Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Summary

Количественный анализ Фитнес (КФД) является дополнительной серии экспериментальных и расчетных методов для оценки приспособленности микробной культуры. КФД оценивает влияние генетических мутаций, наркотиков или других прикладных процедур на микроб роста. Эксперименты масштабирование от целенаправленного анализа одной культуры до тысячи параллельных культур могут быть разработаны.

Protocol

Руководство КФД протокола (для штаммов S. CEREVISIAE)

1. Штаммы культивирования дрожжей

1. До 96 независимых штаммов дрожжей культивируют в 200 мкл богатых жидких сред в 96-и культуре блюдо. Штаммы выращиваются на насыщение контролем температуры инкубатора.
2. 96 контактный, 1/8 "Диаметр руководства реплики посева (SIGMA R-2508) стерилизуют первым погружением реплики посева на 100% этанола, пламенный, а затем оставить для охлаждения.
3. 200 мкл стерильной воды одетые в 96-и культуру пластину. Насыщенный культуры встряхивали (Eppendorf MixMate, 30 сек, 750 оборотов в минуту) и разбавляют путем погружения стерилизованных инструментов булавку в насыщенном штаммов в три раза, то в пластины, содержащей воду один раз.
4. Вывод инструмент повторно стерилизовать как в 1.2.
5. Стерилизованного инструмента вывод использоваться для определения разбавленных культуры на проданы пластины агара путем погружения в пластины, содержащей разбавленную культуру в три разап. передачи контактный инструмент для прямоугольных пластин твердого агара.
6. Прямоугольной плашки агар инкубируют при соответствующей температуре, прежде чем отображаемого вручную с помощью S & P Robotics spImager. Альтернативные методы захвата изображения могут быть также использованы такие как FujiFilm LAS4000 или менее дорогих цифровых зеркальных камер, если приняты меры для обеспечения равномерного освещения и последовательное позиционирование пластины по сравнению с изображениями камеры.
7. Метод адаптируется к меньшим числом параллельных культур, таких как 48, которые могут быть установлены на круглой чашки Петри, если приняты меры, чтобы обеспечить такой же угол относительно изображения камеры при каждой фотографии.

Полностью автоматизированная КФД протокола (для штаммов S. CEREVISIAE)

2. Штаммы культивирования дрожжей

1. Начните с прямоугольный массив независимых штаммов дрожжей, растущие на твердом агаре. В этом примере, начиная штаммы являются результатом пересечения температурычувствительным мутации запрос коллекции дрожжей удалений (YDC) на синтетическое Генетические Array (SGA). Окончательный SGA пластины в 1536 году формат. Это 16 строк на 24 столбцов колоний / культур, представляющих четыре повторяет из 384 независимых штаммов дрожжей. См. Рисунок 1 пластина макетов.
2. 384 штаммов из 1536 переданы робототехники использования S & P Robotics Inc BM3-SC робота с 96-контактный, 1 мм, диаметр оправки стерильной pintool на четыре 96-луночного культуры пластины, содержащие 200 мкл селективной среде (рис. 1). Pintool чистота и стерильность достигается путем последовательной промывкой в ​​стерильной воде в два раза (один раз с вращающейся щеткой, чтобы удалить остатки), 70% этанола (с ультразвуком) и, наконец, 100% этанола.
3. Культуры выращиваются на насыщение (в течение трех дней при температуре 20 ° C в этом примере, см. Рисунок 1).

3. Зрительные дрожжевых культур

1. Использование Beckman Biomek FX, насыщенной культурповторно ресуспендируют по встряхивая на Teleshake Variomag (против часовой стрелки на 1000rpm в течение 20 секунд) и разбавляют примерно 1:70, закрепив в 200 мкл стерильной воды с помощью стерильного 96 контактный робота инструмент контактный (V & P Научные магнитном основании pintool, 2 мм диаметр оправки). Pin чистоты и стерильности инструмента достигается промывкой в ​​стерильной воде, стиральная в 70% этанола (с щеткой для удаления мусора) и, наконец, погружение в 70% этанола с последующей сушкой.
2. Разводненная культуры заметили на твердых пластинах агара в 384 формате, используя тот же инструмент робота-контактный (см. Рисунок 1) после очистки и стерилизации.
3. После фиксации, пластины передается Cytomat с контролируемой температурой, увлажненный инкубатор с автоматической карусели и входной люк.

4. Image Capture

1. S & P Robotics автоматизированных изображений неоднократно снимает плиты из Cytomat инкубатор, снимает пластинку крышкой, ставят их именно под заключитег, равномерно освещенное пространство под Canon EOS Rebel Ti 35 DSLR, захватывает изображение 5184 х 3456 пикселей резолюции, заменяет пластину крышки, и возвращает их в инкубатор карусели. Один снимок сделан сразу после первоначальной передачи в инкубатор, чтобы обеспечить нулевой момент времени рост измерения (фон). Обработка робота и фотографии занимает 2 минуты в тарелке.
2. При полной загрузке карусели, максимально достижимая пластины изображений частотой один снимок каждые шесть часов. Пластины инкубируют в течение шести дней (до колонии насыщение роста. На рисунке 1 показаны три типичных изображений с временной ход при температуре 20 ° C.
3. Для целей учета и контроля пластин названы в соответствии с инкубатор имя, температуры, индивидуальный порядковый номер партии и положении в инкубаторе. Изображение имена объединения табличку и метку времени и автоматически построена на захват изображения (например, K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, тип файла FT1, таблица 1).

5. Захват экспериментальной метаданными

Метаданные файлов, описанных в данном разделе, разделенных табуляцией текстовые файлы, которые созданы вручную (например, с использованием электронных таблиц). Экспериментальные файл Описание (FT2, таблица 1) является уникальным для каждого эксперимента, но библиотека Описание (FT3, таблица 1) можно использовать повторно после создания широко.

1. Эксперимент описан в экспериментальной файл Описание (FT2, табл.1), содержащие столбцы для штрих-кодов (или автоматически генерируются табличке), эксперимент, начиная метки, плиты лечение, содержание твердой среде агара, псевдоним, библиотека, номерного знака (для библиотек несколько пластин) и повторить номер квадранта (см. рисунок 1), сворачивают с 1536 до 384 формат формат.
2. Библиотека штамм дрожжей описывается файл библиотеки Описание (FT3,
3. Дополнительный стандартный файл Имя Гена (Т4, таблица 1), описывающий стандартное имя гена (например, RAD9), связанные друг с систематическим ORF у-номер (например, YDR217C) выявление штаммов проходит проверку могут быть предоставлены. Этот файл содержит две колонки: ORF и Гена имя.

6. Анализ данных

КФД вычислительных рабочих требуется доступ к достаточно мощный многоядерный компьютер рабочей станции (например, Dell Precision T3500 с Xeon четырехъядерных процессоров 2,67 ГГц процессор и 12 Гб оперативной памяти), на котором установлен анализа Colonyzer образ программного ^3,4 и пакет КФД R ⁷ , оба из которых описаны в Интернете, находятся в свободном доступе и работает на различных операционных систем.

1. Запуск Colonyzer с каждым из захваченных изображений пластины в качестве входных данных, генерироваться Colonyzer выходного файла (FT5 табл. 1) для каждого изображения в плен. Выходные файлы Colonyzer указать культуры оценки плотности, области культуры, форма и цвет для каждого из 384 мест на отображаемой пластины. Выходной файл будет автоматически скопирована из файла исходного изображения (например, плита фотографии K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, таблица 1) соответствует файл Colonyzer выход K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, таблица 1)).
2. Использование пакета КФД R, загрузить экспериментальные метаданных (FT2, табл.1) и Colonyzer выходных файлов (FT5 табл. 1). Эти данные будут объединены в R кадров данных (которые могут быть экспортированы в текстовый КФД сырье файлы данных (FT6, таблица 1)) для последующего анализа.
3. Пакет КФД R содержит функции для сбора timecourses плотности клеток для каждой культуры, чтобы соответствовать вот обобщенныхgistic модели населения наблюдений и сюжет как (см. рис 2 и 3 для примера). Встроенная значения параметров записываются в файлы КФД логистических параметров (FT7 табл. 1). Смотрите КФД R пакет документации для получения дополнительной информации.
4. Пакет КФД R также содержит функции для контроля качества: край колонии удаляются за счет большей доступности питательных веществ на плите края и трудности с анализа изображений у стены пластины, культуры, которая не SGA и генотипов отображения связей с экрана конкретных генов-маркеров удаляются из анализа.
5. Некоторые количественные показатели фитнес выводятся из логистических населения параметров модели для каждой культуры. Они включают максимальную населения удвоение ставки (MDR) и число делений от прививки к насыщению (MDP). Для каждого набора повторных культур (уникальных генотипов, например) и для каждого определения пригодности, несколько сводная статистика фитнес оценки Compраспределенных: среднее и среднее фитнес, фитнес-стандартное отклонение и количество дубликатов наблюдалось. Сводные статистические данные выводятся на КФД Фитнес Основная файлов (FT8, таблица 1) для дальнейшего анализа, например, расчет генетического оценки взаимодействия (FT9 табл. 1).

7. Представитель Результаты

На рисунке 2 показана одна типичная кривая роста из 384 культур КФД растущий при 20 ° С на твердом агаре как количественно Colonyzer, с увеличением плотности клеток став сначала обнаружить после примерно 2 дня. Эта задержка, скорее всего, комбинированный эффект фазы культуры отставание после прививки на твердой среде и нижний предел обнаружения плотности клеток. На рисунке 3 показано 308 подобных кривых роста захваченных из одной пластины. Рисунок 4 показывает сравнение двух генома КФД экранов вывести генетическуюВзаимодействие сильных (адаптировано из ^1). КФД R пакет ⁷ также включает в себя функции для получения 3 и вывести рейтинг из списка рассматриваются генотипов и оценки генетической силы взаимодействия (ГИС), вместе с д-значение (False Discovery Rate (FDR) исправлены р-значения) для значение наблюдаемых ГИС.

Рисунок 1. Схема робота прививки штаммов дрожжей в 384 местах формате. Эта процедура начинается с 1536 независимой культуры в пластине (слева). В этом типичном примере колонии в положении 1,1, 1,2, 2,1 и 2,2 (красного цвета) четыре повторов того же генотипа HIS3 :: KANMX культур в желтом, растущих на краю тарелки. , имеют преимущество роста из-за отсутствия конкуренции и поэтому не рассматриваются КФД. Одна из них повторяет (например, 1,1) засевают в жидких средах рост в 96-луночного планшета с помощью 96-контактный инструмент, который прививает 96 из 1536 колоний каждый раз. Для того, чтобы привить один репликации для каждого из 384 генов удаления, четыре различных "квадранта" (обозначается как красный, синий, зеленый и фиолетовый) засевают на четыре 96-луночных содержащие питательные среды. После роста к насыщению (например, 3-х дней при температуре 20 ° C), культуру разводят в воде, затем четыре квадранта от одного повтора были замечены в 384-формате на твердую пластину агара (справа) в той же схеме, что и исходная пластина SGA (как указано на цвет). Этот процесс можно повторить, чтобы проверить другие повторяет: 1,2; 2,1 и 2,2. Пример покадровой изображения справа были захвачены 0,5, 2 и 3,5 дня после прививки. По материалам дополнительный рисунок 1 ^2. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

018/4018fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Один робот захватили КФД кривой роста.) КФД кривая роста дрожжей, растущих на агар, содержащий галактозу при 20 ° C. Изображения были захвачены робототехники примерно каждые 2 часа. Экспоненциальная фаза при этой температуре наблюдается примерно 1,5 дня, с увеличением плотности культуры став сначала обнаруживается примерно через 2 дня после прививки. Обобщенной логистической модели подходят к наблюдаемым данным (серая кривая). Параметры модели автоматически устанавливается в пакете КФД R представлены: K (пропускная способность (АС)), т (темп роста (г ^-1)), г (посевной плотности (АС)), V (рост симметрия). Б) Что касается панели, построенные с плотность клеток на логарифмической шкале. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3. Автоматически ген рейтингу кривые роста захватили параллельно с одной 384-формат пластин. Каждая панель показывает плотность клеток оценки (красный крест) и модель подходит (черная кривая) для независимых культур помечены имя ген или ORF у-число выросло в порядке КФД. Этот пример пластины изображено робота и вырос в автоматическом инкубаторе при температуре 20 ° C. Экспериментальные метаданных, автоматически включаются в показатель название: таблички, плиты лечения, агар и количество библиотек пластины. Встроенная значений параметров модели и автоматически печатается на каждой панели (см. Рисунок 2). Пограничный культуры были вырезаны из анализа КФД, в результате чего 308 культур в этом участке (см. КФД протокола 5.4). С краю культуры не анализируются в КФД этих местах культуры, как правило, заполнены с нейтральным штаммов контроля (pGAL-HIS3 в данном случае). Оригинальная версия этой фигуры, выход из пакета КФД R, в. PDF формате, и поэтому бесконечно масштабируемые и поиска по тексту запроса.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.

Рисунок 4. Сравнение приспособленности с двумя экранами КФД вывести генетических взаимодействий. Этот график показывает сравнение фитнес бутонизации удаление дрожжей (yfgΔ) в сочетании с нейтральной мутации ura3Δ или чувствительных к температуре cdc13-1 мутации и выросло на полу-разрешительной температура cdc13- 1 (27 ° C). Фитнес был рассчитан как произведение максимальной скорости удвоения и максимальный потенциал удвоения ^1. Большинство штаммов удаление хорошо растут в сочетании с нейтральной мутации ura3Δ, как и ожидалось, имеют высокую пригодность, но удаление в сочетании с cdc13-1 имеют широкий диапазон приспособленности. Голубой линии пересекаются в гоэлектронной расположение нейтральных мутаций his3Δ, сплошная линия является линейной регрессионной модели генетической независимости (ожидается пригодности cdc13-1 yfgΔ мутантов данного пригодности ura3Δ yfgΔ мутанты) и пунктирная линия является линией равных фитнеса. Удаления зеленого цвета значительно повысить фитнес дефект cdc13-1 штаммов. Удаления красного цвета существенно подавить тот же дефект. Расстояние по вертикали от любой мутации cdc13-1 yfgΔ из сплошной линией указывает на силу взаимодействия между генетическими cdc13-1 и yfgΔ под пластиной условиях. Заметим, что некоторые из самых сильных супрессоров cdc13-1, ранее идентифицированных генов контрольно-пропускной пункт, RAD17, DDC1 и RAD24 и нуклеазы EXO1 в верхнем правом углу. Генов, удаление снижает фитнес включает YKU80 (кодирование репарации ДНК и белков теломер укупорки Yku80) вблизи правом нижнем углу. Также обратите внимание, что некоторые группы генов, которые работают вместе, как правило, размещаться на этом участке. Три кластера пример выделены SPE1 синий, SPE2 и SPE3: спермидина синтез генов, RAD17, RAD24 и DDC1: кодирование компонентов контрольно-пропускной пункт скольжение зажима и контрольно-пропускной пункт зажим погрузчик, MRE11, RAD50 и XRS2: комплекс MRX, участвующих в DDR и EST1 И EST3: гены, участвующие в регуляции длины теломер. По материалам дополнительный рисунок 1В ^1, исходные данные, из которой этот участок был сгенерирован может быть загружен отсюда: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

"> Файл ID Тип файла Построенная вручную Частота обновления Предпосылка FT1 Пластина фотографии Нет На пластине и timepoint Да FT2 Описание экспериментальной Да На эксперимент Да FT3 Описание библиотеки Да На библиотеку Да FT4 Стандартные имена генов Да На библиотеку Нет FT5 Выходной Colonyzer Нет На timepoint на пластину Да FT6 КФД необработанных данных Нет На эксперимент - FT7 Нет На эксперимент - FT8 КФД Фитнес резюме Нет На эксперимент - FT9 КФД Генетические списку результатов взаимодействия Нет На ГИС исследования (2 expts). -

Таблица 1. Электронные КФД файлов. Перечислены все файлы (за исключением FT1) являются табуляции текстовых файлов и могут быть построены или прочитать с помощью любого текстового редактора или электронных таблиц. Для получения дополнительной информации о строительстве КФД файлы метаданных и точной интерпретации выходной КФД см. пакет КФД R ⁷ и документация документация Colonyzer программного обеспечения ^3.

Таблица 2. Методы оценки культуры фитнеса. Обзор возможностей и требуютments ряд методов для оценки микробной фитнес-культуры. Обзор Blomberg ⁸ содержит более подробное сравнение некоторых из них. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

КФД является во многих отношениях прямой потомок трех установленных скамейке масштабе микробиологические методы: культура разведения серии тестов месте ^9, кривая роста определения в газированных жидких культурах ⁹ и реплики покрытия ^13. Эти три метода кратко и по сравнению с КФД и других высокопроизводительных методов в таблице 2. В то время как разведение тесты серии месте определить пригодность штамма, как его способность к образованию колоний в ряде культур, выращенных из ряда разведений посевной, КФД меры деформации фитнес на повторных наблюдений одного культуры для построения кривой роста. Количественная фитнес от одной культуры позволяет многие другие штаммы должны быть рассмотрены одновременно, в одинаковых условиях. Репликация массивов культур позволяет повторное тестирование штамма коллекций, наиболее полезным при тестировании культуры фитнес различия в различных средах или генетического происхождения. КФД протокол представленЗдесь используются дорогие роботы оборудования для репликации, прививать, инкубировать и плиты изображение агар, подходит для наблюдения роста тысяч независимых культур (робот КФД, таблица 2). Однако, поскольку КФД основана на установленных, традиционные методы лабораторию, он также может быть проведена гораздо дешевле заменить роботом с помощью ручных операций (ручной КФД, таблица 2). Руководство включает в себя КФД репликации и прививки культур на агар пластины с использованием ручного инструмента контактный и ручной передачи пластин и из инкубатора для фотографии. То же самое вычислительных рабочих анализа могут быть применены для создания кривых роста либо из эксперимента.

КФД фитнес оценки кажутся сравнительно точно. На рисунке 4, средние приспособленности четырех например кластеров функционально связанных удаления гена выделены. Непосредственной близости от членов каждого класса функционально связанных генов в двух независимыхЛОР-генетического фона (ura3Δ и cdc13-1) указывает на воспроизводимость КФД оценки пригодности. Например, только 3 гена удаления (из возможных 4300) отделяют три члена сохраняющийся комплекс MRX.

Высокая пропускная способность альтернативы КФД для проверки характеристик роста штаммов микроорганизмов включают SGA ^5,6, конкуренция экраны в штрих библиотеки ^11,12 и экранов захвата оптического кинетики плотности в спектрофотометрических читатели пластины ^10, которые приведены в таблице 2 и более подробно описаны в другом месте ⁸ . КФД и SGA плит, где культуры растут на твердых поверхностях агара (агар на основе методов, таблица 2) могут быть обработаны быстро и легко робота. Твердые поверхности агара культур, хорошо газированной протяжении роста и клетки могут расти в основной культуры, что позволяет общительный микробов расти в обществе ^14. Остаются нетронутыми, микробных сообществffect свой микро-среды, выделяя токсины, такие как этанол, и, возможно, сигналов между клетками. Тем не менее, непрерывного перемешивания жидких культур, необходимых для достижения адекватной аэрации, искусственно разрушает микробные сообщества и микро-среды, которые могут повлиять на их режимы роста. Кросс-загрязнение меньше беспокойства в твердом методы агар, поскольку существует меньше возможностей для проведения брызг жидкости клеток между культурами. Если заражение происходит в результате иностранной воздушно-капельным путем микробов в твердых анализов агар, его часто можно обнаружить при визуальном осмотре твердых пластин агара и приходится или удалены.

КФД пропускная способность значительно выше, чем у параллельного жидкости методами в двух направлениях. Прежде всего, по КФД (и SGA) пластин, привитых культур упакованы вместе более плотно, давая более независимой культуры в тарелку. В КФД там, как правило, 308 культур, не считая неэкспериментальных край культур (рис. 1) комсравнению с параллельным жидких культур с 96 или 100 культур в тарелку. Во-вторых, КФД эксперименты могут быть соизмеримы с гораздо большим количеством пластин. В то время как количество пластин проанализированы в одном эксперименте КФД ограничивается только места в инкубаторе или теплой комнате, минимально допустимая частота захвата изображения и максимально достижимая частота захвата, количество пластин в жидкости эксперимент рост сильно ограниченным по возможности ридер (как правило, одну или две тарелки), или укладчик прикреплены к ридер (обычно 25-50 пластин). Недавно мы провели полностью автоматизирован КФД эксперимент на 123 пластин, каждая с 308 экспериментальных культурах, давая 37884 одновременных культур. Мы считаем, что максимально достижимое количество независимых культур, растущих в жидкость 96 (культур / пластина) х 50 (плиты / укладчик) = 4800, что составляет примерно в десять раз меньше, чем наши КФД пропускной способности. Альтернатива для жидкости экранами культуры является использование многих автоматизированных Грут-го устройства параллельно (табл. 1 из обзора Blomberg ^8), каждая из которых имеет емкость одной или двумя пластинами. Регулирование температуры в каждом устройстве не зависит, и поэтому условия не являются идентичными, но при условии, что они есть, это рабочий процесс потребует не менее 190 таких устройств в соответствии с КФД пропускная способность (при условии 200 жидких культур на устройство).

Таким образом, КФД является высококачественным рабочим процессом, который может быть с пользой применены для сбора количественных фенотипов роста в малых масштабах сосредоточены экспериментов и высокую пропускную способность экранов. Он достаточно гибок, чтобы эффективно применяться с различными требованиями к роботизированным оборудованием. Вычислительных компонент рабочего процесса КФД основана на свободном доступе, с открытым исходным кодом.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Replica Plater	Sigma	R-2508	96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate	Eppendorf	5353 000.014
Biomek FX	Beckman	A31842
Teleshake	Thermo Scientific	50095890	Installed on Biomek FX
BM3-SC	S&P Robotics Inc	BM3-SC	192 shelf rotating carousel
spImager	S&P Robotics Inc	spImager	High resolution manual imaging
spImager with Cytomat	S&P Robotics Inc	Custom	Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger	Thermo Scientific	51022222	Attached to spImager
Ecoline RE207	Lauda	RE207	Attached to Cytomat
spImager with carousel	S&P Robotics Inc	Custom	Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins	V&P Scientific	AFIX96FP12	N/A
96 x FP12 pins	V&P Scientific	FP12	50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool	V&P Scientific	VP425	Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush	V&P Scientific	VP425	N/A
Replica Plater	Sigma	R-2508	Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid	Nunc	734-0490	N/A
96 well sterile polystyrene plates	Greiner BioOne	655161	N/A
96 well sterile polystyrene lids	Greiner BioOne	656171	N/A
Table 3. Specific reagents and equipment.