Summary
评估的功能和在发展中脑多巴胺能神经元的基因调控，我们描述了一种方法，涉及
Abstract
多巴胺能神经元位于中腹脑控制的运动，情绪化的行为，和奖励机制1-3。腹侧中脑多巴胺神经元功能障碍是帕金森氏症，精神分裂症，抑郁症，老年痴呆症1-5牵连。因此，研究中脑多巴胺神经元分化的调节不能只提供重要的洞察到调节脑发育和神经祖命运规范机制，而且还有助于开发治疗多种人类神经系统疾病的新的治疗策略。
多巴胺神经元分化从排队心室胚胎腹侧中脑区的神经祖细胞。神经祖细胞的发展，控制基因表达方案6,7。在这里，我们报告技术利用电汉堡汉密尔顿（HH）阶段11脑基因表达（THirteen体节，42小时）鸡胚8,9。允许在特定的萌芽阶段的实验操作方便，在后来的发展时间点10-13决定的影响，的鸡胚外部发展。鸡胚早期阶段，13（19体节，48小时）超过HH神经管组成的具有多能分化成不同类型的细胞神经系统的神经祖细胞。的pCAG载体，其中包含CMV启动子和小鸡β-actin的增强，使强大的标志或其他抗原标记的鸡胚神经管14结构表达。在这份报告中，我们强调特别措施，以实现区域限制的基因表达，在胚胎中脑多巴胺能神经元祖细胞，包括如何注入DNA构建专门的胚胎中脑区域，以及如何针对小定制电极电。分析C希克在稍后阶段的脑体内质粒载体介导的增益功能和亏损的功能研究脑发展系统提供一个很好的。实验系统的改造，可以延长该法执行的命运映射分析和研究基因表达调控神经系统的其他部分。
Protocol
1。提供制备（没有视频）
- 青霉素/链霉素在1X PBS（PEN /链球菌）准备一个新鲜的1X稀释。不超过50毫升，是必要的。用0.22微米的注射器过滤器过滤。
- 准备注射结合所需的质粒结构结构。到终体积10μL适当的化学计量学在的pCAG标志矢量我们把所有的结构。此外，14 pCAG-GFP或pCAG-mCherry应增加用于跟踪电效率和电穿孔细胞。我们用这个实验pCAG-mCherry。最后，在终浓度为0.05％，0.22微米过滤快速的绿色染料到胚胎小鸡midbrains的可视化的质粒DNA混合物注入效率。
2。蛋制备（视频）
- 为了获得农户11阶段的胚胎，卵需要培养100华氏度（37.8°）约41小时后施肥与25-40％的湿度。地方鸡蛋和他们一边用铅笔划线标记每个顶部。放置托盘中预温，湿的孵化器。慢慢地摇动鸡蛋孵化平台转向功能设置“自动”。“检查湿度水位每24小时。
- 在实验开始前的权利，消除鸡蛋从孵化器，并在室温下离开。这将有助于减缓发展和防止过度开发。
- 每个鸡蛋的表面用70％乙醇的清洁和擦拭一个Kimwipe。
- 以两个4厘米的透明胶带件，并坚持他们端上鸡蛋大矩形比铅笔划线。对鸡蛋顺利磁带。这是将窗口。磁带将防止脱落窗口时切开小块蛋壳。
- 使用10 mL注射器和18½号针头画鸡蛋白蛋白出5毫升。揭开外壳后，针距角从蛋黄，以不打扰或损坏胚胎的同时去除白蛋白。 70％的鸡蛋之间的乙醇清洁的针，但要确保针头刺入下一个蛋之前是干。
3。玻璃注射针的制备（视频）
- 注射针头使用以下设置火焰/布朗微管普勒（萨特仪器型号P-97）：670热，拉120，VEL 40，时间165。世界精密仪器（API），4英寸1.0毫米薄壁毛细管玻璃（API TW100F-4）是用来使针。
- 使用P10的吸管和长尖毛细管装载枪头（Eppendorf公司5242956.003）加载拉玻璃针。加载5-10微升，取决于多少鸡蛋是被注入。填补玻璃针缓慢，气泡缺席质粒解决方案创建一个连续列。
- 放置显微操作（Narishige立方毫米）和Picospritzer的的第三微量注射器针头持有加载的针。根据dissecti针在显微镜和修剪针，在绿色的液体停止的地步。它有助于使用一个黑暗的背景，以更好地可视化针。适当的针修整与实践。
4。脑/神经管注射（视频）
- 使用春天剪刀剪卵的直径2-2.5厘米的窗口。开始从以前的针孔窗口绘制白蛋白时提出，在你的手和旋转的鸡蛋，你砍。务必清理与70％的鸡蛋之间的乙醇饱和Kimwipe剪刀。
- 查看夹层显微镜下的鸡胚。它可能是必要培训眼睛。它可以帮助可视化由0.22微米过滤20％的墨汁注射PBS根据鸡胚的胚胎。然而，我们已经找到了这一步，应尽量避免，因为它往往以降低生存。
- 注射效果最好，如果胚胎定位在平行针的路径，头部远离针。慢慢地刺进了45度角，以中脑，后脑交界处的神经管。这是非常关键的，不仅填补无显著扩散到脑和后脑区域代表与质粒DNA和快速的绿色染料脑的神经囊泡。开始注入与该Picospritzer微量注射器的时间设置为25毫秒，这可能需要改变取决于针修整。在一般情况下，使用10-50毫秒之间。
5。电（视频）
- 检索注射针头。地方3滴在PBS解决胚胎蛋的1X笔/链球菌。
- 检查设置BTX EMC830 electroporator：
电压： 20 V的 脉冲长度： 25毫秒 ＃脉冲： 3 区间： 500毫秒 极性： - 神经管的底部在同一水平位置放置2毫米长的L形的铂电极，与胚胎脑坐在中间的两个3毫米外电极之间。调整电极与神经管的底部是腹脑高效电的关键。为了实现特定脑，电，我们两个定制的L形铂电极短2毫米长的提示取代原来的A型肉毒毒素电极。这些铂电极直径0.5mm的铂丝（阿法埃莎）。这些铂电极有足够长的一个阶段11个鸡胚，这是约0.9毫米长，没有针对脑或后脑地区，包括中脑。按BTX的脚踏一次。应每个成功电电极周围产生气泡。从鸡蛋小心地取出电极和擦拭ELECTR用70％乙醇覆盖Kimwipe颂小康。将1X笔/链球菌的解决方案，在鸡蛋胚胎，另3滴。
- 覆盖5厘米×5厘米明确包装胶带一块的窗口。务必密封蛋和蛋内容不与磁带接触来。
6。培育和收获
- 将蛋放回孵化器。确保孵化平台的转折点是OFF。孵化蛋，直到达到所需的农户阶段23。
- 收获生活的胚胎和共同PBS填充培养皿放入每个条件。屏幕收获胚胎荧光解剖显微镜下，保持与mCherry表达只胚胎。
- 转移到个别井24井的菜的胚胎。填写1毫升新鲜的2％多聚甲醛（PFA）每口井，并允许以修复2-3个小时，在4°C。
- 洗三次固定的胚胎在PBS每10分钟。地方胚胎顺序我N 15％和30％的蔗糖，直至平衡。胚胎最初将浮在蔗糖，但会下沉时的平衡。
- 荧光解剖显微镜下检查胚胎，每个胚胎票据mCherry表达模式和水平上。在华侨城中嵌入每个胚胎。这是非常关键的东方胚胎的正常后续分析（ 图1），以产生最佳的脑截面。
- 准备18微米厚的脑部分使用徕卡CM3050S低温恒温器。通过与相应的细胞类型标记免疫分析脑发展和多巴胺神经元分化。
7。代表结果
如图1所示的电穿孔和分析鸡胚脑图解。在鸡胚注射和电穿孔成功，mCherry表达应该是在中脑区域的进一步发展后可见（
不足mCherry表达异位基因有可能不能有效地表示。在此条件下的胚胎不应该被用于进一步的研究。同样，胚胎不求生存，以实验过程结束，不能用于数据收集和分析。
图1。 在OVO电检测鸡胚脑的插图。 HH阶段11胚胎鸡胚注射与pCAG-mCherry连同快绿混合可视化（一）注射过程中基因的兴趣。与DNA结构的填充后，midbrains电穿孔方波electroporator。胚胎继续培养，直到达到所需的农户阶段23。然后收获mCherry阳性胚胎，固定的，和嵌入式（乙）。脑冰冻切片与切割白线表示在图1B飞机，准备与脑酪氨酸羟化酶（TH）（三）如标记免疫分析。 点击这里查看大图。
图2。从鸡胚脑冰冻切片的制备。经过孵化41小时，农户阶段23鸡胚表达利益mCherry和基因的收获（，A，B和C），固定与煤灰，与蔗糖处理，并嵌入在OCT为cryosectioning。鸡胚精心为导向，以确保脑节的筹备工作。一个典型的胚胎获取脑部分的形态和切削平面显示（D）， 点击这里查看大图 。
图3。电穿孔中脑部分的分析。从mCherry表达水平高的胚胎冰冻切片（一）编制及与antibod染色IES，识别标志标记基因的利益（B）和中脑多巴胺能神经元标记TH（三）。与pCAG mCherry和pCAG旗空载体作为控制电穿孔胚胎midbrains 点击这里查看大图 。
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Discussion
在鸡胚脑OVO电提供了一种低成本，快速的替代代转基因或基因敲除动物在中脑多巴胺神经元发育基因的功能进行的体内实验研究。使用短2毫米长L形的铂电极与胚胎脑特异的DNA注入是实现高效的兴趣在中脑多巴胺能神经元祖细胞的基因表达的关键。此外，使用正确的农户阶段11鸡胚是至关重要的。这是因为，第一，在农户阶段11，鸡脑的发展是不够先进等，前脑，中脑，后脑形态区分。这允许的注射针和电极在脑区，从而有效的DNA注入和转染的准确定位。其次，在现阶段农户11，鸡胚前神经尚未完全关闭D，使质粒DNA注入轻松地进入专门的脑区域。胚胎前脑，中脑和后脑之间的狭窄的路口，也有助于防止构造注入脑专门的DNA快速扩散。最后，在稍后阶段的胚胎往往卷曲头一侧的神经轴，很难专门针对脑电极。获得农户举办11胚胎孵化所需的时间可能会略有不同孵化温度偏差，以及鸡蛋之间的自然差异。我们的实验条件下，它需要培养41小时左右，在100°F。
为了获得鸡胚脑分析部分，嵌入和在正确的方向切割midbrains是非常关键的。电四十一小时后，鸡胚常显示形态相似， 图2d。准备1冰冻切片图2D所示的切平面平行，最大限度地得到正确的脑部分，为进一步的免疫组化和量化的机会。
脑特定异位基因表达，可以通过电打开了，这种方法可以应用到其他地区的中枢神经系统的可能性。在注射的位置，以及电极定位，可以显着影响，有效地与DNA结构7,15转的大脑区域。这种技术也可能被证明有助于减少特定基因的表达，在脑RNAi介导击倒16。同样，稍加修改的技术可实施记者基因识别，地图，以及新的监管区域特点，从基因在鸡胚表达增强的基因调控研究。当应用到小鼠胚胎，这项技术将更快比传统的转基因方法更容易使用。
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Disclosures
作者有没有潜在的利益冲突的披露。
Acknowledgments
我们感谢孝彦松田博士提供pCAG-mCherry建设。陶博馆的支持由从Schweppe基金会事业发展奖“，从白厅基金会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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