Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Förbereda T Factor Cell Tillväxt från Rat Splenocytes

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

Vi beskriver förberedelserna av T-cell tillväxtfaktor som används för in vitro-expansionen av antigen-specifika råtta T-lymfocyter linjer.

Abstract

Underhåll av antigen-specifika linjer T-cell eller kloner i kultur kräver rundor av antigen-inducerad aktivering separerade med faser av cellens tillväxt 1,2. Tillägg av interleukin 2 till kultur media under expansionsfasen är nödvändiga för att förhindra celldöd och räcker för att hålla korta rader T-cell, men har visat sig öka Th1 polarisering 3. Byte av interleukin 2 av T cell growth factor (TCGF) som innehåller en blandning av cytokiner är mer effektivt än interleukin 2 för att bibehålla långsiktiga linjer T-cell in vitro 3. Dessutom kan TCGF enkelt beredas i stora mängder i laboratorium och är mycket billigare än rekombinant interleukin 2.

Här visar vi hur man förbereder TCGF från råtta splenocyte kultur supernatanterna. För detta förfarande, skördar vi mjälte från naiva Lewis råttor avlivas för bräss och blod samling. Vi förbereder encelliga suspensioner från mjälte, Lyze de röda blodkropparna genom osmotisk chock, och utsäde till splenocytes i odlingsmedium. Cellerna stimuleras med concanavalin A, en mitogen att icke-selektivt alla lymfocyter råtta T aktiveras, förmå produktionen av cytokiner. Kulturen supernantant samlas 48 timmar senare andexcess concanavalin A är bundet till alfa-metyl mannoside att förhindra den från att aktivera T-cellinjer som TCGF tillkommer. Den TCGF är då steril-filtreras, alikvoteras och förvaras vid -20 ° C.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
  1. Ta Lewis råtta mjälte (råtta mellan 160-200g är bäst). Dilacerate på is i en petriskål med PBS + antibiotika (PBS-PS) med en cell sil. Sätt i en 50 ml tub. Fyll med PBS-PS.
  2. Spin i 10 min vid 4 ° C till pellets cellerna.
  3. Tvätta cellerna två gånger.
  4. Återsuspendera pelleten i NH 4 Cl 0,15 Mkr (5 ml per mjälte). Blanda försiktigt och kontinuerligt med en pipett i 3 min på is för att lysera erytrocyterna. Fyll röret med mediet.
  5. Spin i 10 min vid 4 ° C till pellets cellerna.
  6. Tvätta cellerna två gånger.
  7. Räkna celler. En råtta mjälte ger 200 till 250.000.000 celler.
  8. Seed cellerna på 2 miljoner per ml i komplett medium: 50 ml per 75 cm 2-kolv.
  9. Låt växa i 48 timmar i inkubatorn.
  10. Spin 15 minuter vid 4 ° C till pellets cellerna.
  11. Samla supernatanten, kassera celler.
  12. Lägg till 15 mg / ml en metyl mannoside till supernatanten. Blanda väl.
  13. Filter (0,2 mm)
  14. Alikvotera och förvara vid -20 ° C. Kan hållas vid 4 ° C i 10 dagar om det behövs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi förbereder TCGF från Lewis råtta splenocytes eftersom vi regelbundet euthanize naiva råttor från denna stam till skörd serum och Thymi att stimulera Lewis råtta T-cellinjer in vitro. Detta TCGF kan användas för att främja tillväxt och överlevnad av T-cellinjer från andra råtta stammar. TCGF kan också framställas av andra stammar av råttor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
Förbereda T Factor Cell Tillväxt från Rat Splenocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter