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Biology

Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

Nous décrivons la préparation de facteur de croissance des lymphocytes T utilisée pour l'expansion in vitro de l'antigène spécifique de lignes T lymphocytes de rats.

Abstract

Entretien des lignes spécifiques de l'antigène des cellules T ou de clones en culture exige tours de l'antigène de l'activation induite séparées par des phases d'expansion de 1,2 cellule. Ajout de l'interleukine 2 au milieu de culture pendant la phase d'expansion est nécessaire pour prévenir la mort cellulaire et suffisantes pour maintenir à court terme des lignées de cellules T, mais a été montré pour augmenter la polarisation Th1 3. Remplacement de l'interleukine 2 par le facteur de croissance des cellules T (TCGF) qui contient un mélange de cytokines est plus efficace que l'interleukine 2 dans le maintien à long terme des lignées de cellules T in vitro 3. Par ailleurs, TCGF peut facilement être préparé en grandes quantités dans le laboratoire et est beaucoup moins cher que interleukine 2.

Ici, nous montrons comment préparer TCGF à partir de surnageants de culture de splénocytes de rats. Pour cette procédure, nous récoltons les rates de rats Lewis naïve euthanasiés pour le thymus et la collecte de sang. Nous préparons une seule cellule suspensions à partir des rates, lyser les globules rouges par choc osmotique, et les graines des splénocytes en milieu de culture. Les cellules sont stimulées par la concanavaline A, un mitogène que les non-sélective active tous les lymphocytes T chez le rat, induisant la production de cytokines. Le surnageant de culture sont recueillies 48 heures plus tard andexcess concanavaline A est lié à l'alpha méthyl mannoside pour l'empêcher d'activer lignées de cellules T à laquelle TCGF sera ajouté. Le TCGF est alors une filtration stérile, aliquotés et conservés à -20 ° C.

Protocol

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  1. Prenez rate rat Lewis (rats entre 160-200g sont les meilleurs). Dilacerate sur la glace dans une boîte de Pétri contenant du PBS + antibiotiques (PBS-PS) à l'aide d'une passoire cellule. Mettre dans un tube de 50 ml. Remplir avec du PBS-PS.
  2. Spin pendant 10 min à 4 ° C pour culotter les cellules.
  3. Laver les cellules deux fois.
  4. Reprendre le culot dans NH 4 Cl 0,15 M (5 ml par la rate). Mélanger doucement et en continu avec une pipette pendant 3 min sur la glace pour lyser les érythrocytes. Remplir le tube avec milieu.
  5. Spin pendant 10 min à 4 ° C pour culotter les cellules.
  6. Laver les cellules deux fois.
  7. Compter les cellules. Une rate de rats donne de 200 à 250.000.000 cellules.
  8. Ensemencer les cellules à 2 millions par ml dans un milieu complet: 50 ml par flacon de 75 cm2.
  9. Laissez pousser pendant 48 heures dans l'incubateur.
  10. Spin 15 min à 4 ° C pour culotter les cellules.
  11. Recueillir le surnageant et jeter les cellules.
  12. Ajouter 15 mg / ml de méthyle à une mannoside le surnageant. Mélanger soigneusement.
  13. Filtre (0,2 mm)
  14. Aliquoter et conserver à -20 ° C. Peut être conservé à 4 ° C pendant 10 jours si nécessaire.

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Discussion

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Nous préparons TCGF à partir de splénocytes de rats Lewis, depuis nous avons régulièrement euthanasier les rats naïfs de cette souche à la récolte de sérum et de stimuler la thymidine Lewis lignes rat cellules T in vitro. Cette TCGF peut être utilisé pour promouvoir la croissance et la survie des lignées de cellules T à partir de souches de rats d'autres. TCGF peuvent aussi être préparés à partir d'autres souches de rats.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat
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Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

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