Summary
A facilidade de manutenção e propagação do nemátodo
Abstract
A investigação sobre a biologia molecular e do desenvolvimento de Caenorhabditis elegans nematóides foi iniciada na década de setenta por Sydney Brenner e desde então tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo 1. C. elegans possui atributos-chave, tais como a transparência, simplicidade e ciclo de vida curto que o tornaram um sistema experimental para estudos biológicos fundamentais para vários anos 2. Descobertas neste nematóide tem amplas implicações, pois muitos processos celulares e moleculares que o desenvolvimento animal controle evolutivo são 3 conservada.
C. elegans ciclo de vida passa por uma fase embrionária e quatro estágios larvais antes de os animais atingirem a idade adulta. Desenvolvimento pode levar de 2 a 4 dias, dependendo da temperatura. Em cada uma das várias fases traços característicos podem ser observadas. O conhecimento da sua linhagem celular completa 4,5, juntamente com o annotat profundaíon de seu genoma transformar este nematóide em um grande modelo em domínios tão diversos como a neurobiologia, 6 de envelhecimento 7,8, biologia das células estaminais 9 e biologia germinal 10.
Uma característica adicional que faz com que C. elegans um modelo atraente para trabalhar com a possibilidade de obtenção de populações de vermes sincronizados a uma fase específica através de um protocolo relativamente fácil. A facilidade de manutenção e propagação deste nemátodo adicionado à possibilidade de sincronização proporcionar uma ferramenta poderosa para obter grandes quantidades de vermes, que podem ser utilizados para uma grande variedade de pequenas experiências ou de alto rendimento como telas de RNAi, microarrays, sequenciação maciço, immunoblot ou hibridação in situ, entre outros.
Devido à sua transparência, C. elegans estruturas podem ser distinguidos sob o microscópio usando microscopia de contraste de interferência diferencial, também conhecido como Nomarski microscopiar. A utilização de um ligante de ADN fluorescente, DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol), por exemplo, pode levar à identificação e localização específica de células individuais, bem como as estruturas subcelulares / defeitos associados aos mesmos.
Protocol
1. Protocolo A: Worms cultivo de Branqueamento 11
Grandes populações de C. elegans pode ser obtido através da cultura de los quer em meios líquidos ou em suportes sólidos em placas. Eles são geralmente cultivadas em NGM sólido (meios de crescimento dos nemátodos) e alimentados com E. bactérias coli, que é adicionado para as placas, ou vivos ou mortos (morto por UV 12, pelo calor 13 ou pelo frio 14). O procedimento mais comum usa ao vivo OP50 E. coli, que é defeituoso na síntese de uracilo e não pode overgrow em uma camada de espessura que obscurecer os vermes.
- Misturar 3 g de NaCl, 17 g de agar e 2,5 g de peptona e adicionar 975 ml de H2O Autoclavar para 50 min.
- Arrefecer a 55 ° C.
- Adicionar 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 5 mg / ml de colesterol em etanol, 1 ml de 1 M MgSO4 e 25 ml de 1 M KPO 4 tampão (todos eles, mas colesterol anteriormente autoclaved).
- Usando procedimentos estéreis dispensar a solução NGM em placas de Petri; encher placas até 2/3 do seu volume.
- Depois de seco, é aconselhável para deixar placas à temperatura ambiente durante 2-3 dias antes da utilização para a detecção de contaminantes. Prepare uma seqüência de OP50 E. coli a partir de um stock de glicerol (OP50 pode ser obtido a partir do Genetics Caenorhabditis Center).
- Escolher uma única colónia e crescer em LB durante a noite a 37 ° C com agitação.
- Permitir que o excesso de humidade para evaporar a partir das placas, removendo a tampa no fluxo laminar e adicionar OP50 para o centro das placas com uma pipeta de Pasteur estéril.
- Permitir que o E. OP50 relvado coli a crescer durante a noite à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante 8 horas.
- Adicionar a quantidade desejada de vermes para as placas (se as placas incubadas a 37 ° C deve ser arrefecida à temperatura ambiente antes da utilização).
DICAS:
- O derrame de a mesma quantidade de meios de comunicaçãoNas placas com uma pipeta ou um dispensador de bomba assegura o mesmo volume de agar para as placas e facilita o deslocamento da placa, sem necessidade de reorientar o estereomicroscópio.
- Placas (ambos semeado e unseeded com bactérias) pode ser usado de várias semanas após preparado quando armazenado num recipiente à temperatura ambiente ou a 4 ° C.
- Evitar plaqueamento das bactérias para a borda da placa. Se o relvado estende-se às bordas da placa de os vermes podem rastrear os lados, secar e morrem.
- Worms viver mais tempo se as bactérias inoculadas sobre as placas já estão mortos 15.
2. Protocolo B: O tratamento com solução de hipoclorito Alcalina ("branqueamento") 11
A técnica de branqueamento é utilizado para sincronizar C. culturas elegans, na primeira etapa larval (L1). O princípio do método reside no facto de que os vermes são sensíveis a lixívia enquanto a casca do ovo protege embryos a partir dele. Após o tratamento com solução de hipoclorito alcalino, os embriões são incubadas em meio líquido sem alimento, o que permite a eclosão, mas impede o desenvolvimento adicional.
- Permitir vermes a crescer até o estágio adulto.
- Recuperar os adultos fêmeas grávidas em 15 tubos de ml por lavagem as placas com tampão M9.
- Vermes pelotas por centrifugação durante 2 minutos a 400xg (~ 1500 rpm numa centrífuga de mesa padrão) à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
- Realizar lavagens 1-3 até que o buffer parece claro de bactérias.
- Adicionar a solução desejada de branqueamento (Tabela I) e agitar durante alguns minutos (a destruição do tecido adulto deve ser monitorizada sob o microscópio de dissecação ea reacção parou quando vestígios de adultos ainda são visíveis, o que leva normalmente entre 3 e 9 minutos, dependendo vários questões, tais como o volume de sedimento verme, mencionado na discussão) (Fig. 3).
- Pare de reacção adicionando M9 Buffer para encher o tubo.
- Rapidamente centrifugar (uma vez que o tratamento pode ainda ser activa) durante 1 minuto a 400 xg e descartar o sobrenadante.
- Lavar pelota mais três vezes, enchendo o tubo com tampão M9.
- Adicionar 1 ml de tampão M9 ao sedimento, ou colocar os ovos para placas NGM unseeded, e incubar à temperatura desejada com agitação suave. Arejamento adequado deve ser fornecido (Fig. 4).
DICAS:
- Existem diferentes soluções de branqueamento, escolher o que funciona melhor em suas mãos (Tabela 1, fig. 1).
- Ovos já estabelecidas sobre as placas podem ser recuperados por escarificação da superfície do agar com um material macio tal como um pedaço de uma película de raios-X.
- Restos demais de animais adultos podem prejudicar a sincronização, já que constituem uma fonte de alimento para as larvas recém-eclodida.
- As temperaturas mais elevadas acelerar um pouco o desenvolvimento que é inconveniente if qualquer verme sincronização salta porque a diferença de desenvolvimento entre vermes sincronizadas e não sincronizadas será maior a temperaturas mais elevadas.
- Solução de branqueamento deve ser realizada imediatamente antes da sua utilização. Além disso, lixívia perde potência depois de ter sido aberta por um tempo, em parte devido à sua fotossensibilidade. Sugerimos a alíquota de cada frasco novo em odres âmbar pequenas quantidades para evitar tais perdas e minimizar a exposição à luz.
3. Protocolo C: Chapeamento Worm
- Esperar entre 12 e 24 horas (o tempo para completar o desenvolvimento embrionário depende da temperatura) depois do branqueamento foi realizado e recuperar vermes por centrifugação (2 minutos a 400 xg).
- Elimine o sobrenadante vermes, sementes sobre as placas necessárias e deixe o líquido restante seca.
- Colocar as placas à temperatura requerida.
DICAS:
- Larvas L1 em tampão M9 pode ser mantido a 15 ° C agitando pelo menos durante uma semana wiThout alterações óbvias.
- ter cuidado ao calcular os Worms vai semente porque muitos podem esgotar a comida mais rápido do que o esperado e arruinar a sua experiência. Cerca de 500 L1 pode atingir a idade adulta em uma placa de 55 milímetros, sem ficar sem comida.
4. Protocolo D: C. elegans observação
D.1 Nomarski observação
Microscopia de contraste de interferência diferencial é uma técnica de microscopia óptica de iluminação utilizada para melhorar o contraste em amostras não coradas transparentes. O Nomarski palavra refere-se ao prisma usado, o nome de seu inventor. Através da observação dos animais vivos, somos capazes de analisar a fisiologia do animal com as alterações apenas derivados de imobilização. Além disso, como não fixador é adicionado, marcadores fluorescentes podem ser observados in vivo. Este facto e à possibilidade de marcadores fluorescentes de fusão para um gene de interesse tornar possível a seguir os processos em which a proteína de estudo podem estar envolvidos. Ao utilizar a técnica descrita no este protocolo, não só vermes vivos pode ser observado, mas também podem ser recuperados e plaqueadas de novo.
Preparação Agar pad (imediatamente antes da utilização):
- Preparar agarose 2% em água e derreter. Manter fundidos a 65 ° C.
- Coloque duas lâminas com um pedaço de fita adesiva sobre eles em ambos os lados de uma corrediça, terceiro limpo.
- Usando uma pipeta de Pasteur lugar uma gota de ágar sobre a superfície limpa.
- Cobrir o agar com outra lâmina limpa colocada no topo das três lâminas perpendicularmente.
- Pressione cuidadosamente para que o gota agar é achatado com a espessura dos espaçadores de fita.
- Uma vez que o agar solidifica, puxe as lâminas gravadas e separar as duas lâminas restantes deslizando um em relação ao outro.
Montagem de animais vivos
- Coloque uma gota (10 ul) de levamisole 1 mM ou azida de sódio 10-30 mM para tele centro do painel.
- Transferência dos animais para a queda usando uma picareta worm.
- Delicadamente, coloque uma lamela sobre os animais e corrigi-lo em ambos os lados com um pouco de unha polonês ou silicone.
DICAS:
- Manter alíquotas de agarose a 2% a 4 ° C.
- De agarose fundida pode ser mantido a 65 ° C durante pelo menos um dia.
- Nota: Levamisole é um agonista do receptor nicotínico que provoca paralisia muscular espástica 16.
- Seja cauteloso, Azida de sódio é extremamente tóxico!
D.2 fixação e coloração Etanol DAPI
O protocolo descrito aqui representa uma maneira rápida de tingimento vermes com DAPI, no entanto, devido à dissecação do worm algumas estruturas podem apresentar alguma alteração. Existem vários outros métodos para corrigir vermes anteriores para a coloração DAPI, tais como fixação com solução de Carnoy ou formaldeído que preservam a integridade melhor do verme 17.
Fixação etanol (modificado a partir do 18)
- O local de ~ 10 ul de tampão M9 (ou água) numa lâmina de microscópio.
- Usando um verme Escolha com cuidado transferir 10-25 vermes para a queda.
- Utilizando papel de filtro ou um micro-pipeta remover tanto quanto tampão M9 quanto possível sem a remoção dos vermes ou deixá-los seco.
- Adicionar ~ ul 10 de etanol 90% e deixe secar.
- Repita o passo 4, uma ou duas vezes.
4 ',6-diamidino-2-fenilindol coloração (DAPI)
- Misturar DAPI com os meios de montagem desejada para uma concentração final de 2 ng / uL.
- Uma vez que o etanol se ter evaporado completamente, adicionar 7 uL da DAPI: mistura meios de montagem.
- Coloque uma lamela e corrigi-lo em ambos os lados com um pouco de unha polonês ou silicone. As lâminas estará pronto para ser min observação aproximadamente 5 após a adição de DAPI.
DICAS:
- A montagem media contém glicerol, portanto, uma pequena quantidade é suficiente para cobrir toda a preparação.
- Existe uma grande variedade de comerciais meios de montagem (Fluoromount ou prolongar, por exemplo), a sua qualidade e preço dependem de quanto tempo você deseja armazenar sua amostra.
- Tenha cuidado, DAPI é um mutagênico conhecido que liga fortemente a AT regiões ricas em DNA.
Receitas
Médio nematóide do Crescimento (NGM)
1,7% (w / v) Agar
50 mM de NaCl
0,25% (w / v) de peptona
1 mM de CaCl2
5 ug / ml Colesterol
25 mM KPO 4
1 mM de MgSO4
Tampão M9
KH 2 PO 4 22mm
42 mM de Na 2 HPO 4
86 mM de NaCl
1 mM de MgSO4
Soluções de branqueamento testado
| receita # 1 | receita # 2 | receita # 3 | receita # 4 | receita # 5 | |
| água (ml) | 2,75 | 3,5 | 0,5 | 0,5 | 1,5 |
| de hidróxido de sódio (ml) | 1,25 (1M) | 0,5 (5M) | 2,5 (1M) | 2,5 (2M) | 2,5 (1M) |
| hipoclorito de sódio ~~~V 4% (ml) | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 |
| total (ml) | 5 | 5 | 4 | 5 | 5 |
Tabela I. Diferentes receitas de soluções de branqueamento testado para este artigo. Receitas # 3 e # 4 são 2x, e deve ser adicionado ao mesmo volume de M9. Receitas para # 1, # 2 e # 5 tenham sido previamente relatado 2, 11, 19. As concentrações finais: # 1 de NaOH 0,25 M, NaOCl ~~~V 0,8% , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%.
5. Os resultados representativos
Figura 1. Comparação de cinco diferentes soluções de branqueamento em duas diferentes tempos de incubação. Vermes N2 lavada duas vezes com M9 foram divididos em cinco 15 ml tubos cónicos contendo cada solução de branqueamento. Os tubos foram agitados vigorosamente e 1 ml transferida para um tubo novo com M9 para parar a reacção após o tempo especificado. Após o branqueamento vermes procedimento foram incubadas com 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Em cada caso, inferior fotografia foi tirada apenas depois do branqueamento, quadro superior 24 horas mais tarde.
_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" Figura 2 "/>
Figura 2. Temperatura da solução de branqueamento afecta a eficácia do tratamento. Volumes iguais de vermes N2 foram branqueadas com a mesma solução de branqueamento quer previamente arrefecida em gelo durante 20 minutos ou mantidas a 25 ° C durante o mesmo tempo. As duas colunas sobre as imagens da apresentação de esquerda apenas após o clareamento. Depois de vermes de tratamento foram incubadas em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Colunas sobre as imagens de exibição direito 24 horas depois.
Figura 3. A razão de verme pelete: tempo de incubação de hipoclorito alcalino afecta a eficácia do tratamento 50, 100, 250 e 500 uL de verme pelete foram incubadas com 2 ml de solução de branqueamento # 3 para 3 minutos, 6 e 9.. Eclodidos L1, embriões mortos e restos de fragmentos adultos foram quantificados após incubação a 20 ° C durante 2 4 horas em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de tampão M9. Cerca de três placas confluentes 55 mm com vermes adultos são necessários para obter uma 100 l verme pelota.
Figura 4. Arejamento adequado é necessária para a incubação e sobrevivência de C. elegans embriões. Uma pelota 100 uL de vermes N2 foram branqueadas durante 6 minutos e incubou-se em 15 ml tubos cónicos com 1 ml, 5 ou 10, conforme especificado, de M9 a 20 ° C durante 24 horas. A parte superior da figura mostra imagens das culturas após 24 horas, onde as setas indicam os ovos que não chocam. Na parte inferior, existe um gráfico que descreve a quantidade de larvas (cinzento claro) e embriões mortos (cinzento escuro) 48 horas depois do branqueamento com as condições indicadas.
tp_upload/4019/4019fig5.jpg "alt =" Figura 5 "/>
Figura 5. Ciclo de vida de C. elegans. uma. Comprimento aproximado dos vermes em diferentes fases. Horas necessário para atingir cada fase, dependendo da temperatura (modificado a partir de 20). B. Nomarski (para cima) e DAPI (para baixo) imagens de vermes diferentes nas fases de desenvolvimento indicados. Características mais significativas em cada fase são ampliados L1: seta indica os precursores do desenvolvimento das gónadas somática e da linha germinal precoce L4: seta preta (Nomarski) indica a vulva desenvolvimento; setas brancas (DAPI) indicam os dois braços gonadais Mid-... tarde L4: seta indica a vulva desenvolvimento na fase árvore chamada Natal jovens adultos:. seta preta indica um embrião dentro do útero, seta aponta para a espermateca, seta branca indica um oócito Gravid adulto:. Arrowhead (DAPI) aponta embriões fertilizados. Seta em DAPI imagem indica espermateca.
Figura 6. Morfologia vulva em L3, L4 e estádios adultos. Na fase L3 apenas lúmen uma pequena onde a vulva é formada pode ser observado. Na L4, essa luz se expande formando o chamado "árvore de Natal". No adulto a vulva já está fechado. As linhas amarelas indicar a localização da vulva a estes três fases.
Figura 7. Coloração DAPI em L3, L4 cedo, estágios L4 e Adultos. Na L3, germinal é alongado. Em L4, gônadas braços morfologia U-presente. Na tarde-L4 esperma estágio pode ser observado na parte distal das gônadas. Adultos jovens apresentam oócitos. A linha germinal adulta apresenta oócitos e embriões. As linhas amarelas delimitam linhas germinativas em theletrônicos diferentes estágios definidos.
Figura 8. C. elegans desenvolvimento aos 15 e 25 ° C. vermes N2 foram branqueadas, incubadas durante a noite em M9 e agitação a 15 ° C, transferidos para placas e cultivadas nos tempos indicados nas temperaturas indicadas.
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Discussion
Sincronização de nematóide
Várias soluções de branqueamento têm sido descritos. Tentámos cinco receitas diferentes (Tabela I) e, nas nossas mãos, eles não mostraram diferenças significativas na sincronização de populações de vermes (Fig. 1). No entanto, as nossas experiências fez mostram que os parâmetros como a temperatura (Fig. 2), a solução rácio de branqueamento: volume de vermes (Fig. 3) e do volume de M9 com que os embriões são incubadas durante incubação (Fig. 4) fazer afectar a sobrevivência dos vermes, estando relacionada com arejamento adequado da cultura. Nas nossas condições de agitação, enquanto que em um tubo de 15 ml num volume de 1 ml permite sobrevivência de todos os vermes, um volume de 5 ml é já demasiado grande para permitir que a eclosão dos ovos adequada e comparável ao volume máximo de 15 ml (não mostrado) .
C. elegans Desenvolvimento
Durante o seu desenvolvimento,
Desenvolvimento e Temperatura
C. elegans desenvolve a uma taxa diferente, dependendo da temperatura: enquanto que leva cerca de 90 horas a partir do momento em que o ovo é colocado até que o novo worm começa a colocar os ovos próprios a 15 ° C, 45 horas são suficientes quando cultivada a 25 ° C (Fig. 6). O estudo da taxa de desenvolvimento diferencial a temperaturas diferentes leva a flexibilidade relativa na criação de condições e realizando experiências. Além disso, oferece a possibilidade não só para monitorizar os efeitos de um tratamento particular ou alteração (por exemplo alelos sensíveis à temperatura), mas também para estabelecer as melhores condições em que efectuam uma experiência em particular.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer MICINN (PTA programa de apoio Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Phd Fellowship para Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programa de apoio Julián Cerón), e Marie Curie IRG, ISCIII e IDIBELL para financiamento o laboratório.
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