Summary
Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt dat
Abstract
Dopaminerge neuronen in het ventrale middenhersenen controle beweging, emotioneel gedrag en beloning mechanismen 1-3. Het disfunctioneren van ventrale middenhersenen dopaminerge neuronen betrokken is bij de ziekte van Parkinson, schizofrenie, depressie en dementie 1-5. Zo kon het bestuderen van de regulering van de middenhersenen dopaminerge neuron differentiatie niet alleen belangrijk inzicht in de mechanismen tot regeling van middenhersenen ontwikkeling en neurale voorlopercellen lot specificatie, maar ook de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van een verscheidenheid van menselijke neurologische aandoeningen.
Dopaminerge neuronen te onderscheiden van neurale voorlopercellen langs de ventriculaire zone van de embryonale ventrale middenhersenen. De ontwikkeling van neurale voorlopercellen wordt gecontroleerd door genexpressie-programma's 6,7. Hier melden wij technieken gebruik te maken van elektroporatie om specifiek te uiten genen in de middenhersenen van Hamburger Hamilton (HH) etappe 11 (eirteen somieten, 42 uur) kippenembryo's 8,9. De externe ontwikkeling van kippenembryo's zorgt voor een handige experimentele manipulaties op specifieke embryonale stadia, met de effecten die op een later ontwikkelingstijd punten 10-13. Chick embryonale neurale buizen eerder dan HH stadium 13 (negentien somieten, 48 uur) bestaat uit multipotente neurale voorlopercellen die in staat zijn te differentiëren in verschillende celtypes van het zenuwstelsel. De pCAG vector, die zowel een CMV-promotor en een chick β-actine enhancer bevat, zorgt voor een krachtige uiting van vlag of een andere epitoop-gemerkte constructen in embryonale kuiken neurale buizen 14. In dit rapport, benadrukken we speciale maatregelen voor de regionale beperkte genexpressie te bereiken in embryonale middenhersenen dopaminerge neuron voorouders, met inbegrip van hoe te injecteren DNA-constructen in het bijzonder in de embryonale middenhersenen regio en hoe elektroporatie lokaliseren met kleine custom-made elektroden. Het analyseren van cHick middenhersenen later stadium een uitstekende in vivo voor plasmide vector-gemedieerde gain-of-functie en verlies-van-functie studies van middenhersenen ontwikkeling. Wijziging van de experimentele systeem kan verlengen assay naar andere delen van het zenuwstelsel voor het uitvoeren lot mapping analyse en onderzoeken van de regulering van de genexpressie.
Protocol
1. Levering Voorbereiding (niet in video)
- Bereid een frisse 1x verdunning van penicilline / streptomycine (Pen / Strep) in 1X PBS. Niet meer dan 50 ml noodzakelijk. Filter met een 0,22 pm spuitfilter.
- Bereid injectie constructen door het combineren gewenste plasmide constructen. We hebben allemaal constructies zetten in de pCAG-Flag vector met de juiste stoichiometrie tot een uiteindelijk volume van ~ 10 pl. Ook moet pCAG-GFP 14 of pCAG-mCherry worden toegevoegd voor het bijhouden van elektroporatie efficiëntie en geëlektroporeerde cellen. We maken gebruik van pCAG-mCherry voor dit experiment. Tenslotte voegt 0,22 pm gefiltreerd Fast Green kleurstof in het plasmide DNA mengsel bij een eindconcentratie van 0,05% de injectierendement visualiseren in een embryonale kuiken midbrains.
2. Egg Voorbereiding (in video)
- Om HH trap 11 embryo verkrijgen, eieren moeten worden geïncubeerd bij 100 ° F (37,8 ° C) gedurende 41 uur na de bevruchting van 25-40% vocht. Plaatseieren aan hun kant en markeer de bovenkant van elke met een potlood streepje. Plaats bakken in een voorverwarmde, bevochtigde incubator. Langzaam rocken eieren door de draaiende functie van de incubator platforms "Automatic". Controleer de vochtigheid en water elke 24 uur.
- Vlak voor het starten van het experiment verwijderen eieren van incubator en verlaat bij kamertemperatuur. Dit zal helpen om het afremmen van de ontwikkeling en over de ontwikkeling te voorkomen.
- Reinig het oppervlak van elk ei met 70% ethanol en veeg af met een Kimwipe.
- Neem twee 4 cm stukjes plakband en plak ze side-by-side op het ei tot een grote rechthoek over het potlood dashboard te maken. Strijk de band tegen het ei. Dit is waar het venster wordt gemaakt. De band wordt voorkomen dat kleine stukjes eierschaal valt uit wanneer het venster wordt opengesneden.
- Gebruik een 10 ml spuit en 18 ½ gauge naald voor aan 5 ml van albumine uit het ei te tekenen. Na het doorprikken van de shell, weg hoek van de naald uit de dooier als niet te storenof beschadiging van het embryo tijdens het verwijderen van albumine. Maak de naald met 70% ethanol tussen eieren, maar zorg ervoor dat de naald droog is voordat het doorboren van de volgende ei.
3. Glas injectienaald Voorbereiding (in video)
- Injectienaalden worden gemaakt met behulp van de volgende instellingen op een Flaming / Bruin Micropipet Puller (Sutter Instrument Model P-97): Heat 670, Pull 120, Vel 40, Time 165. Wereld Precision Instruments (API) 4 inch 1,0 mm dunne wand capillaire glas (API TW100F-4) wordt gebruikt om de naalden te maken.
- Plaats een getrokken glas naald met een P10 pipet en de lange-tip capillaire laden pipetpunt (Eppendorf 5242956,003). Laad 5-10 uL, afhankelijk van hoeveel eieren moeten worden geïnjecteerd. Vul langzaam de glazen naald, het creëren van een doorlopende kolom van plasmide oplossing afwezig van luchtbellen.
- Plaats de geladen naald in de naaldhouder aan de micromanipulator (Narishige MM3) en de Picospritzer III microinjector. Bekijk de naald onder een dissectiop de microscoop en trim de naald op het punt waar de groene vloeistof stopt. Het helpt om een donkere achtergrond te gebruiken om beter te visualiseren de naald. Een goede naald trimmen komt met de praktijk.
4. Middenhersenen / Neural Tube injectie (in video)
- Gebruik de lente schaar om een 2-2,5 cm diameter venster in het ei te snijden. Start het venster van de vorige naald gat gemaakt bij het opstellen albumine, en draai het ei in de hand als u snijdt. Zorg ervoor dat u schoon te maken uit de schaar, met een Kimwipe verzadigd in 70% ethanol tussen de eieren.
- Bekijk kippenembryo's onder een dissectie microscoop. Het kan nodig zijn om de ogen te leiden. Het kan helpen om het embryo te visualiseren door het injecteren van 0,22 pm gefiltreerd 20% Oost-Indische inkt in PBS in het kippenembryo. We hebben echter gevonden dat deze stap moet worden vermeden indien mogelijk, de neiging te dalen overleven.
- Injectie best werkt als de embryo wordt geplaatst naast de baan van de naald met de kop van de naald.Langzaam doorboren de neurale buis in een hoek van 45 graden aan de middenhersenen-achterhersenen kruising. Het is van groot belang om het vult alleen de neurale blaasje die de middenhersenen met plasmide DNA en snel groen kleurstof, zonder noemenswaardige diffusie in de voorhersenen en de achterhersenen regio's. Begin het injecteren met een duur van de Picospritzer microinjector de set van 25 ms, dit moet mogelijk worden veranderd, afhankelijk van de naald trimmen. In het algemeen gebruikt tussen 10-50 ms.
5. Elektroporatie (in video)
- Haal de injectienaald. Plaats 3 druppels 1X Pen / Strep in PBS oplossing in het ei op het embryo.
- Controleer de instellingen van de BTX EMC830 electroporator:
SPANNING: 20 V PULSE afstand: 25 ms # PEULVRUCHTEN: 3 INTERVAL: 500 ms POLARITY: - Plaats 2 mm L-vormige platina elektroden op dezelfde hoogte als de bodem van de neurale buis, de embryonale middenhersenen zit in het midden tussen twee 3 mm van elkaar elektroden. Uitlijnen de elektroden met de onderkant van de neurale buis is kritisch voor een efficiënte elektroporatie van de ventrale middenhersenen. Om middenhersenen-specifieke elektroporatie bereiken, hebben we de oorspronkelijke BTX elektroden vervangen door twee custom-made platina L-vormige elektroden met korte 2 mm lang tips. Deze platina elektroden zijn gemaakt van 0,5 diameter platina draad (Alfa Aesar). Deze platina-elektroden zijn net lang genoeg om de middenhersenen van een trap 11 kippenembryo, dat is ongeveer 0,9 mm lang, zonder gericht op een groot deel van de voorhersenen of de achterhersenen regio's te dekken. Druk op de BTX voetschakelaar een keer. Luchtbellen worden gegenereerd over de elektroden met elkaar succesvolle elektroporatie. Haal de elektroden uit het ei en veeg de elektrodes af met een 70% ethanol bedekte Kimwipe. Leg nog eens 3 druppels 1X Pen / Strep oplossing in het ei, op het embryo.
- Bedek het venster met een 5 cm x 5 cm stuk van duidelijke verpakking tape. Zorg het ei afdichting goed en de ei-inhoud niet in contact komen met de band.
6. Incubate en Harvest
- Plaats de eieren in de incubator. Zorg ervoor dat het draaien van incubator platforms is uitgeschakeld. Incubeer eieren tot de gewenste HH fase 23 wordt bereikt.
- Oogst levende embryo's en plaats ze in gewone PBS gevulde Petri gerechten voor elke conditie. Scherm geoogst embryo's onder een tl-dissectie microscoop, en houd alleen embryo's met mCherry expressie.
- Transfer embryo's in afzonderlijke putjes van een 24-goed gerecht. Vul elk putje met 1 ml verse 2% paraformaldehyde (PFA) en laat 2-3 uur vast bij 4 ° C.
- Was de vaste embryo's drie keer voor 10 minuten elk in PBS. Plaats embryo's na elkaar in 15% en 30% sucrose tot evenwicht. Embryo's zullen in eerste instantie drijven in sacharose, maar zal zinken op evenwicht.
- Controleer of embryo's onder een tl-dissectie microscoop, het maken van aantekeningen op de mCherry expressie patroon en voor elke embryo. Embedden elk embryo in oktober Het is zeer kritisch oriënteren embryo goed optimale middenhersenen doorsneden vervolgens geanalyseerd (figuur 1) te genereren.
- Bereid 18 pm dik middenhersenen secties met een Leica CM3050S cryostaat. Analyseer middenhersenen ontwikkeling en dopaminerge neuron differentiatie door immunokleuring met de juiste celtype markers.
7. Representatieve resultaten
Een schematische weergave van electroporating en analyseren embryonale kuiken middenhersenen is weergegeven in figuur 1. In succes geïnjecteerd en geëlektroporeerd kippenembryo's, moet mCherry uitdrukking zichtbaar zijn in de middenhersenen regio na verdere ontwikkeling (
Onvoldoende mCherry expressie suggereert dat ectopische genen kunnen niet doeltreffend uitgedrukt. Embryo's onder deze voorwaarde mag niet worden gebruikt voor verdere studies. Evenzo embryo'sniet overleven het einde van de experimentele procedure kan niet worden gebruikt voor het verzamelen en analyse.
Figuur 1. Illustratie van de embryonale kuiken middenhersenen in ovo elektroporatie test. HH fase 11 embryonale kippenembryo's worden geïnjecteerd met pCAG-mCherry met genen van interesse gemengd met snelle groene de injectie te visualiseren (A). Na gevuld met DNA-constructen, worden midbrains geëlektroporeerd met een blokgolf electroporator. Embryo's worden verder geïncubeerd totdat de gewenste HH stadium 23 wordt bereikt. Dan mCherry-positieve embryo's worden geoogst, vast, en embedded (B). Middenhersenen vriescoupes worden bereid met het snijden van vliegtuigen wordt aangegeven door de witte lijn in figuur 1B, en geanalyseerd door immunokleuring met middenhersenen merkers zoals Tyrosine hydroxylase (TH) (C). Klik hiervoor grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Voorbereiding van vriescoupes van embryonale chick middenhersenen. Na 41 uur incuberen HH stadium 23 kippenembryo's expressie mCherry en genen van belang geoogst (A, B en C), gefixeerd met PFA behandeld met sucrose en ingebed in OCT voor cryosectioning. Kippenembryo's zijn zorgvuldig gericht op de voorbereiding van de middenhersenen secties te bevorderen. Een typisch embryo morfologie en het snijvlak voor het verkrijgen van middenhersenen secties worden getoond (D). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Analyse van geëlektroporeerde middenhersenen secties. Weefsel secties van embryo's met een hoge mate van mCherry expressie (A) worden voorbereid en gekleurd met Antibods dat de Flag-gelabeld gen van interesse (B) en middenhersenen dopaminerge neuronen marker TH (C) te herkennen. Embryonale midbrains geëlektroporeerd met pCAG-mCherry en pCAG-Flag lege vector dienen als controle. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in ovo elektroporatie van embryonale kuiken middenhersenen biedt lage kosten en snel alternatief voor het genereren van transgene of knockout dieren te voeren in vivo studie genfuncties in middenhersenen dopaminerge ontwikkeling. Met korte 2 mm L-vormige platina elektroden met embryonale middenhersenen specifieke DNA injectie is het van essentieel belang om efficiënte expressie van het gen van interesse in middenhersenen dopaminerge progenitors. Daarnaast, met behulp van de juiste HH stadium 11 kippenembryo's is van cruciaal belang. Dit komt omdat de eerste in HH trap 11, de ontwikkeling van kuiken middenhersenen wordt voortbewogen genoeg zodat de voorhersenen de middenhersenen en achterhersenen morfologisch onderscheiden. Dit maakt het nauwkeurig positioneren van de injectienaald en de elektroden op de middenhersenen gebied en dus efficiënt DNA injectie en transfectie. Ten tweede, bij HH stadium 11, de voorste neuropore van het kippenembryo is nog niet volledig worden geslotend, zodat de geïnjecteerde plasmide DNA gemakkelijk in het bijzonder het aangaan van de middenhersenen regio. De smalle kruispunten tussen embryonale voorhersenen, middenhersenen en de achterhersenen ook helpen om een snelle verspreiding van DNA-constructen die specifiek geïnjecteerd in de middenhersenen te voorkomen. Ten slotte, de embryo's in een later stadium hebben de neiging om hun hoofd krullen aan de zijkant van de neurale as, waardoor het erg moeilijk om de elektrode specifiek te richten op de middenhersenen. De incubatie tijd nodig om HH trap 11 embryo kan enigszins variëren afhankelijk van afwijkingen in incubatietemperatuur, alsmede natuurlijke verschillen tussen eieren. Onder de experimentele omstandigheden het ongeveer 41 uur incubatie bij 100 ° C.
Voor het verkrijgen embryonale kuiken middenhersenen delen voor de analyse, inbedden en snijden midbrains op de juiste oriëntatie is zeer kritisch. Eenenveertig uur na elektroporatie, kippenembryo's vaak een morfologie lijken op Figuur 2D. Voorbereiden vriescoupes met eensnijvlak evenwijdig aan die aangegeven zijn in figuur 2D maximaliseert de kans juiste middenhersenen voor nadere immunokleuring en kwantificering.
Dat middenhersenen-specifieke ectopische expressie kan worden bereikt door elektroporatie opent de mogelijkheid dat deze benadering kan worden toegepast op andere delen van het centrale zenuwstelsel. De ligging van de injectie en positionering van de elektroden, een significante invloed op de hersenen die doeltreffend zijn getransfecteerd met DNA constructen 7,15. Deze techniek kan ook nuttig zijn bij het verminderen van specifieke genexpressie in middenhersenen door RNAi-gemedieerde knockdown 16. Ook kan licht gewijzigde technieken worden toegepast om genregulatie te bestuderen met het uitspreken van enhancers gekoppeld aan reporter genen te identificeren, kaart, en de nieuwe regulerende gebieden karakteriseren van genen in het kuiken. Wanneer toegepast op muisembryo zou deze techniek veel snelleren gemakkelijker te gebruiken dan de klassieke transgene benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen potentieel tegenstrijdige belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
Wij danken Dr Takahiko Matsuda voor het verstrekken van pCAG-mCherry te bouwen. YCM wordt ondersteund door een Career Development Award van de Schweppe Foundation en een subsidie van de Whitehall Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
