Summary
機能や中脳ドーパミン作動性ニューロンの開発中の遺伝子の調節を評価するために、我々は、関与の方法について説明します。
Abstract
腹側中脳のコントロールの動きにありますドーパミン作動性ニューロン、感情的な動作、および報酬のメカニズム1-3。腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンの機能不全は、パーキンソン病、統合失調症、うつ病、認知症1-5に関与している。したがって、中脳ドーパミン作動性ニューロンの分化の調節を研究することだけ脳の開発と神経前駆細胞の運命仕様を制御するメカニズムに重要な洞察を提供することができませんでしたが、また人間の神経疾患の様々を治療するための新たな治療戦略の開発に役立つ。
ドーパミン作動性ニューロンは、胚腹側中脳の脳室帯の内側を覆う神経前駆細胞から分化する。神経前駆細胞の開発は、6,7の遺伝子発現プログラムによって制御されます。ここでは、（目のハンバーガーハミルトン（HH）ステージ11の脳に特異的に遺伝子を発現するエレクトロポレーションを利用する技術を報告するirteen体節、42時間）ニワトリ胚8,9。ニワトリ胚の外部の開発は、後の発達時点10月13日で決定の影響で、特定胚の段階で便利な実験操作が可能になります。以前のHHステージ13（19体節、48時間）以上のニワトリ胚神経管、神経系の異なる細胞型に分化することができる多能性神経前駆細胞で構成されています。 CMVプロモーターおよびニワトリβ-アクチンエンハンサーの両方が含まれていますpCAGベクトルは、旗やニワトリ胚神経管14内の他のエピトープタグ付き構造体の強い発現が可能になります。本稿では、DNAは胚の中脳領域に特異的に構築し、どのように小さなカスタムメイドの電極をエレクトロポレーションを特定するために注入する方法など、胚の中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞に地域制限の遺伝子発現を達成するための特別措置を強調しています。 Cの分析後の段階で田舎者の脳は、脳開発のプラスミドベクターによるゲインの関数と機能喪失研究のための生体システムに優れた提供しています。実験システムの変更が運命マッピング解析を実行するために、遺伝子発現の調節を調べるための神経系の他の部分に分析を拡張することができます。
Protocol
1。電源の準備（ないビデオ）
- 1X PBSでペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）の新鮮な1X希釈を準備します。以上50 mLのが必要です。 0.22μmのシリンジフィルターでろ過する。
- 所望のプラスミドコンストラクトを組み合わせることにより、注入構造を準備します。我々は〜10μLの最後のボリュームに適切な化学量論でpCAG-フラグベクトル内のすべての構成要素を入れた。また、pCAG-GFP 14またはpCAG-mCherryは、トラッキングエレクトロポレーションの効率化とエレクトロポレーションした細胞を追加する必要があります。我々はこの実験のためにpCAG-mCherryを使用しています。最後に、ニワトリ胚midbrainsに注入効率を視覚化するために0.05％の最終濃度でプラスミドDNAの混合物に0.22μmのろ過ファストグリーン染料を追加します。
2。卵の準備（ビデオで）
- 11胚を取得HHステージにするために、卵は25から40パーセントの湿度と受精後約41時間°F（37.8℃）100℃でインキュベートする必要があります。場所彼らの側に卵と鉛筆ダッシュそれぞれのトップをマークします。予め温めておいた、加湿インキュベーター中トレイを置きます。ゆっくりにインキュベータープラットフォームの回転機能を設定することによって、卵を揺する "自動"湿度と水のレベルを24時間ごとにチェックしてください。
- 右の実験を開始する前に、インキュベーターから卵を除去し、室温のまま。これは、開発を遅らせると開発上のを防ぐのに役立ちます。
- 70％エタノールでそれぞれの卵の表面をきれいにし、キムワイプで拭いてください。
- スコッチテープの2つの4センチの部分を取り、鉛筆のダッシュ上に大きな四角形を作るために卵の上に並べて貼り付けます。卵に対してテープを滑らかにします。ウィンドウが行われる場所です。テープは、ウィンドウが開いているカットされたときに落ちるから卵殻の小片を防ぐことができます。
- 10 mLの注射器と18½卵のアルブミンのうち5 mLを描画するためのゲージの針を使用しています。邪魔しないようにするようなシェルを貫通した後、卵黄から離れて針を角度アルブミン除去しながら、または胚を損傷するおそれがあります。卵の間に70％エタノールで針を清掃しますが、針が次の卵を貫通する前に乾燥していることを確認してください。
3。ガラスの注射針の準備（ビデオで）
- ヒート670、プル120、ヴェル、40時間165：注射針は、フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラー（サッターインストゥルメント·モデルP-97）に次の設定を使用して作られています。世界精密機器（API）4インチ1.0ミリメートルの薄壁ガラスキャピラリー（API TW100F-4）針を作るために使用されています。
- P10ピペットおよび長期の先端キャピラリーローディングピペットチップ（エッペンドルフ5242956.003）を使用して、プルダウンガラス針をロードします。注入する方法を多くの卵に応じて、5〜10μLをロードします。気泡のないプラスミド溶液を連続的にカラムを作成し、徐々にガラス針を記入してください。
- マイクロマニピュレーター（ナリシゲMM3）とPicospritzer IIIインジェクターに接続された針ホルダーにロードされた針を配置します。 dissectiの下に針を見る顕微鏡で、緑色の液体が停止した時点で針をトリミングします。それは良い針を可視化するために暗い背景を使用するのに役立ちます。トリミング適切な針は練習が付属しています。
4。中脳/神経管注入（ビデオで）
- 卵2〜2.5センチメートル径ウィンドウを削減する春のはさみを使用しています。アルブミンを描画するときに行われた前回の針穴からウィンドウを起動し、カットのように手で卵を回転させます。卵の間に70％エタノールで飽和したキムワイプではさみをきれいにしてください。
- 解剖顕微鏡下でのニワトリ胚を表示します。それは目を訓練する必要があるかもしれません。それはニワトリ胚の下にPBSで0.22μmのろ過20パーセント、インドのインクを注入して胚を可視化するために役立つことがあります。しかし、我々は、可能であれば、それが生存率を低下する傾向にあるようにこのステップは、避けるべきであることを発見した。
- 胚は針のパスに平行に配置されている場合は注射針の距離から頭で、最適に動作します。徐々に穴を開ける中脳後脳接合〜45度の角度で神経管。それだけで前脳と後脳の領域に重要な拡散せずに、プラスミドDNAとファストグリーン色素で脳を表す神経小胞を埋めるために非常に重要です。 25ミリ秒に設定されPicospritzerインジェクターの期間で注入を開始、これは針がトリミングに応じて変更する必要があります。一般的には、10から50 msの間使用しています。
5。エレクトロポレーション（ビデオで）
- 注射針を取得します。場所胚における卵のPBS溶液で1Xペン/連鎖球菌の3滴。
- BTX EMC830エレクトロの設定を確認します。
電圧： 20 V パルスの長さ： 25ミリ秒 ＃パルス： 3 INTERVAL： 500ミリ秒 極性： - 別に2 3ミリメートルの電極間の中央に座っている胚の中脳と神経管の底と同じ水平レベルで2ミリメートル長いL字型の白金電極を配置します。神経管の下部に電極を整列する腹側中脳の効率的なエレクトロポレーションのために重要です。脳特有のエレクトロポレーションを達成するために、我々は短い2ミリメートル長いのヒントを持つ2つのカスタムメイドのプラチナL字型の電極と、元のBTX電極を置き換えられます。これらの白金電極は0.5mm径の白金線（アルファAesar社）で作られています。これらの白金電極だけで十分な長さくらい前脳や後脳領域のをターゲットにせずに長さ約0.9ミリメートルであり、ステージ11ニワトリ胚の脳をカバーしようとしています。 BTXフットスイッチを一度押します。気泡が成功するたびにエレクトロポレーションの電極の周りに生成する必要があります。慎重に卵から電極を取り外してあるelectrを拭く70％エタノールで覆われたキムワイプでオフオード。胚で卵の1Xペン/連鎖球菌のソリューションは、他の3滴を配置します。
- 明確な包装テープのは5cm x 5cmの部分でウィンドウをカバーしています。よく、その卵を密封するために卵の内容がテープに接触しないようにしてください。
6。インキュベートと収穫
- インキュベーターに戻した卵を置きます。インキュベータープラットフォームの転換がOFFになっていることを確認してください。希望するHHステージ23が達成されるまで卵をインキュベートします。
- 収穫は胚を生きていると、各条件の一般的なPBSを充填したペトリ皿に入れます。画面には、mCherry式でのみ胚を維持し、蛍光解剖顕微鏡下で胚を回収した。
- 24ウェルディッシュの個々のウェルに胚を移します。たて2％パラホルムアルデヒド（PFA）を1 mLの各ウェルを記入し、4℃で2-3時間を修正することができ℃の
- 10分PBSで各固定胚3回洗浄します。場所胚順次I平衡化するまで、nは15％および30％ショ糖。胚は、当初はスクロースに浮かぶだろうが、平衡時にシンクします。
- 各胚についてmCherry発現パターンとレベルでメモを取り、蛍光解剖顕微鏡下で胚を確認してください。 OCTで各胚を埋め込むことができます。それは、その後の解析（ 図1）に最適な脳の断面を生成するために適切な方向の胚に非常に重要です。
- ライカCM3050Sのクライオスタットを用いて厚さ18μmの脳切片を作製します。適切な細胞型マーカーで免疫染色することによって脳の発達とドーパミン作動性ニューロンへの分化を分析します。
7。代表的な結果
ニワトリ胚中脳をelectroporatingと分析の概略を図1に示されています。が正常に注入し、エレクトロポレーションニワトリ胚では、mCherry式は、さらなる開発の後脳領域に表示する必要がある（
不十分なmCherry式は、異所性の遺伝子がおそらく効率的に発現されないことを示唆している。この条件の下で胚はさらなる研究のために使用すべきではありません。同様に、胚のその実験手順の最後に生存しなかったデータの収集と分析に使用することはできません。
図1。OVOエレクトロポレーションアッセイにおけるニワトリ胚中脳のイラスト。 HHステージ11ニワトリ胚の胚（）は、注入プロセスを可視化するために、高速グリーンと混合して目的の遺伝子と一緒にpCAG-mCherryを注入されています。 DNA構築物を充填した後、midbrainsは、方形波のエレクトロとエレクトロポレーションされています。希望するHHステージ23に到達するまでの胚はさらに培養されています。その後mCherry陽性胚は、収穫を固定し、組み込み（B）されています。中脳の凍結切片は、図1Bの中の白線で示された平面を切断して調製し、そのようなチロシンヒドロキシラーゼ（TH）（C）のような脳のマーカーで免疫染色によって分析されています。 ここをクリック拡大図を表示します。
図2ニワトリ胚中脳から凍結切片の調製。 41時間のインキュベーションの後、mCherryと関心のある遺伝子を発現するHHステージ23ニワトリ胚は、（A、BおよびC）が収穫されるPFAで固定し、ショ糖で処理し、セクショニングのOCTに包埋した。ニワトリ胚中脳切片の準備を確実にするために慎重に配向している。中脳切片を得るための典型的な胚の形態と切断面は、（D）が表示されます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3エレクトロ脳切片の分析。 mCherryの発現レベルの高い胚から凍結切片（A）は不格好なやつを準備し、染色される興味のあるFlag標識遺伝子（B）と中脳ドーパミン作動性ニューロンマーカーTH（C）を認識IES。胚midbrainsはpCAG-mCherryでエレクトロとpCAG -フラッグ空のベクトルは、コントロールとして機能します。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ニワトリ胚中脳の卵エレクトロポレーションで中脳ドーパミン作動性ニューロンの開発に遺伝子機能のin vivo試験で実行するトランスジェニックやノックアウト動物の世代に、低コストかつ迅速な代替手段を提供しています。胚の中脳特異的DNAインジェクションと一緒に短い2ミリメートル長いL字型の白金電極を使用すると、中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞に目的遺伝子の効率的な発現を達成するための鍵となります。さらに、正しいHHステージ11ニワトリ胚を使用することが重要です。最初に、HHステージ11で、ニワトリの脳の開発が十分に前脳、中脳、後脳とは形態的に区別するように進んでいるためです。これは、中脳領域での注射針と電極の正確な位置決め、したがって、効率的なDNAインジェクションとトランスフェクションが可能になります。第二に、HHステージ11で、ニワトリ胚の前神経孔は、まだ完全に閉じません。D、注入されたプラスミドDNAは容易に脳領域に特異的に入力することができます。胚の前脳、中脳と後脳の間の狭い接合部は、DNAの高速拡散を防ぐことが脳に特異的に注入されたコンストラクト。最後に、後の段階で胚は非常に困難な脳で特異的に電極をターゲットにしながら、神経軸の側面に頭をカールする傾向があります。 HHステージ11胚を得るために必要なインキュベーション時間は、培養温度の偏差に応じて若干異なるだけでなく、卵の間に自然な違いがあります。我々の実験条件下では、100℃で約41時間のインキュベーションを取る°Fを
分析用のニワトリ胚中脳切片を得るためには、正しい向きでmidbrainsを埋め込み、切断することは非常に重要です。エレクトロポレーション後の四十一時間、ニワトリ胚は、しばしば2次元の図のように形態が表示されます。で凍結切片を準備する図2Dに示すものに平行な平面をカットすると、さらに免疫染色および定量化のための正しい脳切片を得るためのチャンスを最大限に引き出します。
脳特異的な外来遺伝子の発現がエレクトロポレーションによって達成することができるという事実は、このアプローチは、中枢神経系の他の地域に適用することができるという可能性を開きます。注射の場所と同様に、電極の位置は、かなり効率的にDNA構築物7,15トランスフェクトされる脳領域に影響を与える可能性があります。また、この手法は、RNAiによるノックダウン16で脳内の特定の遺伝子発現を減らすのに役立つ可能性があります。同様に、わずかに変更された技術は、マップを識別し、ニワトリの遺伝子から新たな調節領域を特徴づけるためにレポーター遺伝子にリンクされているエンハンサーを発現させることにより、遺伝子発現制御を研究するために実装されるかもしれません。マウスの胚に適用される場合、このテクニックははるかに高速になります古典的なトランスジェニックアプローチよりも使用すると簡単です。
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Disclosures
著者らは、開示する潜在的な利害を持っていません。
Acknowledgments
我々はpCAG-mCherryが構築提供するために博士隆彦松田に感謝します。 YCMはSchweppe財団からのキャリア開発賞とホワイトホール財団からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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