Summary
כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה המערבת
Abstract
נוירונים דופאמינרגיים הנמצאים בתנועה המוח התיכון הגחון שליטה, התנהגות רגשית, מנגנוני תגמול 1-3. תפקוד לקוי של המוח התיכון הגחון דופאמין נוירונים הוא מעורב מחלת פרקינסון, סכיזופרניה, דיכאון, דמנציה 1-5. לכן, לימוד ויסות התמיינות המוח התיכון דופאמין נוירון לא רק מספקים תובנה חשובה לתוך מנגנוני ויסות התפתחות המוח התיכון ואת המפרט עצבית גורל אבי, אלא גם לעזור לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במגוון הפרעות עצביות אדם.
נוירונים דופאמינרגיים להבדיל בין אבות עצביים המצפים את אזור החדר של המוח התיכון הגחון העוברית. הפיתוח של אבות עצביים נשלטת על ידי תוכניות ביטוי גנים 6,7. כאן אנו מדווחים על ניצול טכניקות electroporation לבטא גנים בפרט המוח התיכון הבמה המילטון (HH) המבורגר 11 (הsomites irteen, 42 שעות) ועוברים חומוס 8,9. פיתוח חיצוני של עוברים חומוס מאפשר מניפולציות ניסיוניים נוחים בשלבים עובריים ספציפיים, עם השפעות שנקבעו בנקודות זמן ההתפתחות לאחר מכן 10-13. חומוס צינורות עובריים עצביים מוקדמים יותר בשלב HH 13 (תשע עשרה somites, 48 שעות) מורכב אבות עצביים multipotent המסוגלים להבדיל את סוגי תאים שונים של מערכת העצבים. וקטור pCAG, המכיל גם מקדם CMV ו חומוס β-אקטין משפר, מאפשר ביטוי חזק של דגל או בונה epitope-מתוייגים אחרים צינורות חומוס עובריים עצביים 14. בדו"ח זה, אנו מדגישים באמצעים מיוחדים על מנת להשיג ביטוי גנים מוגבל לאזור של המוח התיכון עובריים אבות דופאמין נוירונים, כולל כמה להזריק DNA בונה במיוחד לאזור המוח התיכון עובריים וכיצד לאתר electroporation עם מחוייט אלקטרודות קטנות. ניתוח גהמוח התיכון כפרי בשלבים מאוחרים יותר מספק מצוין במערכת vivo עבור וקטור פלסמיד בתיווך רווח פונקציה של ואובדן-of-פונקציה מחקרים של התפתחות המוח התיכון. שינוי של מערכת הניסוי רשאי להאריך את assay לחלקים אחרים של מערכת העצבים לביצוע מיפוי וניתוח גורל לחקירת ויסות של ביטוי גנים.
Protocol
1. אספקת הכנה (לא וידאו)
- הכן דילול 1X חדש של סטרפטומיצין / פניצילין (עט / דלקת) ב 1X PBS. לא יותר מ 50 מ"ל הכרחי. לסנן עם מסנן 0.22 מזרק מיקרומטר.
- הכן בונה הזרקת ידי שילוב בונה פלסמיד הרצוי. שמנו את כל המבנים של וקטור pCAG, דגל עם stoichiometry המתאים לנפח הסופי של μL 10 ~. כמו כן, pCAG-GFP 14 או pCAG-mCherry יש להוסיף ליעילות electroporation מעקב תאים electroporated. אנו משתמשים pCAG-mCherry לצורך ניסוי זה. לבסוף, מוסיפים 0.22 מיקרומטר, סינון צבע ירוק מהיר לתוך תערובת הדנ"א פלסמיד בריכוז הסופי של 0.05% כדי להמחיש את יעילות הזרקה לתוך המוח האמצעי חומוס עובריים.
2. הכנת ביצה (וידאו)
- על מנת לרכוש בשלב HH 11 עוברים, ביצים יש מודגרות ב 100 מעלות (37.8 מעלות צלזיוס) במשך כ 41 שעות לאחר ההפריה עם לחות 25-40%. מקוםביצים על הצד שלהם ולסמן את החלק העליון של כל עם קורטוב עיפרון. מכניסים מגשים מחומם מראש, חממה humidified. אט אט רוק ביצים על ידי הגדרת הפונקציה מפנה של חממה פלטפורמות "אוטומטית". בדוק את רמת לחות מים כל 24 שעות.
- ממש לפני תחילת הניסוי, הסר ביצים מ בחממה ומשאירים בטמפרטורת החדר. זה יעזור להאט את ההתפתחות ולמנוע את הפיתוח.
- יש לנקות את פני השטח של כל ביצה עם 70% אתנול ו לנגב עם Kimwipe.
- קחו שתי חתיכות 4 ס"מ של נייר דבק ושמים אותם בצד ליד השני על ביצה לעשות מלבן גדול על מקף את העיפרון. להחליק את הסרט על הביצה. זה המקום בו חלון ייעשה. הקלטת ימנע חתיכות קטנות של קליפת מליפול כאשר החלון הוא חתך פתוח.
- השתמש מזרק 10 מ"ל ו - 18 ½ מחט מד לצייר 5 מ"ל של אלבומין את הביצה. אחרי חודרות את הקליפה, מסובב את המחט מן החלמון לא להפריעאו לגרום נזק לעובר תוך הסרת אלבומין. יש לנקות את המחט עם אתנול 70% בין הביצים, אך הקפד מחט יבש לפני חודרות את הביצה הבאה.
3. מחט זכוכית הכנה הזרקה (וידאו)
- מחטים הזרקת מבוצעים באמצעות ההגדרות הבאות ב לוהטים / בראון micropipette פולר (דגם סאטר מכשיר P-97): מחממים 670, משוך 120, לוול ךיב 40, שעה 165. העולם Precision מכשירים (API) 4 אינץ' 1.0 מ"מ רזה הקיר זכוכית נימי (API TW100F-4) משמש כדי להפוך את המחטים.
- טען מחט זכוכית משך באמצעות פיפטה P10 ו עצה ארוך נימי טוען פיפטה עצה (Eppendorf 5242956.003). טען μL 5-10, תלוי כמה ביצים יש להזריק. מלאו את המחט לאט זכוכית, יצירת טור מתמשך של פתרון פלסמיד הנעדר של בועות אוויר.
- מכניסים את המחט טעון בעל מחט מחוברת micromanipulator (Narishige MM3) ו III Picospritzer microinjector. הצג את המחט מתחת dissectiעל מיקרוסקופ לקצץ את המחט בנקודה שבה נוזל ירוק עוצר. זה עוזר להשתמש רקע כהה כדי להמחיש טוב יותר את המחט. מחט זמירה נכונה מגיע עם התרגול.
4. המוח התיכון / הזרקת בצינור העצבי (וידאו)
- השתמש במספריים האביב לקצץ 2-2.5 ס"מ קוטר החלון ביצה. הפעל את חלון מחור המחט הקודם עשה כאשר ציור אלבומין, ולסובב את הביצה ביד תוך כדי לחתוך. הקפידו לנקות את המספריים עם Kimwipe רווי באתנול 70% בין הביצים.
- הצג את העוברים חומוס תחת מיקרוסקופ לנתיחה. ייתכן שיהיה צורך להכשיר את העיניים. זה עשוי לעזור כדי להמחיש את העובר על ידי הזרקת 0.22 מיקרומטר, מסוננים 20% דיו הודו PBS תחת העובר חומוס. עם זאת, מצאנו כי שלב זה יש להימנע במידת האפשר, כפי שהוא נוטה להפחית את הישרדות.
- הזרקת עובד הכי טוב אם העובר ממוקמת במקביל לנתיב של מחט, עם הראש מחוץ המחט.לאט לאט פירס בצינור העצבי בזווית של 45 מעלות עד צומת המוח התיכון, למוח האחורי. זה קריטי מאוד רק למלא את שלפוחית עצבית המייצג את המוח התיכון עם ה-DNA פלסמיד וצבע ירוק מהיר, ללא דיפוזיה משמעותית לתוך אזורי המוח הקדמי ו למוח האחורי. התחל עם מערכת הזרקת משך microinjector של Picospritzer של 25 מילישניות, זה ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם מחט זמירה. באופן כללי, השתמש בין 10-50 MS.
5. Electroporation (וידאו)
- אחזור מחט ההזרקה. מקום 3 טיפות של פן דלקת 1X / בתמיסה PBS בביצה על העובר.
- בדוק את ההגדרות של electroporator BTX EMC830:
מתח: 20 V PULSE זמן: 25 ms מס 'קטניות: 3 מרווח: 500 ms קוטביות: - הנח את האלקטרודות 2 מ"מ פלטינה ארוכים בצורת ברמה אופקית כמו החלק התחתון של הצינור העצבי, עם המוח התיכון עובריים יושב באמצע בין 3 מ"מ 2 מזה אלקטרודות. יישור האלקטרודות עם החלק התחתון של הצינור העצבי הוא קריטי electroporation יעיל של המוח התיכון הגחון. כדי להשיג המוח התיכון ספציפי electroporation, החלפנו את האלקטרודות BTX מקוריים עם שני מחוייט L בצורת אלקטרודות פלטינה עם 2 טיפים קצרים ארוכים מ"מ. אלקטרודות אלו פלטינה עשויים 0.5mm פלטינה חוטים בקוטר (אלפא Aesar). אלו אלקטרודות פלטינה הם רק מספיק זמן כדי לכסות את המוח התיכון של העובר 11 חומוס הבמה, שזה בערך 0.9 מ"מ אורך, ללא מיקוד חלק ניכר המוח הקדמי או האזורים למוח האחורי. לחץ footswitch BTX פעם אחת. בועות האוויר צריך להיות שנוצר סביב האלקטרודות עם כל electroporation מוצלח. מוציאים בזהירות את האלקטרודות מן הביצה ולנגב ציודאת האודות עם Kimwipe 70% אתנול מכוסה. מניחים עוד 3 טיפות פן 1X / פתרון דלקת בביצה, על העובר.
- מכסים את החלון עם 5 ס"מ X 5 ס"מ חלקים של סרט אריזה ברור. יש להקפיד לאטום את הביצה היטב כי תוכן הביצים לא לבוא במגע עם הקלטת.
6. לדגור קציר
- מניחים את הביצים אל תוך החממה. ודא הפיכת חממה פלטפורמות כבוי. דגירה הביצים עד לשלב הרצוי HH 23 מושגת.
- החיים עוברים קציר ומניחים אותם PBS-מלא מאכלים נפוצים פטרי עבור כל תנאי. מסך שנקטפו עוברים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה, שמירה על עוברים רק עם הביטוי mCherry.
- העברת עוברים לתוך בארות האישיים של מנה של 24 באר. ממלאים כל טוב עם 1 מ"ל של 2% paraformaldehyde טריים (PFA) ולאפשר לתקן 2-3 שעות ב 4 ° C.
- לשטוף עוברים קבועים שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב PBS. עוברים מקום ברצף אניn 15% סוכרוז ו 30% עד equilibrated. עוברים יהיה בתחילה לצוף סוכרוז, אבל ישקעו על איזון.
- יש לבדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה, רישום הערות על דפוס ביטוי mCherry ורמת עבור כל העובר. שבץ כל העובר על אוקטובר זה קריטי מאוד עוברים להתמצא כראוי ליצירת אופטימליים לחצות המוח התיכון חלקים עבור ניתוחים שלאחר מכן (איור 1).
- הכן 18 חלקים עבים באמצעות מיקרומטר המוח התיכון cryostat CM3050S לייקה. לנתח את התפתחות המוח התיכון והבחנה נוירון דופאמין על ידי immunostaining עם סמנים הסוג המתאים סלולריים.
7. נציג תוצאות
ייצוג שבתרשים של electroporating וניתוח המוח התיכון חומוס עובריים מוצג באיור 1. עוברי חומוס הזריק בהצלחה electroporated, ביטוי mCherry צריך להיות גלוי באזור המוח התיכון לאחר פיתוח נוסף (
הביטוי mCherry עולה כי אין מספיק גנים מחוץ לרחם הם כנראה לא הביע ביעילות. עוברים תחת מצב זה לא אמור לשמש למחקרים נוספים. באופן דומה, עוברים את זהלא שרדו עד סוף הליך ניסיוני לא ניתן להשתמש בהם איסוף נתונים וניתוח.
באיור 1. איור של המוח התיכון חומוס העוברית ב assay electroporation לג'ימי. HH בשלב 11 עוברים חומוס עובריים מוזרקים עם pCAG-mCherry יחד עם גנים של עניין מעורבב עם ירוק מהר כדי להמחיש את תהליך ההזרקה (א '). אחרי מלא בונה DNA, המוח האמצעי הם electroporated עם electroporator גל מרובע. עוברים מודגרת נוספת עד הרצויה בשלב HH 23 הוא הגיע. אז mCherry חיובי עוברים נקצרים קבועה, ומוטבעים (ב '). Cryosections המוח התיכון מוכנים עם חיתוך מטוסים שמציינים קו לבן 1B איור, ונותחו על ידי immunostaining עם סמנים המוח התיכון כגון hydroxylase טירוזין (TH) (ג). לחץ כאןכדי להציג דמות גדולה.
איור 2. הכנת cryosections של המוח התיכון חומוס העוברית. לאחר דגירה 41 שעות, HH 23 הבמה חומוס עוברים המבטאים mCherry וגנים של עניין נקצרים (A, B ו-C), קבוע עם PFA, מטופלים עם סוכרוז, ו מוטבע אוקטובר עבור cryosectioning. עוברים חומוס מכוונים בקפידה כדי להבטיח את הכנת חלקים המוח התיכון. מורפולוגיה העובר טיפוסי המטוס חיתוך לקבלת חלקים המוח התיכון מוצגים (ד '). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 3. ניתוח של חלקים במוח התיכון electroporated. Cryosections מעוברים עם רמות גבוהות של ביטוי mCherry () ערוכים מוכתם antibodIES כי מכירות הדגל מתויג הגן של עניין (ב ') דופאמין במוח התיכון נוירון סמן TH (C). המוח האמצעי עובריים electroporated עם pCAG-mCherry ו-pCAG דגל וקטור ריק לשמש מלאה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון חומוס עובריים מציע עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או בנוקאאוט לבצע מחקר vivo של פונקציות גנים בהתפתחות המוח התיכון דופאמין נוירון. שימוש מ"מ קצר 2 אלקטרודות פלטינה ארוכים בצורת יחד עם הזרקת המוח התיכון ספציפי עובריים DNA היא המפתח להשגת ביטוי יעיל של הגן של עניין אבות המוח התיכון דופאמין נוירונים. בנוסף, באמצעות הנכונות HH 11 בשלב עוברי חומוס הוא קריטי. הסיבה לכך היא 1, בשלב ה"ה 11, את התפתחות המוח התיכון בחורה מתקדמת כגון מספיק המוח הקדמי, המוח התיכון, ואת למוח האחורי הם להבדיל מורפולוגית. זה מאפשר מיקום מדויק של המחט הזרקת אלקטרודות על אזור המוח התיכון, הזרקת ה-DNA ובכך יעיל ו transfection. שנית, ב-HH שלב 11, neuropore הקדמי של עובר אפרוח עדיין לא לגמרי סגורD, המאפשר פלסמיד דנ"א מוזרק בקלות להיכנס במיוחד לאזור המוח התיכון. בצמתים צרים בין המוח הקדמי המוח התיכון העובר, ו למוח האחורי גם לעזור למנוע דיפוזיה מהירה של ה-DNA בונה מוזרק אל המוח התיכון בפרט. לבסוף, עוברים בשלבים מאוחרים יותר נוטים להתכרבל ראשם לצד הציר העצבי, ולכן קשה מאוד לכוון את האלקטרודה באופן ספציפי על המוח התיכון. זמן הדגירה צורך לקבל HH לשלב 11 העוברים עשויים להשתנות מעט בתגובה סטיות של טמפרטורת הדגירה, כמו גם הבדלים טבעיים בין הביצים. תחת תנאי הניסוי שלנו, זה לוקח בערך 41 שעות הדגירה על 100 ° F.
כדי להשיג עובריים המוח התיכון חומוס סעיפים לניתוח, הטבעה חיתוך המוח האמצעי על הכיוון הנכון הוא קריטי מאוד. ארבעים ואחת שעות לאחר electroporation, חומוס עוברים לעתים קרובות להציג מורפולוגיה דומה איור 2 ד. הכנת cryosections עםחיתוך במקביל המטוס את אלו המוצגים באיור 2 ד מגדיל את הסיכוי לקבל חלקים המוח התיכון הנכונות עבור immunostaining כימות נוספים.
העובדה המוח התיכון ספציפי ביטוי גנים חוץ רחמי ניתן להשיג על ידי electroporation פותח את האפשרות, כי גישה זו ניתן להחיל על אזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. המיקום של הזריקה, כמו גם המיקום של האלקטרודות, יכול להשפיע באופן משמעותי על אזורים במוח אשר transfected ביעילות עם מבנים דנ"א 7,15. טכניקה זו יכולה גם להביא תועלת בהפחתת ביטוי גנים ספציפיים של המוח התיכון מציאה RNAi בתיווך 16. כמו כן, טכניקות שונה במקצת עשויה להיות מיושם ללמוד ויסות הגנים בהבעת משפרי הקשורים לזהות גנים הכתב, מפה, ולאפיין אזורים רגולטוריים חדשים גנים חומוס. כאשר מוחל על עוברי עכברים, טכניקה זו יהיה הרבה יותר מהרוקל יותר לשימוש מאשר גישות מהונדס קלאסיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין אינטרסים מנוגדים פוטנציאליים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר Takahiko מאטסודה למתן pCAG-mCherry לבנות. YCM נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה מטעם קרן Schweppe ומענק מקרן וייטהול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
