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Biology

기본 Published: June 10, 2012 doi: 10.3791/4019
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1Department of Cancer and Human Molecular Genetics, Bellvitge Institute for Biomedical Research, 2C. elegans Core Facility, Bellvitge Institute for Biomedical Research

Summary

선충류을 유지하고 증식의 아마

Abstract

선충류의 Caenorhabditis elegans의의 분자 및 발달 생물학에 대한 연구는 시드니 브레너에 의해 초기 70 년대 시작되었고 이것은 이후 모델 생물 1로 광범위하게 사용되었습니다. C.는 elegans은 그것 수년 2에 대한 기초 생물 학적 연구에 적합한 실험적인 시스템을 만들어 단순, 투명성과 짧은 수명주기와 같은 주요 특성을 가지고 있습니다. 많은 세포와 분자 프로세스 제어 동물 개발 진화 보존되어 세는 것을 때문에이 선충류에서 발견 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.

동물들이 성인기에 도달하기 전에 C. elegans 수명주기는 배아 단계 넷 애벌레 단계를 진행합니다. 개발은 온도에 따라 2-4일 소요될 수 있습니다. 단계의 각에는 몇 가지 특징적인 특성을 볼 수 있습니다. 깊은 annotat과 함께 4,5의 완전한 세포 혈통의 지식그 게놈의 이온 7,8를 노화 신경 생물학 6,, 줄기 세포 생물학 9, 배아 라인 생물학 10 다양한으로 분야에서 훌륭한 모델에이 선충류를 켜십시오.

C를 만들어 부가 기능 와 일할 수있는 매력적인 모델을 elegans 것은 비교적 쉬운 프로토콜을 통해 특정 단계에서 동기화된 웜의 인구를 얻기의 가능성이다. 이 선충류을 유지하고 전파의 용이성은 이러한 RNAi 스크린, microarrays, 대규모 시퀀싱 작게하거나 높은 처리량 실험의 다양한 사용될 수 웜은 대량의를 얻기 위해 강력한 도구를 제공 동기화의 가능성에 추가 타인 간의 immunoblot 또는 원위치 하이브리드화에서.

의 투명성, C. 때문에 elegans 구조도 Nomarski 마이크로로 알려진, 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 현미경으로 구분할 수복사합니다. 형광 유전자 바인더, DAPI (4 ', 6 diamidino-2-phenylindole)의 사용은 예를 들어, 특정 식별 및 현지화 개별 세포뿐만 아니라, subcellular 구조 / 그들에게 관련된 결함을 초래할 수 있습니다.

Protocol

1. 프로토콜 : 11 표백을위한 Culturing 웜

C의 대형 인구 elegans은 액체 언론이나 접시의 단단한 미디어 중 culturing 그들에 의해 얻을 수 있습니다. 그들은 일반적으로 E.으로 고체 NGM (선충류 성장 미디어)와 수사관에 재배되는 대장균의 (열에 13 또는 냉간 14에 의해, 자외선 12 시까지 사망) 생사 중 접시에 추가됩니다 세균. 가장 일반적인 절차는 라이브 OP50 E.을 사용합니다 uracil의 합성에 결함이 있고 벌레를 가리는 것이 두꺼운 레이어로 자라다 수 없습니다 대장균.

  1. NaCl 3 G, 한천의 17g 및 펩톤 2.5 g을 섞어서 H 2 O에의 975 ML에 추가 50 분 동안 압력솥.
  2. 55 ° C.에 플라스크를 냉각
  3. 1 M CaCl 2 일 ML, 에탄올 5 MG / ML 콜레스테롤 1 ML, 1 M MgSO 4 개 중 1 개 ML과 1 M KPO 4 버퍼의 25 ML (그들 모두 있지만 콜레스테롤 이전 autoclav 추가ED).
  4. 멸균 절차를 사용하여 페트리 접시에 NGM 솔루션을 분배, 그들의 부피의 2 / 3로 접시를 채우십시오.
  5. 일단 건조, 그것은 오염 물질의 검출을위한 사용하기 전에 2-3 일동안은 실온에서 번호판을 떠날 것이 좋습니다. OP50 중에 행진을 준비한다 글리세롤 주식에서 대장균 (OP50이 Caenorhabditis 유전학 센터에서 구할 수 있습니다.)
  6. 하나의 식민지를 선택하고 교반과 함께 37 ° C에서 하룻밤 LB에 들어라.
  7. 층류에서 뚜껑을 제거하여 접시에서 증발하고 멸균 파스퇴르 피펫으로 접시의 중앙에 OP50를 추가하는 수분을 초과 허용합니다.
  8. OP50 E. 허용 대장균의 잔디는 8 시간 동안 실온이나 37 ° C에서 하룻밤 사이에 성장합니다.
  9. 접시 (37시 incubated 경우 ° C 플레이트를 사용하기 전에 룸 온도에서 냉각한다)에 웜의 원하는 금액을 추가합니다.

도움말 :

  • 미디어의 동일한 금액의 용탕 주입피펫이나 펌프 디스펜서와 함께 접시에 접시에 한천 같은 볼륨을 보장하고 stereomicroscope를 집중할 필요가없이 번호판 이동을 용이하게합니다.
  • 실온 또는 4 ° C.에서 컨테이너에 보관하면 플레이트 (씨앗을 품고 및 박테리아와 unseeded 모두) 몇 주 준비된 후 사용할 수 있습니다
  • 접시의 가장자리에 박테리아를 도금하지 마십시오. 잔디 벌레들이 측면을 크롤 링하는 접시의 가장자리에 확장하면 밖으로 건조, 죽습니다.
  • 접시에 놓는 박테리아가 이미 15 사라졌으면 벌레가 더 오래 살고 있습니다.

2. 프로토콜 B : 알카라인 염소산 솔루션과 치료 ( "표백") 11

표백 기술은 C를 동기화하는 데 사용됩니다 최초의 애벌레 단계에서 elegans 문화 (L1). 알 껍질은 전자를 보호하면서 방법의 원리는 벌레는 표백제에 민감있다는 사실에있다그것에서 mbryos. 알칼리 염소산 용액과 치료 후, 배아는 부화를 허용하지만, 앞으로의 개발을 방지 음식,하지 않고 액체 매체 incubated됩니다.

  1. 벌레가 성인 무대까지 성장하도록 허용합니다.
  2. M9 버퍼로 접시를 씻는이 15 ML 튜브의 gravid 성인 복구할 수 있습니다.
  3. 룸 온도 400xg (표준 테이블 원심 분리기에서 ~ 1,500 RPM)에서 2 분 동안 centrifuging와 뜨는 폐기하여 펠렛의 웜.
  4. 버퍼가 박테리아의 맑은 나타날 때까지 1-3 세차장을 수행합니다.
  5. 원하는 표백 솔루션 (표 I) 추가 (성인 조직의 파괴가 해부 현미경으로 모니터와 성인의 흔적이 아직도 볼 때 반응은 일반적으로 몇 가지에 따라 3시 사이에 9 분 정도 걸립있는 중단해야 몇 분 동안 선동 이러한 논의에 언급 웜 펠렛의 볼륨) (그림 3)과 같은 문제.
  6. M9 buffe을 추가하여 반응을 정지R은 튜브를 기입합니다.
  7. 신속하게 400 XG에서 1 분 (치료가 계속 활성화될 수 있기 때문에) 원심 분리기와 뜨는 버리고.
  8. M9 버퍼와 함께 튜브를 작성하여 펠렛보다 세 번 씻는다.
  9. 펠렛에 M9 버퍼 1 ML 추가하거나 unseeded NGM 접시에 계란을 배치하고, 부드러운 교반하여 원하는 온도에 부화. 적절한 폭기는 (그림 4)을 제공하여야한다.

도움말 :

  • 다른 표백 해결책이 있습니다 (표 1, 그림. 1) 당신의 손에 더 잘 작동 하나를 선택합니다.
  • 이미 접시에 알을 낳았 같은 X 선 필름 조각 같은 부드러운 소재로 한천의 표면을 scrapping하여 복구할 수 있습니다.
  • 그들이 최근에 부화 유충에 대한 식량 공급을 구성으로 성인 동물의 너무 많은 유적들이 동기화를 손상 수 있습니다.
  • 높은 온도는 약간 불편 개발을 빠르게 전동기 및 비동기 웜 사이에 개발의 차이가 더 높은 온도에서 커야 때문에 F 어떠한 웜 생략 동기화.
  • 표백 용액은 그 사용 직전에 수행되어야합니다. 그것이 잠시 동안 오픈 이후 또한, 표백제는 photosensitivity로 인해 부분적으로 힘을 잃는. 우리는 이러한 손실을 방지하고 빛을에 대한 노출을 최소화하기 위해 작은 황색 병으로 나누어지는 각 새로운 병을 좋습니다.

3. 프로토콜 C : 웜 도금

  1. 표백이 수행 후에 12 24 시간 (배아 개발을 완료하는 데 시간이 온도에 따라 다름) 사이에두고 원심 분리 (400 XG에서 2 분)에 의해 벌레를 복구합니다.
  2. 필수 접시에 뜨는, 종자 웜을 무시하고 나머지 액체를 건조하게.
  3. 필요한 온도에서 접시를 놓습니다.

도움말 :

  • M9 버퍼에 L1의 애벌레는 ° C에서 1 주일 동안 적어도 출렁 WI 15 보관하실 수 있습니다명백한 변경을 thout.
  • 너무 많은 분들이 예상보다 빠르게 음식을 소진하고 실험을 망칠 수 있기 때문에 당신이 씨앗이됩니다 벌레를 계산할 때 조심하세요. 약 500 L1 음식이 다 실행하지 않고 55mm 판에서 성인기에 도달할 수 있습니다.

4. 프로토콜 D : C. elegans 관측

D.1 Nomarski 관찰

미분 간섭 대비 현미경은 흠없는 투명한 표본의 콘트라스트를 향상시키기 위해 사용되는 광학 현미경 조명 기술이다. 단어 Nomarski 그의 발명가의 이름을 따서 명명에 사용되는 프리즘,을 말합니다. 살아있는 동물을 관찰함으로써 우리는 고정에서 파생된 유일한 변경과 동물 생리학을 확인하실 수 있습니다. 더 정착액가 추가되지 않습니다로서뿐만 아니라, 형광 마커는 생체내에서 볼 수 있습니다. 이것은 사실과 흥미 유전자에 융합 형광 마커의 가능성은 가능 w에서 프로세스를 따르도록 할연구의 단백질이 관련되어있을 수도 hich. 이 프로토콜에 설명된 기술을 사용하여 라이브 벌레뿐만 아니라 관찰할 수 있지만 역시 다시 회수 및 도금 수 있습니다.

한천 패드 준비 (바로 사용 전)

  1. 물에 아가로 오스 2 % 준비하고 용융. 65 녹인 유지 ° C.
  2. 셋째, 깨끗한 슬라이드의 양쪽에서 그들에 테이프 조각으로 두 슬라이드를 삽입합니다.
  3. 파스퇴르 피펫 장소에게 깨끗한 표면 한천의 방울을 사용합니다.
  4. 수직 세 슬라이드 위에 놓여 다른 깨끗한 슬라이드로 한천을 커버.
  5. 그래서 한천 드롭이 테이프 스페이서의 두께로 평평하게되어 부드럽게 누르십시오.
  6. 한천이 굳은 후 부드럽게 녹화 슬라이드를 당겨하고 다른 한 상대를 밀어서 남은 두 슬라이드를 구분합니다.

살아있는 동물 마운트

  1. t쪽으로 놓으 levamisole 1mM의 방울 (10 μl) 또는 나트륨 azide 10-30 MM그는 패드의 중심지.
  2. 웜 피크를 사용하여 드롭으로 동물을 전송합니다.
  3. 부드럽게 동물 위에 coverslip을 배치하고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결.

도움말 :

  • 4 ° C.에 아가로 오스 2 % aliquots 유지
  • 녹은 아가로 오스는 적어도 하루에 65 ° C에 보관하실 수 있습니다.
  • 참고 : Levamisole이 경직 근육 마비에게 16 elicits nicotinic 수용체 작용제이다.
  • 주의, 나트륨 Azide은 매우 독성이 있습니다!

D.2 에탄올 고정 및 DAPI의 염색법

여기에서 설명한 프로토콜은 그러나 때문에 웜 dissecation의 일부 구조가 일부 변경을 제시 수, DAPI로 벌레를 염색의 빠른 방법을 나타냅니다. 이러한 나은 웜 17 무결성을 보존 Carnoy의 솔루션이나 포름 알데히드와 고정 등 DAPI 염색법의 이전에 벌레를 해결하기 위해 여러 가지 다른 방법이 있습니다.

에탄올 고정 (18에서 수정)

  1. 장소 ~ 현미경 슬라이드에 M9 버퍼의 10 μl (또는 물).
  2. 벌레를 이용하는 것은 신중하게 드롭으로 10-25 웜을 전송 선택하십시오.
  3. 벌레를 제거하거나 건조시키는없이 여과지 또는 가능한 마이크로 피펫 제거할만큼 M9 버퍼를 사용합니다.
  4. 90 % 에탄올의 ~ 10 μl를 추가하고 말리면.
  5. 한두 번 4 단계를 반복합니다.

4 ', 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색법

  1. 이 NG / μl의 최종 농도로 원하는 설치 미디어와 DAPI를 섞습니다.
  2. 장착 미디어 혼합물 : 에탄올이 완전히 증발되면, DAPI 7 μl를 추가합니다.
  3. coverslip을 놓고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결. 슬라이드는 DAPI의 추가 관찰 후에 약 5 분, 준비가 될 것입니다.

도움말 :

  • 장착 의대IA는 글리세롤을 포함, 작은 금액은 전체 준비를 충당 충분하므로.
  • 상업 장착 미디어의 다양한 (Fluoromount 또는 연장, 예를 들어)이 존재의 품질 및 가격은 샘플을 저장할 얼마에 따라 달라집니다.
  • 조심해, DAPI DNA가 풍부한 지역 시에에 강력하게 바인딩 알려진 mutagen입니다.

조리법

선충류 성장 매체 (NGM)

1.7 % (W / V) 한천
50 MM NaCl
0.25 % (W / V) 펩톤
1 ㎜ CaCl 2
5 μg / ML 콜레스테롤
25 MM KPO 4
1 ㎜ MgSO 4

M9 버퍼

22mM KH 2 PO 4
42 MM 나 2 HPO 4
86 MM NaCl
1 ㎜ MgSO 4

표백 솔루션 테스트

제조법 # 1 제조법 # 2 제조법 # 3 제조법 # 4 제조법 # 5
물 (ML) 2.75 3.5 0.5 0.5 1.5
수산화 나트륨 (ML) 1.25 (1M) 0.5 (5M) 2.5 (1M) 2.5 (2M) 2.5 (1M)
나트륨 차아 염소 산염은 4 % (ML)를 낙제야 일 일 일 2 일
총 (ML) 5 5 4 5 5

표 I. 다른 표백 솔루션 요리법이 기사에 대한 테스트. 조리법 # 3와 # 4 배이며, M9 같은 볼륨에 추가되어 있어야합니다. # 1, # 2와 # 5에 대한 조리법는 이전에 2, 11, 19보고되었습니다. 최종 농도 : # 1 NaOH 0.25M, NaOCl은 0.8 % 였죠 , # 2 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %, # 3 0.625M NaOH, NaOCl ~ 1 %, # 4 1 M NaOH, NaOCl ~ 1.6 %, # 5 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %.

5. 대표 결과

그림 1
1 그림. 두 개의 서로 다른 배양 시간에 다섯 가지의 표백 솔루션의 비교. N2 벌레는 M9와 함께 두 번 쓸려는 각 표백 용액을 포함하는 다섯 15 ML 원뿔 튜브로 분할되었다. 튜브는 적극적으로 떨면서 1 ML은 지정된 시간 후에 반응을 막을 M9로 새 튜브로 전송되었습니다. 표백 후 절차 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML 함께 incubated되었다. 각각의 경우에 더 낮은 그림 단지, 24 시간 후에 상위 사진을 표백 후 찍은.

_upload/4019/4019fig2.jpg "고도 ="그림 2 "/>
그림 2. 표백 용액의 온도는 치료의 효과에 영향을 미칩니다. N2 벌레의 평등 볼륨 중 이전에 20 분 동안 얼음으로 차게하거나 같은 시간 ° C ~ 25 살에 계속 같은 표백 솔루션을 표백했다. 단 표백 후 왼쪽 그림 표시에있는 두 개의 기둥. 치료 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated 있었다 후에. 24 시간 후에 바로 디스플레이 사진에 대한 열.

그림 3
그림 3. 비율 벌레 펠릿 : 알칼리성 염소산 보육 시간은 치료의 효과에 영향을 미치는 웜 펠렛의 50, 100, 250, 500 μl가 3, 6 및 9 분 동안 해결책 # 3을 표백 2 ML 함께 incubated되었다.. 부화 L1, 죽은 태아와 성인 파편의 유적은 2 20 ° C에서 배양 후 계량되었습니다 4 M9 버퍼 1 ML과 15 ML 원뿔 튜브의 시간. 어른 벌레로 약 세 합류 55mm 판은 100 μl 벌레 펠렛을 얻을 필요합니다.

그림 4
4 그림. 적절한 폭기는 부화와 C의 생존을 위해 필요합니다 elegans의 배아. N2의 웜의 100 μl 펠릿는 6 분 동안 표백 및 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 중에 지정된, 1, 5 또는 10 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated했다. 화살표가 부화하지 않은 알을을 나타낼 위치를 그림의 상단 부분은 24 시간 후에 문화 사진을 표시합니다. 맨 아래에 명시된 조건에 표백 후 유충 (밝은 회색)과 죽은 태아 (어두운 회색) 48 시간의 금액을 묘사한 그래프가있다.

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그림 5. C의 라이프 사이클 elegans. . 다른 단계에서 웜의 대략 길이. 시간 온도 (20에서 수정) 지정된 발달 단계에서의 서로 다른 웜니다. 나. Nomarski (최대) 및 DAPI (아래) 사진에 따라 각 단계에 도달하는 데 필요합니다. 각 단계에서 가장 중요한 기능은 확대되고 L1 : 화살표는 체세포의 생식선과 배아 라인의 엽 성의 전구 물질을 나타냅니다 L4 상순 : 검은 화살표 (Nomarski)은 개발 소문을 나타냅니다; 흰색 화살표 (DAPI)는 두 gonadal 무기를 나타냅니다 중순... L4 후반 : 화살표가 소위 크리스마스 트리 단계에서 개발 외음부를 나타냅니다 젊은 성인 :. 검은색 화살표가 자궁 안에 배아를 나타냅니다, 화살촉은 포인트가 spermatheca에, 흰 화살표 oocyte를 나타냅니다 Gravid 성인 :. 화살촉 (DAPI) 포인트 아웃은 수정된 배아. DAPI 이미지의 화살표가 spermatheca을 나타냅니다.

그림 6
6 그림. L3, L4와 성인 단계에 벌버의 형태학. L3 단계에서는 외음부가 형성되는 경우에만 작은 루멘을 볼 수 있습니다. L4에서는이 루멘은 소위 "크리스마스 트리"를 형성 확장합니다. 성인에서는 외음부가 이미 닫힙니다. 옐로우 라인이 세 단계에 산문의 위치를​​ 나타냅니다.

그림 7
그림 7. L3에서 DAPI의 염색법, 초기 L4, L4 지각하고 성인 단계. L3에서는 배아 라인은 늘어나지 않습니다. L4에, 생식선은 팔 현재 U-모양의 형태를. 늦은 L4 단계 정자에서 생식선의 말초 부분에서 볼 수 있습니다. 젊은 성인 oocytes을 제시. 성인 배아 라인 oocytes과 배아를 제공합니다. 옐로우 라인 회에서 배아 라인 경계를 정하다전자 다르게 명시된 단계.

그림 8
그림 8. C. 15 25 ° C. N2의 웜에서 elegans 개발 15시 M9와 교반 ° C, 접시에 양도하고 명시된 온도에서 지정된 시간을 성장에서 하룻밤 incubated, 표백되었다.

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Discussion

선충류 동기화

여러 표백 솔루션은 설명했습니다. 우리는 다섯 가지 요리법 (표 I)하려하고, 우리의 손에, 그들은 웜 인구의 동기화에 큰 차이 (그림 1)을 표시하지 않았다. 벌레의 부피 (그림 3)과 배아는 (그림 4) 부화를 위해 incubated하고있는 M9의 볼륨에 영향을 수행하지만, 우리의 실험은 온도 (그림 2)의 비율 표백 용액과 같은 매개 변수가있는 공연을 한 벌레의 생존은 문화의 적절한 폭기에 관한되고있다. 15 ML의 튜브에 1 ML의 볼륨은 모든 벌레의 생존을 허용하면서 우리 떨고있는 상황에서, 5 ML의 볼륨 (표시되지 않음) 적절한 계란을 부화 15 ML의 최대 볼륨과 비교를 허용하도록 이미 너무 많이이다 .

C. elegans 개발

개발 기간 동안, (그림 5)를 진행합니다. 배아 라인은 C의 발달 단계의 좋은 지표 elegans. C의 쉬운 기능 Nomarski 광학 아래에서 볼 수 있습니다 elegans 개발 초기 L4 단계에서 형성되기 시작 외음부의 개발이다. 처음에는 단지 작은 루멘이 관찰되고, 나중에 중반 후반 L4에 의해 소위 "크리스마스 트리"모양으로 확대 있습니다. 마지막으로, L4 말까지 외음부는 (그림 6) 닫힙니다. 한편, DAPI의 염색법은 생식선의 발달의 관찰이 가능합니다. L1에있는 네 개의 세포에서 L2와 L3의 세포를 분리하고 elongating 생식선 있습니다. L3에서 말초 팁 세포 dorsally 마이 그 레이션을 시작하여 관찰할 수있다. 감수 분열은 또한 L3 말까지 시작됩니다. L4 말초 팁 세포에서 그들의 최종 위치에 도달하고 배아 세포는 정자로 구분. L4 정자 생산의 마지막으로 종료하고 oocyte 생산​​이 시작됩니다. adul에서t 벌레의 배아는 자궁 (그림 7) 안에서 볼 수 있습니다.

개발 및 온도

C. elegans는 온도에 따라 다른 속도로 발달 : 새로운 웜이가 15에서 자체 계란 ° C, 25에서 재배하면 45시간 충분히 있습니다 놓고 시작하기 전에는 계란이 마련되는 순간부터 약 90 시간 소요하면서 ° C (그림 6). 다양한 온도에서 차동 개발 속도의 연구 조건을 설정하고 실험을 수행에 상대적으로 유연성이 생깁니다. 또한, 그것은 특정 치료 또는 변경 (예 : 온도에 민감한 대립 유전자의 경우)의 효과를 모니터링할뿐 아니라 가능성을 제공하고, 또한 특정 실험을 수행하는 최상의 조건​​을 확립.

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Disclosures

우리는 공개 할게 없다.

Acknowledgments

저자는 금융에 대한 MICINN (PTA 프로그램 몬트 세 라트 포르 드 라 Riva을 지원), AGAUR (로라 Fontrodona로 박사 원정대), Instituto 드 건배 카를로스 III (미구엘 Servet 프로그램 줄리안 Cerón을 지원), 그리고 마리 퀴리 IRG, ISCIII 및 IDIBELL을 인정하고 싶습니다 실험실.

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기본 프로토콜 이슈 64 유전학 발달 생물학 분자 생물학, 동기화 개발 Nomarski DAPI의 염색법
기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망
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