I ovo elektroporering i Chick mitthjärnan för att studera genfunktion av dopaminerg Neuron utveckling

Summary

För att bedöma funktionen och regleringen av gener under utvecklingen av mitthjärnedopaminerga neuroner, beskriver vi en metod som innebär att

Abstract

Dopaminerga neuron belägna i ventrala mitthjärnan kontrollerar rörelser, emotionell beteende och mekanismer belöning ^1-3. Den dysfunktion av ventrala mitthjärnan dopaminerga nervceller är inblandad i Parkinsons sjukdom, schizofreni, depression och demens ^1-5. Således kunde studera regleringen av mitthjärnan dopaminerg neuron differentiering inte bara ge viktig insikt i mekanismer som reglerar mitthjärnan utveckling och neurala stamfader öde specifikation, men också hjälpa till att utveckla nya terapeutiska strategier för behandling av olika mänskliga neurologiska sjukdomar.

Dopaminerga neuroner skilja från neurala stamceller som kantar den ventrikulära zonen embryonala ventrala mitthjärnan. Utvecklingen av neurala stamceller styrs av program genuttryck ^6,7. Här rapporterar vi som utnyttjar elektroporation att uttrycka gener specifikt i mitthjärnan på Hamburger Hamilton (HH) steg 11 (thirteen somiter, 42 timmar) kycklingembryon ^8,9. Den extern utveckling av kycklingembryon möjliggör bekväma experimentella manipulationer vid specifika embryonala stadier, med de effekter som fastställs på senare utvecklingsstadier tidpunkter ^10-13. Chick embryonala neurala rör tidigare än HH stadium 13 (nitton somiter, 48 timmar) består av multipotenta neurala stamceller som kan differentiera till olika celltyper i nervsystemet. Den pCAG vektor, vilken innehåller både en CMV-promotor och en kyckling β-aktin-förstärkaren, medger stabil expression av flagga eller annan epitop-märkta konstruktionerna i embryonala kycklingembryon neurala rören ^14. I denna rapport betonar vi speciella åtgärder för att uppnå regionalt begränsad genuttryck i embryonala mitthjärnedopaminerga neuron föregångare, bland annat hur du ska injicera DNA-konstruktioner bestämt i den embryonala mitthjärnan regionen och hur man precisera elektroporation med små skräddarsydda elektroder. Analys chick mitthjärnan i senare skeden tillhandahåller en utmärkt in vivo-system för plasmidvektor-medierad förstärkning-av-funktion och förlust-av-funktionsstudier av mitthjärnan utveckling. Ändring av det experimentella systemet kan förlänga analysen till andra delar av nervsystemet för att utföra analyser öde kartläggning och för att undersöka regleringen av genuttryck.

Protocol

1. Supply Preparation (inte i video)

1. Framställa en färsk 1X utspädning av penicillin / streptomycin (pen / strep) i 1 x PBS. Inte mer än 50 ml erfordras. Filter med en 0,22 fim sprutfilter.
2. Förbered injektion konstruktioner genom att kombinera önskade plasmidkonstruktioner. Vi sätter alla konstruktioner i pCAG-Flag-vektorn med lämplig stökiometri för en slutlig volym av ~ 10 | il. Dessutom bör pCAG-GFP ¹⁴ eller pCAG-mCherry läggas till för att spåra elektroporation effektivitet och elektroporerade celler. Vi använder pCAG-mCherry för detta experiment. Slutligen tillsätts 0,22 fim-filtrerades Fast Green färgämne in i den plasmid-DNA-blandningen vid en slutlig koncentration av 0,05% för att visualisera injektion effektivitet i embryonala chick midbrains.

2. Ägg Preparation (i video)

1. För att förvärva HH steg 11 embryon, ägg måste inkuberas vid 100 ° F (37,8 ° C) under ca 41 timmar efter befruktning med 25-40% fuktighet. Placeraägg på sin sida och markera toppen av varje med en penna streck. Placera brickor i en förvärmd, fuktig inkubator. Långsamt rocka ägg genom att ställa in att vrida funktion inkubator plattformar för "Automatic". Kontrollera fukt och vatten nivån var 24 timmar.
2. Strax före start försöket, ta bort ägg från inkubatorn och låt stå i rumstemperatur. Detta kommer att hjälpa att bromsa utvecklingen och förhindra över utvecklingen.
3. Rengör varje ägg med 70% etanol och torka med en Kimwipe.
4. Ta två 4 cm bitar tejp och håll dem sida vid sida på ägget för att göra en stor rektangel över pennan instrumentbrädan. Jämna bandet mot ägget. Detta är där fönstret kommer att göras. Bandet kommer att förhindra små bitar av äggskal från att falla ut när fönstret är uppskuren.
5. Använda en 10 ml spruta och 18 gauge nål för att dra 5 ml av albumin ur ägget. Efter piercing skalet, vinkla nålen bort från gulan för att inte störaeller skada embryot när du tar bort albumin. Rengör nålen med 70% etanol mellan ägg, men vara säker på att nålen är torr innan piercing nästa ägg.

3. Glas injektionsnål Preparation (i video)

1. Kanyler görs med följande inställningar på en Flaming / Brun Mikropipett Avdragare (Sutter Instrument modell P-97): Värme 670, Pull 120, Vel 40, Time 165. World Precision Instruments (API) 4 tum 1,0 mm tunnväggiga kapillärrör av glas (API TW100F-4) används för att göra nålar.
2. Ladda en drog glasnål med hjälp av en P10 pipett och lång spets kapillär belastning pipettspets (Eppendorf 5242956,003). Ladda 5-10 | il, beroende på hur många ägg som skall injiceras. Fylla glaset nålen långsamt, vilket skapar en kontinuerlig kolonn av plasmiden lösning frånvarande från luftbubblor.
3. Placera den laddade nålen i nålhållaren fäst vid mikromanipulator (Narishige MM3), och Picospritzer III mikroinjektor. Visa nålen under en dissectiför mikroskop och trimma nålen vid den punkt där den gröna vätskan stannar. Den hjälper till att använda en mörk bakgrund för att bättre visualisera nålen. Rätt nål trimning kommer med praxis.

4. Mitthjärnan / Neural Tube injektion (i video)

1. Använd vår sax för att klippa en 2-2,5 fönster cm diameter i ägget. Starta fönstret från föregående nålen hålet gjorde vid utformningen albumin och rotera ägget i handen medan du klipper. Var noga med att rensa bort saxen med en Kimwipe mättad i 70% etanol mellan ägg.
2. Visa kycklingembryon under ett dissektion mikroskop. Det kan vara nödvändigt att träna ögonen. Det kan hjälpa att visualisera embryot genom injicering 0,22 fim-filtrerad 20% tusch i PBS under kycklingembryo. Vi har emellertid funnit att detta steg bör om möjligt undvikas, eftersom den tenderar att minska överlevnaden.
3. Injektion fungerar bäst om embryot placeras parallellt med väg nålen, med huvudet bort från nålen.Sakta hål i neuralröret i 45 graders vinkel mot mitthjärnan-bakhjäman korsning. Det är mycket viktigt att bara fylla den neurala vesikeln representerar mellanhjärnan med plasmid-DNA och Fast Green färg, utan nämnvärd spridning till framhjärnan och bakhjäman regioner. Starta injicera med Picospritzer mikroinjektor löptid inställd på 25 ms, vilket kan komma att behöva ändras beroende på st trimning. I allmänhet använder mellan 10-50 ms.

5. Elektroporation (i video)

1. Hämta injektionsnålen. Placera 3 droppar 1X Pen / Strep i PBS-lösning i ägg på embryot.
2. Kontrollera inställningarna för BTX EMC830 elektroporator:

   SPÄNNING:	20 V
   Pulslängd:	25 ms
   # Baljväxter:	3
   Intervall:	500 ms
   Polaritet:

3. Placera 2 mm långa L-formad platinaelektroder vid samma horisontella nivå som bottnen av neuralröret, med den embryonala mitthjärnan sitter i mitten mellan två 3 mm från varandra elektroder. Inriktning av elektroderna med botten av det neurala röret är kritisk för effektiv elektroporering av den ventrala mitthjärnan. För att uppnå mitthjärnan-specifik elektroporering ersatte vi ursprungliga BTX elektroderna med två skräddarsydda platina L-formade elektroder med kort 2 mm långa tips. Dessa platinaelektroder är gjorda av 0,5 mm trådar diameter platina (Alfa Aesar). Dessa platinaelektroder är bara tillräckligt länge för att täcka mitthjärnan av ett stadium 11 kycklingembryo, vilket är ca 0,9 mm långa, utan att rikta en stor del av framhjärnan eller regioner bakhjäman. Tryck på BTX fotkontakten gång. Luftbubblor måste skapas kring elektroderna med varje lyckad elektroporation. Ta försiktigt bort elektroderna från ägget och torka av elektrhyllningar av med en 70% etanol täckta Kimwipe. Placera ytterligare 3 droppar 1X Pen / Strep lösning i ägget, på embryot.
4. Täck fönstret med en 5 cm x 5 cm bit av klar förpackningar tejp. Var noga med att täta ägget väl och att äggets innehåll inte kommer i kontakt med bandet.

6. Inkubera och Harvest

1. Placera äggen tillbaka in i inkubatorn. Se till att svarvning av inkubatorn plattformar är OFF. Inkubera ägg tills önskad HH steget 23 uppnås.
2. Harvest levande embryon och placera dem i gemensamma PBS-fyllda petriskålar för varje tillstånd. Screen skördas embryon under ett fluorescerande dissektionsmikroskop, hålla endast embryon med mCherry uttryck.
3. Överföra embryon till individuella brunnar i en 24-brunnars skål. Fylla varje brunn med 1 ml av nygjord 2% paraformaldehyd (PFA) och tillåta att fixera 2-3 timmar vid 4 ° C.
4. Tvätta de fasta embryon tre gånger under 10 minuter vardera i PBS. Ställe embryon sekventiellt in 15% och 30% sackaros tills jämvikt. Embryon kommer initialt att flyta i sackaros, men kommer att sjunka på jämvikt.
5. Kontrollera embryon under ett fluorescerande dissektion mikroskop, anteckningar på mCherry uttrycket mönstret och för varje embryo. Bädda in varje embryo i oktober Det är mycket viktigt att orientera embryon korrekt att generera optimala avsnitt mitthjäman korset för efterföljande analys (figur 1).
6. Förbered 18 im tjocka mitthjäman sektioner med hjälp av en Leica CM3050S kryostat. Analysera mitthjärnan utveckling och dopaminerg neuron differentiering genom immunfärgning med lämpliga markörer celltyp.

7. Representativa resultat

En schematisk representation av elektroporera och analysera embryonala kycklingen mitthjärnan visas i figur 1. Framgångsrikt injicerade och elektroporerades kycklingembryon, bör mCherry uttryck vara synlig i mitthjärnan regionen efter ytterligare utveckling ( (Figur 2D). I allmänhet kan omkring 50% av ventrala mellanhjärnan neurala progenitorceller vara effektivt transfekterade med ovanstående protokoll. Specifikationen av dopaminerg öde i elektroporerade neurala stamceller kan prövas av samlokalisering av mCherry, Flag-märkt genen, med dopaminerga neuron markörer som tyrosinhydroxylas (TH) (Figur 3). Den mönstring av stamceller domäner i ventrala mitthjärnan kan undersökas genom samtidig immnostaining kryosnitt med olika markörer progenitorceller domän.

Otillräcklig mCherry uttryck antyder att ektopiska gener kan inte effektivt uttryck. Embryon enligt detta villkor bör inte användas för fortsatta studier. Likaså embryon somöverlevde inte till slutet av den experimentella proceduren kan inte användas för datainsamling och analys.

Figur 1. Illustration av den embryonala kycklingen mitthjärnan in ovo elektroporation analys. HH steget 11 embryonala kycklingembryon injicerades med pCAG-mCherry tillsammans med gener av intresse blandade med snabb grönt för att visualisera injektion förfarande (A). Efter fylld med DNA-konstruktioner, är midbrains elektroporerades med en fyrkantvåg elektroporator. Embryon inkuberas ytterligare tills önskat HH stadium 23 har uppnåtts. Då mCherry-positiva embryon skördas, fasta och Embedded (B). Midbrain kryosnitt är beredda med skärande plan som anges av den vita linjen i figur 1B, och analyserades genom immunfärgning med mitthjäman markörer som tyrosinhydroxylas (TH) (C). Klicka härför att se större bild.

Figur 2. Beredning av kryosnitt från embryonala chick mitthjärnan. Efter 41 timmar inkubering HH steg 23 kycklingembryon som uttrycker mCherry och gener av intresse skördas (A, B och C), fixerades med PFA, behandlades med sackaros, och bäddades in i OCT för kryosektionering. Kycklingembryon noggrant orienterade för att säkerställa utarbetandet av mitthjäman sektioner. En typisk embryo morfologi och det skärande planet för att få mitthjäman avsnitt visas (D). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Analys av elektroporerade mitthjäman sektioner. Kryosnitt från embryon med höga nivåer av uttryck mCherry (A) framställdes och färgades med antikroppar mottalet som känner igen Flag-märkta genen av intresse (B) och mitthjärnan dopaminerg neuron markör TH (C). Embryonala midbrains elektroporerade med pCAG-mCherry och pCAG-Flag tom vektor fungerar som kontroll. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

In ovo elektroporering av embryonala kycklingen mitthjärnan ger en låg kostnad och snabbt alternativ till alstring av transgena eller knockout djur för att utföra in vivo-studie av genfunktioner i mitthjärnan dopaminerg neuron utveckling. Med användning av kort 2 mm långa L-formad platinaelektroder med embryonala mitthjärnan-specifik DNA-injektion är nyckeln för att uppnå effektiv expression av genen av intresse i mitthjärnedopaminerga neuron progenitorer. Dessutom, med användning av korrekta HH steget 11 kycklingembryon är kritisk. Detta beror dels, i HH stadium 11, utveckling av kycklingen mitthjärnan tillräckligt avancerad för så att framhjärnan, mitthjärnan och bakhjäman är morfologiskt urskiljbara. Detta medger exakt positionering av injektionsnålen och elektroderna på den mitthjärnan regionen, och därmed effektivt DNA-injektion och transfektion. Andra, på HH steget 11 är den främre neuropore av kycklingembryo ännu inte fullständigt stängerd, tillåter den injicerade plasmid-DNA för att enkelt komma in i synnerhet in i mitthjärnan regionen. De smala korsningar mellan embryonal framhjärnan, mitthjärnan och bakhjäman hjälper också till att förhindra att snabbt spridning av DNA-konstruktioner injiceras särskilt i mellanhjärnan. Slutligen embryon i senare stadier har en tendens att krökas huvudet på den sida av det neurala axeln, vilket gör det mycket svårt att inrikta den elektrod som specifikt vid mitthjärnan. Inkubationstiden nödvändig för att uppnå HH iscensätta 11 embryon kan variera något svar på avvikelser i inkuberingstemperaturen, liksom naturliga skillnader mellan ägg. Under våra försöksbetingelser, tar det ca 41 h inkubation vid 100 ° C.

För att få embryonala sektioner chick mitthjäman för analys, inbäddning och skära midbrains på rätt orientering är mycket kritisk. Fyrtioen timmar efter elektroporering, kycklingembryon uppvisar ofta en morfologi liknande den i figur 2D. Förbereda kryosnitt medskära parallellt med de som visas i figur 2D maximerar chansen att få rätt mitthjäman sektioner för vidare immunfärgning och kvantifiering.

Det faktum att mitthjärnan-specifik ektopisk genuttryck kan åstadkommas genom elektroporation öppnar upp för möjligheten att detta tillvägagångssätt kan tillämpas på andra regioner i centrala nervsystemet. Placeringen av injektion, såväl som positionering av elektroder, kan signifikant påverka de hjärnregioner som effektivt transfekterade med DNA-konstruktioner ^7,15. Denna teknik kan också vara användbara för att minska specifika genuttryck i mellanhjärnan med RNAi-medierad knockdown ^16. På samma sätt kan något modifierade tekniker implementeras för att studera genreglering genom att uttrycka förstärkare kopplade till reportergener för att identifiera, kartlägga och karakterisera nya regulatoriska regioner från gener i ungen. När den appliceras på musembryon, skulle denna teknik vara mycket snabbareoch lättare att använda än klassiska transgena metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized chicken eggs	Charles River Laboratories
Egg incubator	GQF Manufacturing	1502 Sportsman
BTX Electroporator	BTX Harvard Apparatus	ECM830
Electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0162 L-shaped genetrodes	For use with ECM830 electroporator
Platinum iridium wire	Alfa Aesar	#10056	0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes
Glass capillary tube	World Precision Instrument	TW100F-4
Microloader pipette tip	Eppendorf	5242 956.003
India ink	Staples		Filter 20% before use
Microinjector	Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation	Picospritzer III
Fluorescent dissection microscope	Leica	MZ16F
Micropipette puller	Sutter Instrument	D-97