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Biology

बुनियादी doi: 10.3791/4019 Published: June 10, 2012

Summary

को बनाए रखने और प्रचार निमेटोड की सुगमता

Protocol

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1. एक प्रोटोकॉल: 11 विरंजन के लिए संवर्धन कीड़े

सी. की बड़ी आबादी एलिगेंस उन्हें संवर्धन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है या तो तरल मीडिया में या प्लेट में ठोस मीडिया पर. वे आमतौर पर ई. साथ ठोस (निमेटोड ग्रोथ मीडिया) एन जी एम और खिलाया हो कोलाई बैक्टीरिया है, जो या तो जीवित या मृत प्लेट (12 यूवी द्वारा 13 गर्मी से या ठंड से 14 की मौत) को जोड़ा जाता है. सबसे सामान्य प्रक्रिया रहते OP50 ई. का उपयोग करता है कोलाई, जो uracil के संश्लेषण में दोषपूर्ण है और कि कीड़े अस्पष्ट होगा एक मोटी परत में ऊंचा हो जाना नहीं कर सकते हैं.

  1. NaCl की 3 जी, अगर और peptone के 2.5 ग्राम के 17 ग्राम मिश्रण और एच 2 ओ के 975 मिलीलीटर जोड़ें 50 मिनट के लिए आटोक्लेव.
  2. 55 डिग्री सेल्सियस तक कुप्पी शांत करने के लिए
  3. एम 1 2 CaCl के 1 मिलीग्राम, 5 / इथेनॉल में मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल मिलीग्राम के 1 मिलीग्राम, 1 एम 1 MgSO की 4 मिलीग्राम और एम 1 केपीओ 4 बफर के 25 मिलीलीटर (उनमें से सभी कोलेस्ट्रॉल लेकिन पहले autoclav जोड़ेंईडी).
  4. बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग पेट्री प्लेट में एन जी एम समाधान बांटना, प्लेट उनकी मात्रा के 3/2 को भरने के लिए.
  5. एक बार सूखा, यह सलाह दी जाती है contaminants का पता लगाने के लिए उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर प्लेटों 2-3 दिनों के लिए छोड़ दें. OP50 ई. की एक लकीर तैयार एक ग्लिसरॉल स्टॉक से कोली (OP50 Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर से प्राप्त किया जा सकता है).
  6. एक एकल कॉलोनी उठाओ और यह रातोंरात लेग में आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने.
  7. लामिना का प्रवाह में ढक्कन हटाने प्लेटों से लुप्त हो जाना और प्लेटों के बीच एक बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ OP50 जोड़ने नमी से अधिक की अनुमति दें.
  8. OP50 ई. की अनुमति दें कोलाई लॉन विकसित करने के लिए कमरे के तापमान पर या 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में 8 घंटे के लिए.
  9. प्लेट (अगर 37 में incubated रहे डिग्री सेल्सियस प्लेटों का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर ठंडा किया जाना चाहिए) कीड़े की वांछित राशि जोड़ें.

टिप्स:

  • मीडिया का एक ही राशि के गिरनेएक विंदुक या एक पंप निकालने की मशीन के साथ प्लेट में प्लेटों के लिए अगर की एक ही मात्रा सुनिश्चित करता है और stereomicroscope refocus करने की आवश्यकता के बिना प्लेट के स्थानांतरण की सुविधा है.
  • प्लेट्स (दोनों वरीय और बैक्टीरिया के साथ गैरवरीय) तैयार के बाद कई हफ्तों इस्तेमाल किया जा सकता है जब कमरे के तापमान या 4 सी. ° में एक कंटेनर में संग्रहित
  • थाली के किनारे करने के लिए बैक्टीरिया चढ़ाना से बचें. यदि लॉन थाली के किनारों तक फैली हुई है कीड़े पक्षों क्रॉल कर सकते हैं, बाहर सूखी और मर जाते हैं.
  • कीड़े लंबे समय तक रहते हैं अगर प्लेट पर वरीयता प्राप्त बैक्टीरिया पहले से ही 15 मृत.

2. प्रोटोकॉल बी क्षारीय Hypochlorite के समाधान के साथ उपचार (विरंजन ") 11:

इस विरंजन तकनीक सी. तुल्यकालन के लिए प्रयोग किया जाता है पहली लार्वा चरण में एलिगेंस संस्कृतियों (L1). विधि का सिद्धांत इस तथ्य में निहित है कि कीड़े ब्लीच के प्रति संवेदनशील हैं जबकि अंडा खोल ई बचाता हैयह से mbryos. , Alkaline हाइपोक्लोराइट समाधान के साथ उपचार के बाद भ्रूण तरल मीडिया में भोजन है, जो अंडे सेने की अनुमति देता है, लेकिन आगे के विकास को रोकता बिना incubated हैं.

  1. कीड़े को वयस्क अवस्था तक विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. M9 के बफर के साथ प्लेटें धोने द्वारा पुनर्प्राप्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में सगर्भा वयस्कों के.
  3. कमरे के तापमान पर 400xg (~ एक मानक तालिका अपकेंद्रित्र पर 1500 rpm) में 2 मिनट के लिए centrifuging और सतह पर तैरनेवाला त्यागने द्वारा गोली कीड़े.
  4. 1-3 washes में प्रदर्शन करना तक बफर जीवाणुओं की स्पष्ट प्रतीत होता है.
  5. वांछित विरंजन समाधान (मैं टेबल) को जोड़ें और कुछ मिनट के लिए आंदोलन (वयस्क ऊतक के विनाश विदारक माइक्रोस्कोप के तहत निगरानी की जानी चाहिए और प्रतिक्रिया जब वयस्कों के निशान अभी भी दिखाई दे रहे हैं बंद कर दिया, जो आम तौर पर कई पर निर्भर करता है के बीच में 3 और 9 मिनट लगते हैं मुद्दों ऐसी कीड़ा गोली की मात्रा, चर्चा में उल्लेख किया है) छवि (3) के रूप में,.
  6. M9 के buffe जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करोआर ट्यूब भरने के लिए.
  7. जल्दी से 1 मिनट के लिए (के बाद इलाज अभी भी सक्रिय हो सकता है) और 400 XG पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  8. M9 के बफर के साथ ट्यूब भरने के द्वारा गोली तीन बार धो लें.
  9. गोली M9 के बफर के 1 मिलीग्राम, या गैरवरीय एन जी एम प्लेटों को अंडे जगह है, और कोमल आंदोलन के साथ वांछित तापमान में सेते हैं. उचित वातन (4 छवि) प्रदान की जानी चाहिए.

टिप्स:

  • वहाँ अलग विरंजन समाधान कर रहे हैं, एक है कि अपने हाथ में बेहतर काम करता है (तालिका 1, अंजीर 1.) का चयन करें.
  • पहले से ही प्लेटों पर रखी अंडे एक एक्स - रे फिल्म के एक टुकड़े के रूप में एक नरम सामग्री के साथ अगर की सतह समाप्त द्वारा बरामद किया जा सकता है.
  • वयस्क जानवरों के भी कई रहता है तुल्यकालन के रूप में वे हाल ही में रची लार्वा के लिए भोजन की आपूर्ति का गठन ख़राब हो सकता है.
  • मैं उच्च तापमान से थोड़ा असुविधाजनक है जो विकास की गतिच कोई कीड़ा रुक जाती है तुल्यकालन है क्योंकि सिंक्रनाइज़ और unsynchronized कीड़े के बीच विकास में अंतर उच्च तापमान पर अधिक होगा.
  • विरंजन समाधान के लिए इसके उपयोग के लिए सिर्फ पूर्व प्रदर्शन करना होगा. इसके अलावा, ब्लीच शक्ति खो देता है के बाद यह थोड़ी देर के लिए खुला कर दिया गया है इसके photosensitivity की वजह से भाग में,. हम छोटे एम्बर बोतलों में अशेष भाजक के प्रत्येक नई बोतल सुझाव है कि इस तरह के नुकसान को रोकने के लिए और प्रकाश के संपर्क में कम से कम.

3. प्रोटोकॉल सी कृमि चढ़ाना:

  1. विरंजन किया गया था के बाद 12 और 24 घंटे (भ्रूण के विकास को पूरा करने के लिए समय तापमान पर निर्भर करता है) के बीच प्रतीक्षा और centrifugation (400 XG पर 2 मिनट) कीड़े को ठीक.
  2. सतह पर तैरनेवाला, आवश्यक प्लेटों पर बीज कीड़े त्यागें और शेष तरल शुष्क करते हैं.
  3. आवश्यक तापमान पर प्लेटें प्लेस.

टिप्स:

  • M9 के बफर में L1 के लार्वा 15 ° वाई सी एक सप्ताह के लिए कम से कम कमाल रखा जा सकता हैस्पष्ट परिवर्तन thout.
  • सावधान हो जब कीड़े आप बीज की गणना के कारण भी कई खाद्य तेजी से उम्मीद निकास कर सकते हैं और अपने प्रयोग को बर्बाद. लगभग 500 L1 के भोजन के बाहर चलने के बिना एक 55 मिमी प्लेट में वयस्कता तक पहुँच सकते हैं.

4. प्रोटोकॉल डी: सी. एलिगेंस अवलोकन

D.1 Nomarski अवलोकन

अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी रोशनी अस्थिर पारदर्शी नमूनों में इसके विपरीत बढ़ाने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया है. शब्द Nomarski चश्मे, उसके आविष्कारक के नाम को संदर्भित करता है. जीवित जानवरों को देख कर हम केवल परिवर्तन के स्थिरीकरण से व्युत्पन्न के साथ पशुओं के शरीर क्रिया विज्ञान की जांच कर रहे हैं. इसके अलावा, कोई लगानेवाला के रूप में जोड़ा जाता है, फ्लोरोसेंट मार्करों vivo में मनाया जा सकता है. यह तथ्य और fusing के ब्याज की एक जीन के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों की संभावना w में प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए यह संभव बनाते हैंhich अध्ययन के प्रोटीन शामिल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक का उपयोग करके, न ही रहते हैं कीड़े, मनाया जा सकता है लेकिन वे भी बरामद किया और किया जा सकता है मढ़वाया फिर से.

अगर पैड तैयारी का उपयोग करने से पहले (बस):

  1. पानी में 2% agarose तैयार पिघला. 65 में पिघल रखें डिग्री सेल्सियस
  2. एक तिहाई, साफ स्लाइड के दोनों पक्षों पर उन पर टेप का एक टुकड़ा के साथ दो स्लाइड रखें.
  3. पाश्चर विंदुक जगह साफ सतह पर अगर की एक बूंद का उपयोग करना.
  4. अगर एक और स्वच्छ तीन लंबरूप में स्लाइड के शीर्ष पर रखा स्लाइड के साथ कवर.
  5. धीरे प्रेस ताकि अगर ड्रॉप टेप spacers के मोटाई को चपटा है.
  6. एक बार अगर solidifies, धीरे बाहर खींच टेप स्लाइड और अन्य के लिए एक रिश्तेदार फिसलने से दो शेष स्लाइड्स अलग.

जी जानवरों के बढ़ते

  1. टी पर levamisole 1mm की जगह (10 μl) ड्रॉप या सोडियम azide 10-30 मिमीवह पैड के केंद्र.
  2. ड्रॉप में स्थानांतरण जानवरों एक कीड़ा लेने का उपयोग.
  3. धीरे जानवरों पर एक coverslip जगह है और यह कुछ नेल पॉलिश या सिलिकॉन के साथ दोनों पक्षों में तय है.

टिप्स:

  • 4 डिग्री सेल्सियस पर agarose 2% की aliquots रखें
  • पिघल agarose कम से कम एक दिन के लिए 65 ° सी में रखा जा सकता है.
  • नोट: Levamisole एक निकोटिनिक रिसेप्टर agonist है जो अंधव्यवस्थात्मक मांसपेशी पक्षाघात 16 elicits में है.
  • सावधान रहो, सोडियम azide अत्यंत विषैला होता है!

D.2 इथेनॉल का निर्धारण और DAPI धुंधला

यहां वर्णित प्रोटोकॉल DAPI साथ कीड़े रंगाई की एक तेजी से रास्ते का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन कृमि के dissecation की वजह से कुछ संरचना कुछ परिवर्तन उपस्थित हो सकता है. DAPI धुंधला है Carnoy समाधान या formaldehyde कि बेहतर 17 कीड़ा की अखंडता बनाए रखने के साथ नियतन के रूप में पिछले कीड़े को ठीक करने के लिए कई अन्य तरीके हैं.

इथेनॉल नियतन (18 से संशोधित)

  1. जगह ~ एक खुर्दबीन स्लाइड पर M9 के बफर के 10 μl (या पानी).
  2. एक कीड़ा का उपयोग सावधानी से ड्रॉप करने के लिए लेने 10-25 कीड़े हस्तांतरण.
  3. कीड़े को हटाने या उन्हें सूखी दे बिना फिल्टर पेपर या एक माइक्रो विंदुक को हटाने के रूप में बहुत संभव के रूप में M9 के बफर का उपयोग करना.
  4. ~ 90% इथेनॉल के 10 μl जोड़ें और इसे सूखा.
  5. 4 एक या दो बार कदम दोहराएँ.

4 'धुंधला ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)

  1. DAPI वांछित 2 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता बढ़ते मीडिया के साथ मिश्रण.
  2. बढ़ते मीडिया मिश्रण: एक बार इथेनॉल पूरी तरह से सुखाया गया है, DAPI की 7 μl जोड़ने.
  3. एक coverslip प्लेस और यह कुछ नेल पॉलिश या सिलिकॉन के साथ दोनों पक्षों में तय है. स्लाइड्स अवलोकन DAPI के बाद इसके अलावा लगभग 5 मिनट के लिए तैयार हो जाएगा.

टिप्स:

  • बढ़ते मेडआइए ग्लिसरॉल शामिल हैं, तो एक छोटी राशि पूरी तैयारी को कवर करने के लिए पर्याप्त है.
  • वाणिज्यिक बढ़ते मीडिया की एक विस्तृत विविधता (Fluoromount या लम्बा है, उदाहरण के लिए) मौजूद है, उनकी गुणवत्ता और कीमत तुम कितनी देर तक अपने नमूना संग्रहीत करना चाहते हैं पर निर्भर करते हैं.
  • सावधान रहो, DAPI एक ज्ञात उत्परिवर्तजन जो दृढ़ता से डीएनए में अमीर क्षेत्रों पर बांध है.

व्यंजन विधि

निमेटोड विकास मध्यम (एन जी एम)

1.7% (w / v) अग्रवाल
50 मिमी NaCl
% 0.25 (w / v) peptone
1 मिमी 2 CaCl
5 μg / मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल
25 मिमी 4 केपीओ
1 मिमी 4 MgSO

M9 के बफर

22mm के.एच. 2 4 पीओ
42 मिमी ना 2 4 HPO
86 मिमी NaCl
1 मिमी 4 MgSO

विरंजन समाधान का परीक्षण किया

# नुस्खा 1 # नुस्खा 2 # नुस्खा 3 # नुस्खा 4 # नुस्खा 5
पानी (मिलीग्राम) 2.75 3.5 0.5 0.5 1.5
सोडियम हीड्राकसीड (मिलीग्राम) 1.25 (1M) 0.5 (5) 2.5 (1M) 2.5 (2M) 2.5 (1M)
सोडियम hypochlorite ~~ 4% (मिलीग्राम) 1 1 1 2 1
कुल (मिलीग्राम) 5 5 4 5 5

टेबल मैं विभिन्न विरंजन समाधान व्यंजनों इस लेख के लिए परीक्षण किया गया. # 3 और # 4 व्यंजनों 2x हैं, और M9 का एक ही मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए. व्यंजन विधि # 1, # 2 # 5 के लिए पहले किया गया है 2, 11, 19, की सूचना दी. अंतिम सांद्रता: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl ~~ 0.8% # 2 NaOH 0.5m, NaOCl ~ 0.8%, # 3 0.625M NaOH, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH एम 1, NaOCl ~ 1.6%, # 5 NaOH 0.5m, NaOCl ~ 0.8%.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
आकृति 1. दो अलग अलग ऊष्मायन बार में पांच अलग विरंजन समाधान की तुलना N2 कीड़े M9 के साथ दो बार धोया पाँच 15 मिलीलीटर शंक्वाकार प्रत्येक विरंजन समाधान युक्त ट्यूबों में विभाजित किया गया. ट्यूब सख्ती से हिल गया और 1 मिलीग्राम M9 के साथ एक नया ट्यूब निर्दिष्ट समय के बाद प्रतिक्रिया को रोकने के लिए स्थानांतरित. विरंजन प्रक्रिया के बाद कीड़े M9 के 1 मिलीग्राम के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए incubated रहे थे. प्रत्येक मामले में, कम तस्वीर विरंजन, ऊपरी चित्र 24 घंटे के बाद के बाद लिया गया था.

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चित्रा 2. विरंजन समाधान के तापमान उपचार के प्रभाव को प्रभावित करता है N2 कीड़े के बराबर मात्रा में एक ही विरंजन या तो पहले 20 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा या एक ही समय के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा समाधान के साथ प्रक्षालित थे. बस विरंजन के बाद दो स्तंभों के बाएँ दिखाने के चित्रों पर. के बाद 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूबों में M9 के 1 मिलीग्राम के साथ उपचार कीड़े incubated रहे थे 20 ° C पर 24 घंटे के लिए. सही प्रदर्शन चित्रों पर 24 घंटे बाद स्तंभ.

चित्रा 3
चित्रा 3. अनुपात कीड़ा गोली: alkaline हाइपोक्लोराइट ऊष्मायन के समय उपचार के प्रभाव को प्रभावित करता है कीड़ा गोली के 50, 100, 250, और 500 μl # 3 3, 6 और 9 मिनट के लिए समाधान विरंजन के 2 मिलीग्राम के साथ incubated रहे थे. रची L1, मृत भ्रूण और वयस्क टुकड़े के अवशेष ऊष्मायन के बाद 20 ° C 2 के लिए मात्रा निर्धारित किया गया M9 के बफर के 1 मिलीग्राम के साथ 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूबों में 4 घंटे है. लगभग तीन सहधारा वयस्क कीड़े के साथ 55 मिमी प्लेट 100 μl कीड़ा गोली पाने के लिए की जरूरत है.

चित्रा 4
चित्रा 4. उचित वातन अंडे सेने और सी. के अस्तित्व के लिए आवश्यक है एलिगेंस भ्रूण N2 कीड़े की एक 100 μl गोली 6 मिनट के लिए प्रक्षालित थे और 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूबों में 1, 5 या 10 मिलीग्राम के साथ incubated, के रूप में M9 के निर्दिष्ट, 24 घंटे के लिए 20 ° C पर. आंकड़े के ऊपरी भाग संस्कृतियों के 24 घंटे के बाद चित्रों को प्रदर्शित करता है, जहां तीर कि दरवाजा नहीं था अंडे से संकेत मिलता है. तल में, वहाँ एक ग्राफ कहा स्थितियों में विरंजन के बाद लार्वा (प्रकाश ग्रे) और मृत भ्रूण (अंधेरे ग्रे) 48 घंटे की राशि का चित्रण है.

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चित्रा 5. सी. के जीवन चक्र एलिगेंस. . विभिन्न चरणों में कीड़े की लंबाई लगभग. घंटे तापमान संकेत विकास के चरणों में अलग कीड़े की. Nomarski (ऊपर) और DAPI (नीचे) चित्र (20 ​​से संशोधित) के आधार पर प्रत्येक चरण तक पहुंचने की आवश्यकता है. L1 के प्रत्येक चरण में सबसे महत्वपूर्ण सुविधाओं को बढ़ाया हैं: तीर दैहिक जननपिंड और रोगाणु लाइन के व्यापारियों को इंगित करता है L4 प्रारंभिक: काला तीर Nomarski () के विकास योनी इंगित करता है, सफेद तीर (DAPI) दो gonadal हथियारों से संकेत मिलता है मिड. है. L4 देर तीर इंगित करता तथाकथित क्रिसमस पेड़ के स्तर पर विकसित करने योनी युवा वयस्क: काला तीर गर्भाशय के अंदर एक भ्रूण का संकेत है, नोक अंक spermatheca, सफेद तीर एक oocyte इंगित करता है गर्भवती वयस्क: नोक (DAPI) बताते हैं. निषेचित भ्रूण. Spermatheca DAPI छवि में तीर इंगित करता है.

चित्रा 6
6 चित्रा. L3, L4 और वयस्क चरणों में योनी आकारिकी है L3 मंच पर केवल एक छोटा सा लुमेन जहां योनी का गठन किया है देखा जा सकता है. L4, इस लुमेन तथाकथित "क्रिसमस का पेड़" बनाने का विस्तार. वयस्क में योनी में पहले से ही बंद कर दिया है. पीला लाइनों इन तीन चरणों में योनी के स्थान से संकेत मिलता है.

7 चित्रा
7 चित्रा. पर DAPI धुंधला L3, L4 जल्दी, L4 देर और वयस्क अवस्था L3 में., रोगाणु लाइन लम्बी है. L4, जननपिंड वर्तमान आकारिकी हथियार U-आकार. देर L4 मंच शुक्राणु जननपिंड के बाहर का भाग में देखा जा सकता है. युवा वयस्कों oocytes प्रस्तुत करते हैं. वयस्क रोगाणु लाइन oocytes और भ्रूण को प्रस्तुत करता है. पीला लाइनों वें पर रोगाणु लाइनों हदबंदीई विभिन्न चरणों में कहा गया है.

संख्या 8
8 चित्रा सी.. 15 और 25 डिग्री सेल्सियस N2 कीड़े पर एलिगेंस विकास प्रक्षालित, में M9 और आंदोलन में 15 डिग्री सेल्सियस, प्लेटों को स्थानांतरित और कहा तापमान पर संकेत बार हो में रातोंरात incubated रहे थे.

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Discussion

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निमेटोड तुल्यकालन

कई विरंजन समाधान का वर्णन किया गया है. हम पाँच अलग अलग व्यंजनों की कोशिश की (मैं तालिका) और, हमारे हाथ में, वे कीड़ा आबादी के तुल्यकालन में काफी अंतर छवि (1) नहीं दिखा था. हालांकि, हमारे प्रयोगों शो किया था कि तापमान (छवि 2), अनुपात विरंजन समाधान के रूप में इस तरह के मापदंडों: कीड़े की मात्रा छवि (3) और M9 की मात्रा के साथ जो भ्रूण को सेने के लिए incubated छवि (4) को प्रभावित करते हैं कीड़े का अस्तित्व, संस्कृति की उचित वातन के लिए संबंधित किया जा रहा है. हमारे मिलाते स्थितियों में, जबकि 15 मिलीलीटर की एक ट्यूब में 1 मिलीग्राम की मात्रा सभी कीड़े के अस्तित्व की अनुमति देता है, 5 मिलीग्राम की मात्रा पहले से ही बहुत ज्यादा उचित अंडे सेने और 15 मिलीलीटर की अधिकतम मात्रा को बराबर की अनुमति (नहीं दिखाया गया) .

सी. एलिगेंस विकास

अपने विकास के दौरान, छवि (5) वयस्क चरण से पहले के माध्यम से चला जाता है. रोगाणु लाइन सी. विकास मंच का एक अच्छा संकेत है एलिगेंस. सी. की आसान सुविधा एलिगेंस विकास है कि Nomarski प्रकाशिकी के तहत देखा जा सकता है योनी का विकास है, जो जल्दी L4 मंच पर फार्म शुरू होता है. पहली बार में केवल एक छोटा सा लुमेन मनाया जाता है, जो बाद में मध्य देर से L4 द्वारा तथाकथित "क्रिसमस का पेड़" आकार, फैलता है. अंत में, L4 के अंत तक योनी बंद कर देता है छवि (6). दूसरी ओर, DAPI धुंधला जननपिंड के विकास की निगरानी की अनुमति देता है. L1 में चार कोशिकाओं से L2 और L3 में कोशिकाओं को विभाजित और elongating जननपिंड. बाहर टिप कोशिकाओं, L3 पर देखा जा सकता है पीछे की ओर की ओर पलायन शुरू. अर्धसूत्रीविभाजन भी L3 के अंत से शुरू होता है. L4 बाहर का टिप कोशिकाओं में उनकी निश्चित स्थिति तक पहुँचने और जर्म कोशिकाओं शुक्राणु अलग. L4 शुक्राणु उत्पादन के अंत तक समाप्त होता है और oocyte उत्पादन शुरू होता है. Adul मेंटी कीड़े भ्रूण गर्भाशय छवि (7) के अंदर देखा जा सकता है.

विकास और तापमान

सी. एलिगेंस एक अलग तापमान पर निर्भर करता है दर पर विकसित जबकि यह पल अंडे रखी है से के बारे में 90 घंटे लगते हैं जब तक नया कीड़ा के लिए 15 में अपने अंडे ° सी, 45 घंटे के लिए पर्याप्त हैं जब 25 से बढ़ी देना शुरू ° सी छवि (6). विविध तापमान में अंतर के विकास दर का अध्ययन स्थापना की स्थिति और प्रयोगों प्रदर्शन में रिश्तेदार लचीलापन होता है. इसके अतिरिक्त, यह संभावना प्रदान करता है न केवल एक विशेष उपचार या परिवर्तन (तापमान संवेदनशील alleles के उदाहरण के लिए) के प्रभाव पर नजर रखने के लिए, लेकिन यह भी सबसे अच्छी स्थिति में जो बाहर एक विशेष प्रयोग करने की स्थापना की.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक के वित्तपोषण के लिए MICINN (पीटीए कार्यक्रम मॉन्ट्सेराट पोर्ट डे ला रिवा समर्थन), AGAUR (पीएचडी से लौरा Fontrodona के लिए फैलोशिप), Instituto de Salud कार्लोस III (Miguel Servet कार्यक्रम जूलियन Cerón समर्थन), और मैरी क्यूरी IRG, ISCIII और IDIBELL स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं प्रयोगशाला.

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Wood, W. B. The nematode Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).
  3. Potts, M. B., Cameron, S. Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research. Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).
  4. Kimble, J., Hirsh, D. The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).
  5. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
  6. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. 1-24 (2010).
  7. Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).
  8. Jia, K., Levine, B. Autophagy and longevity: lessons from C. elegans. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).
  9. Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).
  10. Waters, K. A., Reinke, V. Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans. Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).
  11. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. (2006).
  12. Smith, E. D. Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans. BMC Dev. Biol. 8, 49 (2008).
  13. Olahova, M. A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).
  14. Voisine, C. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2, e504 (2007).
  15. Garigan, D. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
  16. Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle. Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).
  17. Shaham, S. Methods in cell biology. Wormbook. (2006).
  18. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163, (1), 115-132 (2003).
  19. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).
  20. Protocols [Internet]. Available from: http://protocols.mmml.nl (2012).
बुनियादी<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em&gt; तरीके तुल्यकालन और निरीक्षण:
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Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019, doi:10.3791/4019 (2012).More

Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019, doi:10.3791/4019 (2012).

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