminérgicas embrionarias progenitoras neuronales, incluyendo cómo inyectar ADN construye específicamente en la región del cerebro medio embrionario y cómo identificar electroporación con pequeños electrodos hechos a la medida. El análisis de ccerebro medio cateto en etapas posteriores ofrece un excelente sistema in vivo para el plásmido vector-mediado por el aumento de la función y la pérdida de la función de los estudios del desarrollo del cerebro medio. La modificación del sistema experimental puede extender el ensayo a otras partes del sistema nervioso para realizar análisis destino mapeo y para investigar la regulación de la expresión génica.
Protocol
1. Suministro preparación (no en vídeo)
- Preparar una dilución nueva 1X de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) en 1X PBS. No más de 50 mL es necesario. Filtrar con un filtro de 0,22 micras jeringa.
- Preparar las construcciones de inyección mediante la combinación de construcciones de plásmidos deseados. Ponemos todas las construcciones en el vector pCAG-Bandera con estequiometría apropiada para un volumen final de ~ 10 l. Además, pCAG-GFP 14 o pCAG mCherry-se debe agregar para la eficiencia de la electroporación de seguimiento y células electroporadas. Usamos pCAG-mCherry para este experimento. Por último, añadir 0,22 micras-filtró colorante Fast Green en la mezcla de ADN del plásmido a una concentración final de 0,05% para visualizar la eficiencia de la inyección en midbrains de embriones de pollo.
2. La preparación de huevo (en vídeo)
- Con el fin de adquirir la etapa de HH 11 embriones, los huevos deben ser incubados a 100 ° F (37,8 ° C) durante aproximadamente 41 horas después de la fertilización con 25-40% de humedad. Lugarlos huevos de su lado y marcar la parte superior de cada uno con un toque de lápiz. Coloque las bandejas en un pre-calentado, humidificado incubadora. Poco a poco el rock los huevos mediante el establecimiento de la función de giro de las plataformas de la incubadora en "Automático". Revise el nivel de humedad y el agua cada 24 horas.
- Justo antes de empezar el experimento, eliminar los huevos de la incubadora y dejar a temperatura ambiente. Esto ayudará a frenar el desarrollo y prevenir sobre el desarrollo.
- Limpie la superficie de cada huevo con un 70% de etanol y limpie con un Kimwipe.
- Tomar dos piezas de 4 cm de cinta adhesiva y pegarlos de lado a lado en el óvulo para formar un rectángulo grande sobre el tablero lápiz. Alise la cinta contra el huevo. Aquí es donde la ventana se hará. La cinta evitará pequeños trozos de cáscara de huevo se caiga de la ventana cuando se corta.
- Use una jeringa de 10 ml y 18 ½ aguja de calibre para dibujar a 5 ml de albúmina del huevo. Después de perforar la cáscara, el ángulo de la aguja fuera de la yema de no perturbaro dañar el embrión mientras se quita la albúmina. Limpie la aguja con etanol al 70% entre los huevos, pero asegúrese de que la aguja esté seco antes de perforar el siguiente huevo.
3. Inyección de cristal con aguja de preparación (en vídeo)
- Agujas de inyección se realizan con los siguientes ajustes en un Flaming / Brown Micropipeta extractor (Modelo de Instrumento de Sutter P-97):. Heat 670, Pull 120, Vel 40, Tiempo 165 World Precision Instruments (API) de 4 pulgadas de 1,0 mm de espesor de pared de vidrio capilar (API TW100F-4) se utiliza para fabricar agujas.
- Coloque una aguja de vidrio tirado con una pipeta P10 y el largo de punta capilar de carga punta de la pipeta (Eppendorf 5.242.956,003). Cargar l 5-10, en función de cuántos huevos son para ser inyectado. Completa la aguja de cristal lentamente, creando una columna continua de solución plásmido ausente de burbujas de aire.
- Colocar la aguja cargada en el soporte de aguja unida a la micromanipulador (Narishige MM3) y la microinyector Picospritzer III. Ver la aguja en un dissectien microscopio y recortar la aguja en el punto donde el líquido verde se detiene. Ayuda a utilizar un fondo oscuro para visualizar mejor la aguja. Correcta de la aguja de corte viene con la práctica.
4. Mesencéfalo / inyección del tubo neural (en vídeo)
- Con unas tijeras para cortar la primavera una ventana 2-2.5 cm de diámetro en el huevo. Inicio de la ventana del agujero de la aguja anterior realizada en la elaboración de albúmina, y girar el huevo en la mano mientras corta. Asegúrese de limpiar las tijeras con un Kimwipe saturado en etanol al 70% entre los huevos.
- Ver embriones de pollo bajo un microscopio de disección. Puede que sea necesario para formar los ojos. Se puede ayudar a visualizar el embrión mediante la inyección de 0,22 m con filtro de 20% de tinta china en PBS en el embrión de pollo. Sin embargo, hemos encontrado que este paso debe ser evitado si es posible, ya que tiende a disminuir la supervivencia.
- Inyección funciona mejor si el embrión se coloca en paralelo a la trayectoria de la aguja, con la cabeza de la aguja.Poco a poco perforar el tubo neural en un ángulo de 45 grados a la unión del cerebro medio-hindbrain. Es muy importante para llenar sólo la vesícula neuronal que representa el cerebro medio con el ADN del plásmido y el colorante Fast Green, sin una difusión significativa en las regiones del cerebro anterior y posterior del cerebro. Comenzar a inyectar con el conjunto de la duración de la microinyector Picospritzer de menos de 25 ms, lo que puede ser necesario cambiar dependiendo de la aguja de corte. En general, el uso entre 10-50 ms.
5. La electroporación (en vídeo)
- Recuperar la aguja de inyección. Colocar 3 gotas de Pen 1X / Strep en solución de PBS en el huevo sobre el embrión.
- Compruebe la configuración de la toxina botulínica electroporador EMC830:
TENSIÓN: 20 V Duración de impulso: 25 ms Número de Legumbres: 3 INTERVALO: 500 ms POLARIDAD: - Colocar los electrodos de platino 2 mm de largo en forma de L en el mismo nivel horizontal que el fondo del tubo neural, con el cerebro medio embrionario sentado en el centro entre dos electrodos 3 mm entre sí. La alineación de los electrodos con la parte inferior del tubo neural es crítico para la electroporación eficiente del mesencéfalo ventral. Para alcanzar el cerebro medio específico de la electroporación, que reemplazaron a los electrodos de BTX originales con dos hechos a la medida de platino en forma de L con electrodos cortos 2 puntas mm de largo. Estos electrodos de platino son de 0,5 mm de diámetro alambres de platino (Alfa Aesar). Estos electrodos de platino son lo suficiente para cubrir el cerebro medio de un embrión en su fase de pollo 11, que es de aproximadamente 0,9 mm de largo, sin focalización gran parte del cerebro anterior o de las regiones del cerebro posterior. Pulse el pedal BTX una vez. Las burbujas de aire se deben generar alrededor de los electrodos con cada uno de electroporación éxito. Retire con cuidado los electrodos del huevo y limpie la electrodas con un Kimwipe 70% de etanol-cubierto. Coloque otros 3 gotas de Pen 1X / solución estreptococo en el huevo, en el embrión.
- Cubra la ventana con unos 5 cm x 5 cm de la pieza de cinta de embalaje transparente. Asegúrese de sellar el huevo bien y que el contenido de huevo no entren en contacto con la cinta.
6. Incubar y la Cosecha
- Coloque los huevos de nuevo en la incubadora. Asegúrese de que el giro de las plataformas de la incubadora está en OFF. Incubar los huevos hasta que aparezca el estadio 23 HH se logra.
- Cosecha de embriones vivos y colocarlos en PBS-comunes llenas de placas de Petri para cada condición. Pantalla de embriones cosechados bajo un microscopio de disección fluorescente, manteniendo sólo los embriones con la expresión mCherry.
- Transferencia de embriones en los distintos pozos de una placa de 24 pocillos. Llene cada pocillo con 1 ml de paraformaldehído recién hecha el 2% (PFA) y que permiten fijar 2-3 horas a 4 ° C.
- Lavar embriones fijos tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS. Embriones lugar secuencialmente in 15% y 30% de sacarosa hasta equilibró. Los embriones inicialmente flotan en sacarosa, pero se hunde al llegar al equilibrio.
- Compruebe embriones en virtud de un microscopio de disección fluorescente, tomando notas en el patrón de expresión mCherry y nivel de cada embrión. Insertar cada embrión en octubre Es muy crítico a los embriones orientar adecuadamente para generar óptimas secciones transversales del cerebro medio para análisis posteriores (Figura 1).
- Preparar las secciones 18 micras de espesor del cerebro medio usando un criostato Leica CM3050S. Analizar el desarrollo del cerebro medio y la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas por inmunotinción con las correspondientes marcadores de células de tipo.
7. Los resultados representativos
Una representación esquemática de electroporación y analizar mesencéfalo de embriones de pollo se muestra en la Figura 1. En los embriones de pollo inyectados con éxito y la electroporación, la expresión mCherry debe ser visible en la región del cerebro medio después de un mayor desarrollo (
Expresión mCherry insuficiente sugiere que los genes se ectópicos no es probable expresan eficientemente. Los embriones bajo esta condición no debe ser utilizado para estudios posteriores. Del mismo modo, los embriones queno sobrevivieron hasta el final del procedimiento experimental no puede ser utilizado para la recogida de datos y análisis.
Figura 1. Ilustración del cerebro medio de embriones de pollo en el ensayo de electroporación in ovo. HH etapa 11 embriones de pollo embrionarias son inyectados con pCAG-mCherry junto con genes de interés mezclados con verde rápido para visualizar el proceso de inyección (A). Después de lleno con construcciones de ADN, se midbrains electroporación con un electroporador onda cuadrada. Los embriones se incuban hasta que se desea etapa HH 23 se alcanza. Luego mCherry positivos embriones son cosechadas, fijo, y embebido (B). Cryosections Mesencéfalo se preparan con cortar planos indicados por la línea blanca en la Figura 1B, y se analizaron por inmunotinción con marcadores mesencéfalo tales como tirosina hidroxilasa (TH) (C). Haga clic aquípara ampliar la figura.
Figura 2. Preparación de cryosections de mesencéfalo de embriones de pollo. Después de 41 horas de incubación, HH etapa 23 embriones de pollo que expresan mCherry y los genes de interés se cosechan (A, B y C), se fijaron con PFA, tratados con sacarosa, y sumergida en octubre de cryosectioning. Los embriones de pollo son cuidadosamente orientados a garantizar la preparación de las secciones del cerebro medio. Una típica morfología del embrión y el plano de corte para la obtención de las secciones del cerebro medio se muestran (D). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Análisis de las secciones del cerebro medio electroporadas. Criosecciones a partir de embriones con altos niveles de expresión mCherry (A) se preparan y se tiñeron con anticuerposs que reconocen la Bandera de etiquetado gen de interés (B) y el mesencéfalo dopaminérgica neuronal marcador de TH (C). Midbrains embrionarias electroporadas con pCAG-mCherry y pCAG-Bandera vector vacío como control. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
La electroporación in ovo en el cerebro medio de los embriones de pollo ofrece una alternativa de bajo costo y rápida a la generación de animales transgénicos o knockout para realizar el estudio in vivo de las funciones de los genes en el cerebro medio dopaminérgico el desarrollo neuronal. Usando corto 2 mm de electrodos de platino largos en forma de L, junto con la inyección de ADN embrionario mesencéfalo-específico es la clave para lograr una expresión eficaz del gen de interés en progenitores mesencéfalo dopaminérgicas neurona. Además, el uso correcto HH etapa 11 embriones de pollo es crítica. Esto se debe en primer lugar, en la etapa de HH 11, el desarrollo del cerebro medio pollito está avanzado lo suficiente para que el cerebro anterior, cerebro medio y cerebro posterior son morfológicamente distinguibles. Esto permite la colocación exacta de la aguja de inyección y los electrodos en la región del mesencéfalo, y la inyección de ADN así eficiente y transfección. En segundo lugar, a las HH etapa 11, el neuroporo anterior del embrión de pollo aún no se cierra completamented, permitiendo que el ADN del plásmido inyectado para entrar fácilmente específicamente en la región del mesencéfalo. Las uniones estrechas entre el prosencéfalo embrionario, mesencéfalo y rombencéfalo también ayudan a prevenir la difusión rápida de las construcciones de ADN que inyecta específicamente en el cerebro medio. Por último, los embriones en etapas posteriores tienden a curvarse sus cabezas hacia el lado del eje neural, lo que es muy difícil dirigir el electrodo específicamente en el cerebro medio. El tiempo de incubación necesario para obtener HH etapa 11 embriones puede variar ligeramente en respuesta a desviaciones de la temperatura de incubación, así como las diferencias físicas entre los huevos. Bajo condiciones experimentales, se tarda aproximadamente 41 horas de incubación a 100 ° F.
Para obtener las secciones del cerebro medio embrionarias de pollo para el análisis, la incorporación y el corte midbrains en la orientación correcta es muy importante. Cuarenta y una hora después de la electroporación, embriones de pollo a menudo presentan una morfología similar a la Figura 2D. Preparación cryosections con unde corte plano paralelo a las que se muestran en la Figura 2D maximiza la probabilidad de contraer secciones correctas del cerebro medio de inmunotinción más y cuantificación.
El hecho de que mesencéfalo-expresión de genes específicos ectópico puede lograrse mediante electroporación abre la posibilidad de que este enfoque puede ser aplicado a otras regiones del sistema nervioso central. La localización de la inyección, así como el posicionamiento de los electrodos, pueden afectar significativamente a las regiones del cerebro que son eficientemente transfectadas con construcciones de ADN 7,15. Esta técnica también puede ser útil en la reducción de la expresión de genes específicos en el cerebro medio por RNAi mediada por derribo 16. Del mismo modo, las técnicas ligeramente modificados pueden aplicarse para estudiar la regulación de genes de expresión de los potenciadores relacionados con genes reporteros para identificar, mapear y caracterizar nuevas regiones reguladoras de los genes en el pollo. Cuando se aplica a embriones de ratón, esta técnica sería mucho más rápiday fácil de utilizar que los enfoques clásicos transgénicas.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses en conflicto potencial a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Takahiko Matsuda para la prestación del pCAG-mCherry construir. YCM está respaldada por un premio de Desarrollo de la Carrera de la Fundación Schweppe y una beca de la Fundación Whitehall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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