Summary
Midbrain डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के विकास के दौरान समारोह और जीनों के विनियमन का आकलन करने के लिए, हम एक तरीका है कि शामिल है का वर्णन
Protocol
1. तैयार की आपूर्ति (वीडियो में नहीं)
- पेनिसिलीन 1X पीबीएस में / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन Strep /) के एक ताजा 1X कमजोर पड़ने को तैयार. नहीं, 50 से अधिक एमएल आवश्यक है. 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर.
- वांछित प्लाज्मिड constructs के संयोजन से तैयार इंजेक्शन constructs. हम वेक्टर pCAG झंडा में ~ 10 μL की अंतिम मात्रा के लिए उचित stoichiometry साथ सभी constructs. इसके अलावा, 14 pCAG - है GFP या pCAG - mCherry electroporation दक्षता और electroporated के कोशिकाओं पर नज़र रखने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. हम इस प्रयोग के लिए pCAG mCherry का उपयोग करें. अन्त में, प्लास्मिड डीएनए के मिश्रण में 0.05% की एक अंतिम एकाग्रता में 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर फास्ट ग्रीन डाई भ्रूण लड़की midbrains में इंजेक्शन दक्षता कल्पना जोड़ने.
2. अंडा तैयार (वीडियो में)
- आदेश में एचएच चरण 11 भ्रूण प्राप्त करने के लिए, अंडे को 100 पर incubated की जरूरत ° एफ (37.8 डिग्री सेल्सियस) में 25-40% की नमी के साथ निषेचन के बाद के बारे में 41 घंटे के लिए. जगहउनके पक्ष में अंडे और एक पेंसिल पानी का छींटा के साथ प्रत्येक के शीर्ष निशान. पूर्व गर्म, humidified इनक्यूबेटर में ट्रे रखें. धीरे धीरे लिए इनक्यूबेटर प्लेटफार्मों के मोड़ समारोह की स्थापना द्वारा अंडे रॉक "स्वचालित." नमी और पानी का स्तर हर 24 घंटे की जाँच करें.
- सही प्रयोग शुरू करने से पहले, इनक्यूबेटर से अंडे को हटाने और कमरे के तापमान पर छोड़ दें. यह करने के लिए नीचे धीमा विकास और विकास को रोकने में मदद मिलेगी.
- 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक अंडे की सतह को साफ करें और नीचे पोंछे Kimwipe साथ.
- दो 4 स्कॉच टेप का सेमी टुकड़े ले लो और उन्हें पेंसिल पानी का छींटा पर एक बड़ा आयत बनाने के लिए अंडे पर पक्ष द्वारा साइड छड़ी. अंडे के खिलाफ टेप चिकना. यह वह जगह है जहां खिड़की बनाया जाएगा. टेप जब खिड़की खुली काट रहा है से गिरने से eggshell के छोटे टुकड़े को रोकने जाएगा.
- एक 10 मिलीलीटर सिरिंज और 18 आधा गेज करने के लिए अंडा albumin बाहर के 5 एमएल आकर्षित सुई का प्रयोग करें. खोल छेदने के बाद, सुई की जर्दी से दूर के रूप में परेशान नहीं करने के लिए कोणया भ्रूण को नुकसान पहुंचा जबकि albumin हटाने. अंडे के बीच 70% इथेनॉल के साथ सुई साफ है, लेकिन यकीन है कि सुई अगले अंडा भेदी से पहले सूखा है.
3. ग्लास इंजेक्शन सुई तैयार (वीडियो में)
- इंजेक्शन सुई पर निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया जाता है / ज्वलंत ब्राउन micropipette (Sutter साधन मॉडल P-97) के डांड़ी: हीट 670, खींचो 120, वेळ 40, 165 समय. विश्व प्रेसिजन (एपीआई) 4 1.0 मिमी इंच पतली दीवार केशिका गिलास (एपीआई TW100F 4) उपकरण के लिए सुई बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक खींच गिलास सुई का उपयोग कर P10 विंदुक और लंबी टिप केशिका लोड हो रहा है विंदुक टिप (5242956.003 Eppendorf) लोड. 5-10 μL कितने अंडे के लिए इंजेक्शन जा रहे हैं पर निर्भर करता है, लोड. गिलास सुई धीरे धीरे, प्लाज्मिड हवा के बुलबुले के अनुपस्थित समाधान की एक सतत स्तंभ बनाने भरें.
- Micromanipulator (Narishige mm3) और Picospritzer तृतीय microinjector से जुड़ी सुई धारक में भरी हुई सुई रखें. एक dissecti के तहत सुई देखेंखुर्दबीन पर और इस मुद्दे पर जहां हरी तरल पदार्थ को बंद हो जाता है पर सुई ट्रिम. यह एक अंधेरे पृष्ठभूमि का उपयोग बेहतर सुई कल्पना करने में मदद करता है. उचित trimming के सुई अभ्यास के साथ आता है.
4. Midbrain / न्यूरल ट्यूब इंजेक्शन (वीडियो में)
- वसंत कैंची का उपयोग करने के लिए अंडे में 2-2.5 सेमी व्यास खिड़की में कटौती करने के लिए. पिछले सुई के छेद से खिड़की बनाया जब albumin ड्राइंग शुरू करो, और अपने हाथ में अंडे बारी बारी के रूप में आप में कटौती. एक अंडे के बीच 70% इथेनॉल में संतृप्त Kimwipe साथ कैंची साफ सुनिश्चित है.
- लड़की भ्रूण एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे देखें. यह आंखों को प्रशिक्षित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह पीबीएस में चूजा भ्रूण के तहत 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर 20% भारत स्याही इंजेक्शन लगाने के द्वारा भ्रूण कल्पना की मदद कर सकते हैं. हालांकि, हमने पाया है कि यदि संभव हो तो इस कदम से परहेज किया जाना चाहिए, क्योंकि यह अस्तित्व में कमी जाता है.
- इंजेक्शन सबसे अच्छा काम करता है अगर भ्रूण सुई से दूर सिर के साथ, सुई के पथ पर समानांतर में तैनात है.धीरे धीरे जंक्शन मध्यमस्तिष्क - hindbrain के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर न्यूरल ट्यूब पियर्स. यह बहुत महत्वपूर्ण है केवल अग्रमस्तिष्क और hindbrain क्षेत्रों में महत्वपूर्ण प्रसार के बिना तंत्रिका प्लास्मिड डीएनए और तेजी से हरे रंग के साथ मध्यमस्तिष्क का प्रतिनिधित्व पुटिका भर है. एमएस में 25 Picospritzer microinjector अवधि सेट के साथ इंजेक्शन, इस सुई trimming के के आधार पर परिवर्तित किया जा आवश्यकता हो सकती है. सामान्य में, 10-50 एमएस के बीच का उपयोग करें.
5. Electroporation (वीडियो में)
- इंजेक्शन सुई निकालते हैं. जगह 1X / भ्रूण पर अंडे में पीबीएस समाधान में पेन Strep के 3 बूँदें.
- BTX EMC830 electroporator की सेटिंग्स की जाँच करें:
वोल्टेज: 20 वी नाड़ी लंबाई: 25 एमएस # दालें: 3 अंतराल: 500 एमएस Polarity: - न्यूरल ट्यूब के नीचे के रूप में एक ही क्षैतिज स्तर पर 2 मिमी एल के आकार लंबी प्लैटिनम इलेक्ट्रोड भ्रूण दो 3 मिमी के अलावा इलेक्ट्रोड के बीच बीच में बैठे मध्यमस्तिष्क के साथ रखें. न्यूरल ट्यूब के नीचे के साथ संरेखित इलेक्ट्रोड पेत का मध्यमस्तिष्क के कुशल electroporation के लिए महत्वपूर्ण है. Midbrain - विशिष्ट electroporation प्राप्त करने के लिए, हम कम 2 मिमी लंबे समय सुझावों के साथ दो कस्टम एल आकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के साथ मूल BTX इलेक्ट्रोड की जगह. इन प्लैटिनम इलेक्ट्रोड 0.5mm व्यास प्लैटिनम (अल्फा Aesar) तारों से बना रहे हैं है. ये प्लैटिनम इलेक्ट्रोड अभी लंबे समय के लिए एक मंच 11 लड़की भ्रूण है, जो के बारे में लंबे समय तक 0.9 मिमी ज्यादा और अग्रमस्तिष्क hindbrain या क्षेत्रों का लक्ष्यीकरण बिना, की मध्यमस्तिष्क को कवर करने के लिए पर्याप्त हैं. BTX footswitch एक बार दबाएँ. हवाई बुलबुले के एक सफल electroporation साथ इलेक्ट्रोड के आसपास उत्पन्न किया जाना चाहिए. ध्यान से अंडे से इलेक्ट्रोड हटाने और electr पोंछएक 70% इथेनॉल कवर Kimwipe के साथ बंद odes. 1X पेन / अंडा में Strep समाधान भ्रूण पर एक और 3 बूँदें रखें.
- एक 5 एक्स 5 सेमी टुकड़ा स्पष्ट पैकेजिंग टेप के सेमी के साथ खिड़की को कवर किया. अंडे अच्छी तरह से और कहा कि अंडा सामग्री सील टेप के साथ संपर्क में नहीं आते हैं सुनिश्चित करें.
6. सेते हैं और फसल
- इनक्यूबेटर में अंडे वापस प्लेस. सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर प्लेटफार्मों मोड़ बंद है. अंडों को सेते हैं जब तक वांछित एचएच 23 चरण हासिल की है.
- फसल में रहने वाले भ्रूण और प्रत्येक शर्त के लिए आम पीबीएस भर पेट्री डिश में उन्हें जगह है. एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे स्क्रीन भ्रूण काटा, mCherry अभिव्यक्ति के साथ ही भ्रूण रखने.
- 24 अच्छी तरह से एक डिश के अलग - अलग कुओं में भ्रूण स्थानांतरण. ताजा बना 2% paraformaldehyde के के (पीएफए) के 1 एमएल के साथ एक अच्छी तरह से भरें और 4 में 2-3 घंटे तय की अनुमति डिग्री सेल्सियस
- निश्चित भ्रूण पीबीएस में 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धो लें. जगह भ्रूण मैं क्रमिक रूप सेn 15% और 30% sucrose के equilibrated तक. भ्रूण सूक्रोज में शुरू नाव होगा, लेकिन संतुलन पर डूब जाएगी.
- एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे भ्रूण की जाँच करें, mCherry अभिव्यक्ति पैटर्न और स्तर पर एक भ्रूण के लिए नोट लेने. अक्टूबर में प्रत्येक भ्रूण एम्बेड. यह बहुत उन्मुख भ्रूण को ठीक से बाद में विश्लेषण (चित्रा 1) लिए इष्टतम मध्यमस्तिष्क के पार वर्गों को उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- 18 माइक्रोन मोटी मध्यमस्तिष्क के वर्गों का उपयोग कर एक Leica CM3050S cryostat तैयार. उचित सेल प्रकार मार्कर के साथ Immunostaining के द्वारा मध्यमस्तिष्क विकास और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन भेदभाव का विश्लेषण.
7. प्रतिनिधि परिणाम
Electroporating और विश्लेषण भ्रूण लड़की मध्यमस्तिष्क के एक ढांचे के रूप में प्रतिनिधित्व चित्र 1 में दिखाया गया है. सफलतापूर्वक इंजेक्शन और electroporated है लड़की भ्रूण में, mCherry अभिव्यक्ति मध्यमस्तिष्क क्षेत्र में दिखाई आगे के विकास के बाद होना चाहिए (
अपर्याप्त mCherry अभिव्यक्ति पता चलता है कि अस्थानिक जीन की संभावना व्यक्त कर रहे हैं कुशलतापूर्वक नहीं. इस शर्त के तहत भ्रूण आगे के अध्ययन के लिए नहीं किया जाना चाहिए. इसी प्रकार भ्रूण, किप्रयोगात्मक प्रक्रिया के अंत में बच नहीं डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता है.
चित्रा 1 ओवो electroporation परख में भ्रूण लड़की मध्यमस्तिष्क के का चित्रण. एच.एच. चरण 11 भ्रूण लड़की भ्रूण pCAG - mCherry इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं एक साथ ब्याज की जीन तेजी से हरे रंग के साथ मिश्रित इंजेक्शन प्रक्रिया कल्पना (ए) के साथ. के बाद डीएनए constructs के साथ भरा, midbrains वर्ग लहर electroporator के के साथ electroporated हैं. भ्रूण आगे incubated हैं जब तक वांछित एचएच 23 मंच तक पहुँच जाता है. तो mCherry पॉजिटिव भ्रूण काटा तय कर रहे हैं, और एम्बेडेड (बी). Midbrain cryosections चित्रा 1 बी में सफेद लाइन ने संकेत दिया विमानों को काटने के साथ तैयार कर रहे हैं, और midbrain मार्कर के साथ Tyrosine hydroxylase (HI) (सी) के रूप में Immunostaining द्वारा विश्लेषण किया. यहाँ क्लिक करेंबड़ा आंकड़ा देखने के लिए.
चित्रा 2 भ्रूण लड़की मध्यमस्तिष्क से cryosections की तैयारी. 41 घंटे ऊष्मायन के बाद, एच.एच. चरण 23 लड़की mCherry और ब्याज की जीन व्यक्त भ्रूण (ए, बी और सी) काटा जाता है, पीएफए के साथ तय, sucrose के साथ इलाज किया, और cryosectioning के लिए अक्टूबर में एम्बेडेड. चिकी भ्रूण ध्यान मध्यमस्तिष्क वर्गों की तैयारी सुनिश्चित करने के लिए उन्मुख होते हैं. एक ठेठ भ्रूण है और midbrain वर्गों को प्राप्त करने के लिए काटने के विमान आकारिकी (डी) दिखाए जाते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 3 electroporated मध्यमस्तिष्क वर्गों का विश्लेषण. MCherry अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के साथ भ्रूण से cryosections (ए) तैयार कर रहे हैं और antibod साथ दागएँ कि मूल्यांकन करें चिह्नित हित के टैग जीन (बी) और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन मार्कर TH (सी) मध्यमस्तिष्क के पहचान. भ्रूण pCAG - mCherry और pCAG झंडा खाली वेक्टर नियंत्रण के रूप में सेवा के साथ electroporated midbrains. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Discussion
भ्रूण लड़की मध्यमस्तिष्क के ओवो electroporation में एक कम लागत और ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों midbrain डोपामिनर्जिक न्यूरॉन के विकास में जीन कार्य के vivo अध्ययन में प्रदर्शन की पीढ़ी के लिए तेजी से विकल्प प्रदान करता है. कम मिमी 2 भ्रूण डीएनए मध्यमस्तिष्क विशेष इंजेक्शन के साथ लंबे समय एल के आकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का प्रयोग एक साथ कुशल midbrain डोपामिनर्जिक न्यूरॉन progenitors में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, सही एच एच चरण 11 लड़की भ्रूण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह है क्योंकि पहले, एच.एच. चरण में 11, लड़की मध्यमस्तिष्क के विकास के लिए पर्याप्त है कि में अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क और hindbrain morphologically साफ़ कर रहे हैं उन्नत है. यह सुई इंजेक्शन और मध्यमस्तिष्क क्षेत्र में इलेक्ट्रोड, और इस प्रकार कुशल डीएनए इंजेक्शन और अभिकर्मक की सही स्थिति के लिए अनुमति देता है. दूसरा, एच.एच. चरण में 11, चूजे के भ्रूण की पूर्वकाल neuropore के अभी तक पूरी तरह से बंद करें नहीं हैघ, इंजेक्शन प्लास्मिड डीएनए आसानी से मध्यमस्तिष्क क्षेत्र में विशेष रूप से में प्रवेश की इजाजत दी. भ्रूण लिए की अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क और hindbrain के बीच संकीर्ण जंक्शनों भी डीएनए का तेजी से प्रसार का निर्माण मध्यमस्तिष्क में विशेष रूप से इंजेक्शन को रोकने में मदद करते हैं. अन्त में, बाद के चरणों में भ्रूण तंत्रिका अक्ष की ओर अपने सिर को कर्ल, यह बहुत मुश्किल इलेक्ट्रोड को लक्षित करने के लिए मध्यमस्तिष्क पर विशेष रूप से बनाने के लिए करते हैं. ऊष्मायन समय आवश्यक प्राप्त करने के लिए एच एच 11 भ्रूण मंच ऊष्मायन तापमान में विचलन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंडे के बीच प्राकृतिक अंतर करने के लिए प्रतिक्रिया में थोड़ा भिन्न हो सकते हैं. हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, यह 100 पर के बारे में 41 घंटे ऊष्मायन लेता ° एफ
विश्लेषण के लिए भ्रूण लड़की मध्यमस्तिष्क के वर्गों को प्राप्त करने, एम्बेड और सही अभिविन्यास midbrains काटने के बहुत महत्वपूर्ण है. चालीस घंटे electroporation के बाद लड़की भ्रूण अक्सर एक 2D चित्रा समान आकारिकी प्रदर्शित. एक साथ cryosections की तैयारीचित्र 2 डी में दिखाए गए लोगों के लिए विमान समानांतर काटने आगे Immunostaining और मात्रा का ठहराव के लिए यह सही मध्यमस्तिष्क वर्गों के होने का मौका अधिकतम.
तथ्य यह है कि midbrain विशिष्ट अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति electroporation द्वारा प्राप्त किया जा सकता है संभावना है कि इस दृष्टिकोण के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है खोलता है. इंजेक्शन का स्थान है, साथ ही इलेक्ट्रोड की स्थिति, महत्वपूर्ण मस्तिष्क क्षेत्रों है कि कुशलतापूर्वक डीएनए 7,15 constructs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट को प्रभावित कर सकता है. यह तकनीक भी मध्यमस्तिष्क में आरएनएआई की मध्यस्थता 16 पछाड़ना द्वारा विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति को कम करने में उपयोगी साबित हो सकता है. इसी तरह, थोड़ा संशोधित तकनीक रिपोर्टर जीन की पहचान करने के लिए जुड़ा हुआ, नक्शे, और लड़की में जीन से नई विनियामक क्षेत्रों विशेषताएँ enhancers व्यक्त की जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है. जब माउस भ्रूण के लिए लागू है, इस तकनीक बहुत जल्दी होगाऔर आसान क्लासिक ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण से अधिक का उपयोग करने के लिए.
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Disclosures
लेखक कोई संभावित परस्पर विरोधी हितों का खुलासा करने के लिए है.
Acknowledgments
हम प्रदान करने pCAG - mCherry निर्माण के लिए में डा. Takahiko Matsuda धन्यवाद. YCM Schweppe फाउंडेशन से कैरियर विकास पुरस्कार और व्हाइटहॉल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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