Summary
We beschrijven de voorbereiding van de T-cel groeifactor gebruikt voor de in vitro expansie van antigeen-specifieke T-lymfocyt rat lijnen.
Abstract
Onderhoud van antigeen-specifieke T-cellijnen of klonen in cultuur vereist rondes van antigeen-geïnduceerde activatie van elkaar gescheiden door fasen van celexpansie 1,2. Toevoeging van interleukine 2 tot en met de cultuur media tijdens de expansiefase nodig is om celdood te voorkomen en voldoende is om op korte termijn T-cel-lijnen te handhaven, maar is aangetoond dat Th1-polarisatie 3 te verhogen. Vervanging van interleukine-2 door T-cel groeifactor (TCGF), die een mix van cytokines bevat, is effectiever dan interleukine 2 het behoud op lange termijn T-cellijnen in vitro 3. Bovendien kan TCGF gemakkelijk worden bereid in grote hoeveelheden in het laboratorium en is veel goedkoper dan recombinant interleukine 2.
Hier laten we zien hoe TCGF te bereiden van de rat splenocyten kweeksupernatanten. Voor deze procedure, oogsten we de milt van naïeve Lewis-ratten gedood voor de thymus en bloedafname. Wij bereiden single-cell schorsingen van de milt, Lyze de rode bloedcellen door osmotische schok, en zaad van de splenocyten in kweekmedium. De cellen worden gestimuleerd met Concanavaline A, een mitogeen dat niet-selectief activeert alle rat T-lymfocyten, het induceren van de productie van cytokines. De cultuur supernantant is 48 uur later verzameld andexcess Concanavaline A is gebonden aan alfa-methyl-mannoside om te voorkomen dat het activeren van T-cellijnen die TCGF zal worden toegevoegd. De TCGF wordt dan steriel gefiltreerd, gealiquoteerd, en opgeslagen bij -20 ° C.
Protocol
- Neem Lewis rat milt (ratten tussen de 160-200g zijn het beste). Dilacerate op ijs in een petrischaaltje met PBS + antibiotica (PBS-PS) met behulp van een cel zeef. In een 50 ml buis. Vullen met PBS-PS.
- Spin gedurende 10 min bij 4 ° C om pellet de cellen.
- Was de cellen twee keer.
- Resuspendeer de pellet in NH 4 Cl 0,15 M (5 ml per milt). Meng voorzichtig en continu met een pipet gedurende 3 minuten op ijs om de erytrocyten lyseren. Vul de buis met medium.
- Spin gedurende 10 min bij 4 ° C om pellet de cellen.
- Was de cellen twee keer.
- Tel de cellen. Een rat milt geeft 200 tot 250 miljoen cellen.
- Zaad van de cellen op 2 miljoen per ml in compleet medium: 50 ml per 75 cm 2 kolf.
- Laten groeien gedurende 48 uur in de incubator.
- Spin 15 min bij 4 ° C om pellet de cellen.
- Verzamel de supernatant, gooi de cellen.
- Voeg toe 15 mg / ml een methyl mannoside aan het supernatant. Meng goed.
- Filter (0,2 mm)
- Aliquot en bewaar bij -20 ° C. Kunnen worden bewaard bij 4 ° C gedurende 10 dagen indien nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We bereiden TCGF van Lewis rat splenocyten, omdat we regelmatig naïeve ratten euthanaseren van deze stam tot de oogst serum en thymi om Lewis rat T-cel-lijnen te stimuleren in vitro. Dit TCGF kan gebruikt worden om de groei en overleving van T-cel-lijnen van de andere ratten stammen te bevorderen. TCGF kunnen ook worden bereid uit andere stammen van ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
| Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
| Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma-Aldrich | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Heat-inactivated |
| Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
| RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | R7256 | |
| Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A. | ||||
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
