Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

Мы описываем подготовки Т-клеток фактор роста для в пробирке расширения антиген-специфических Т-лимфоцитов крыс линии.

Abstract

Поддержание антиген-специфических Т-клеток линий или клонов в культуре требует раундов антиген-индуцированной активации разделенных фаз клеточного 1,2 экспансии. Добавление интерлейкина-2 в культуре средств массовой информации во время фазы расширения необходимо предотвратить гибель клеток и достаточно для поддержания краткосрочной линии Т-клеток, но было показано, что увеличение Th1 поляризации 3. Замена интерлейкин 2, Т-клеточный фактор роста (TCGF), который содержит смесь цитокинов является более эффективным, чем интерлейкина-2 в поддержании долгосрочной линии Т-клеток в пробирке 3. Более того, TCGF могут быть легко получены в больших количествах в лаборатории и намного дешевле, чем рекомбинантный интерлейкин 2.

Здесь мы покажем, как готовить TCGF от крыс спленоцитов супернатантах культуры. Для этой процедуры, жмем селезенки от наивных крыс Льюиса эвтаназии для тимуса и сбора крови. Мы готовим одноклеточных суспензий из селезенки, лизировать эритроциты от осмотического шока, и семян спленоцитов в культуральной среде. Клетки стимулировали конканавалин, митоген, что не-выборочно активирует все лимфоцитов крыс T, вызывая продукцию цитокинов. Культуры supernantant собирается через 48 часов andexcess конканавалин связан с альфа-метил mannoside, чтобы предотвратить его активации Т клеточных линий на которых TCGF будет добавлен. TCGF затем стерильно фильтруют, аликвоты и хранили при температуре -20 ° C.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
  1. Возьмите Льюис крысы селезенки (крысы между 160-200г лучше). Dilacerate на льду в чашке Петри содержащие PBS + антибиотики (PBS-ПС) с использованием ячейки фильтра. Положить в 50 мл трубки. Залейте PBS-PS.
  2. Спиновые течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
  3. Вымойте клетки в два раза.
  4. Ресуспендируют пеллет в NH 4 Cl 0,15 М (5 мл на селезенки). Осторожно перемешать и постоянно с пипеткой в течение 3 минут на льду лизировать эритроциты. Заполните трубку со средой.
  5. Спиновые течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
  6. Вымойте клетки в два раза.
  7. Граф клеток. Крыса селезенки дает 200-250 миллионов клеток.
  8. Семенной клетки в 2 млн. на мл в полной среде: 50 мл на 75 см 2 колбы.
  9. Давайте расти в течение 48 часов в инкубаторе.
  10. Спиновые 15 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
  11. Сбор супернатант; отказаться от клеток.
  12. Добавить в дозе 15 мг / мл метилового mannoside в супернатант. Тщательно перемешать.
  13. Фильтр (0,2 мм)
  14. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C. Может храниться при 4 ° С в течение 10 дней, если это необходимо.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы готовим TCGF из спленоцитов крыс Льюиса, так как мы регулярно эвтаназии наивные крыс от этого штамма для сбора сыворотки и thymi стимулировать Льюис крыс линии Т-клеток в пробирке. Это TCGF может быть использована для поощрения роста и выживания Т клеточных линий из других штаммов крысы. TCGF также могут быть получены от других штаммов крыс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter