Summary
Vi beskriver förberedelserna av T-cell tillväxtfaktor som används för in vitro-expansionen av antigen-specifika råtta T-lymfocyter linjer.
Abstract
Underhåll av antigen-specifika linjer T-cell eller kloner i kultur kräver rundor av antigen-inducerad aktivering separerade med faser av cellens tillväxt 1,2. Tillägg av interleukin 2 till kultur media under expansionsfasen är nödvändiga för att förhindra celldöd och räcker för att hålla korta rader T-cell, men har visat sig öka Th1 polarisering 3. Byte av interleukin 2 av T cell growth factor (TCGF) som innehåller en blandning av cytokiner är mer effektivt än interleukin 2 för att bibehålla långsiktiga linjer T-cell in vitro 3. Dessutom kan TCGF enkelt beredas i stora mängder i laboratorium och är mycket billigare än rekombinant interleukin 2.
Här visar vi hur man förbereder TCGF från råtta splenocyte kultur supernatanterna. För detta förfarande, skördar vi mjälte från naiva Lewis råttor avlivas för bräss och blod samling. Vi förbereder encelliga suspensioner från mjälte, Lyze de röda blodkropparna genom osmotisk chock, och utsäde till splenocytes i odlingsmedium. Cellerna stimuleras med concanavalin A, en mitogen att icke-selektivt alla lymfocyter råtta T aktiveras, förmå produktionen av cytokiner. Kulturen supernantant samlas 48 timmar senare andexcess concanavalin A är bundet till alfa-metyl mannoside att förhindra den från att aktivera T-cellinjer som TCGF tillkommer. Den TCGF är då steril-filtreras, alikvoteras och förvaras vid -20 ° C.
Protocol
- Ta Lewis råtta mjälte (råtta mellan 160-200g är bäst). Dilacerate på is i en petriskål med PBS + antibiotika (PBS-PS) med en cell sil. Sätt i en 50 ml tub. Fyll med PBS-PS.
- Spin i 10 min vid 4 ° C till pellets cellerna.
- Tvätta cellerna två gånger.
- Återsuspendera pelleten i NH 4 Cl 0,15 Mkr (5 ml per mjälte). Blanda försiktigt och kontinuerligt med en pipett i 3 min på is för att lysera erytrocyterna. Fyll röret med mediet.
- Spin i 10 min vid 4 ° C till pellets cellerna.
- Tvätta cellerna två gånger.
- Räkna celler. En råtta mjälte ger 200 till 250.000.000 celler.
- Seed cellerna på 2 miljoner per ml i komplett medium: 50 ml per 75 cm 2-kolv.
- Låt växa i 48 timmar i inkubatorn.
- Spin 15 minuter vid 4 ° C till pellets cellerna.
- Samla supernatanten, kassera celler.
- Lägg till 15 mg / ml en metyl mannoside till supernatanten. Blanda väl.
- Filter (0,2 mm)
- Alikvotera och förvara vid -20 ° C. Kan hållas vid 4 ° C i 10 dagar om det behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi förbereder TCGF från Lewis råtta splenocytes eftersom vi regelbundet euthanize naiva råttor från denna stam till skörd serum och Thymi att stimulera Lewis råtta T-cellinjer in vitro. Detta TCGF kan användas för att främja tillväxt och överlevnad av T-cellinjer från andra råtta stammar. TCGF kan också framställas av andra stammar av råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
| Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
| Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma-Aldrich | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Heat-inactivated |
| Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
| RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | R7256 | |
| Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A. | ||||
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
