Aanpassing van Aspergillus niger Morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes

Summary

Een methode om nauwkeurig te genereren en om volledig te karakteriseren morfologie van filamenteuze schimmel

Abstract

De filamenteuze schimmel A. niger is een veel gebruikte stam in een groot aantal industriële processen voedsel farmaceutische industrie. Een van de meest interessante vaak ongecontroleerde eigenschappen van deze draadvormige organisme is het complex morfologie. Het varieert van dichte bolvormige pellets viskeuze mycelia (figuur 1). Verschillende procesparameters en ingrediënten bekend schimmel morfologie ^een beïnvloeden. Sinds optimale productiviteit hangt sterk samen met een specifieke morfologische vorm, de schimmel morfologie is vaak de bottleneck van de productiviteit in de industriële productie.

Een eenvoudig en elegante aanpak om precies morfologische vorm is de toevoeging van anorganische onoplosbare microdeeltjes (zoals waterhoudend magnesiumsilicaat, aluminium-oxide of titaansilicaat oxide) aan het kweekmedium bijdragen tot toegenomen enzymproductie ^2-6. Aangezien er een obvious correlatie tussen micro-deeltjes afhankelijk van de morfologie en de productie van enzymen is het wenselijk om wiskundig te koppelen van de productiviteit en morfologische uitstraling. Daarom is een nauwkeurige kwantitatieve en holistische morfologische beschrijving is gericht.

Zo we een methode voor het genereren en karakteriseren micro deeltjes afhankelijk morfologische structuren en schimmels morfologie correleren met productiviteit (figuur 1) die mogelijk bijdraagt ​​tot een beter begrip van de morfogenese van organismen draadvormige.

De recombinante stam A. niger SKAn1015 wordt gekweekt gedurende 72 uur in een 3 L geroerde tank bioreactor. Door toevoeging van talk microdeeltjes in concentraties van 1 g / L, 3 g / l en 10 g / L vóór de inoculatie verschillende morfologische structuren is reproduceerbaar gegenereerd. Steriele monsters genomen na 24, 48 en 72 uur voor de bepaling van de groei vooruitgang en activiteit van de geproduceerde enzym. Degevormde product is de hoge waarde enzym β-fructofuranosidase, een belangrijke biokatalysator voor de neo-suiker vorming in voedings-en farmaceutische industrie, die katalyseert onder andere de reactie van sucrose in glucose ^7-9. Daarom is de kwantificering van glucose na toevoeging sucrose houdt de hoeveelheid geproduceerd β-fructofuranosidase. Glucose kwantificering van een GOD / POD-test ^10, die is aangepast voor hoge doorvoer analyse in 96-well micro titer platen.

Schimmel morfologie na 72 uur wordt onderzocht onder de microscoop en wordt gekenmerkt door digitale beeldanalyse. Daarbij worden deeltjesvorm factoren voor schimmelinfecties macro-morfologie, zoals een diameter van Feret's, geprojecteerde oppervlakte, omtrek, circulariteit, aspect ratio, rondheid und stevigheid berekend met de open source beeldbewerkingsprogramma ImageJ. Relevante parameters worden gecombineerd om een dimensieloos getal Morfologie (Mn) ¹¹ die een uitgebreid karakterisering van steltfungale morfologie. De nauwe correlatie van de morfologie aantal en de productiviteit worden gemarkeerd door wiskundige regressie.

Protocol

1. Reactor Setup en start van de teelt

4 bioreactor teelten in totaal worden uitgevoerd.

1. Een 3 L geroerde tank bioreactor met een werkvolume van 2,2 L voor de teelt van A. niger SKAn1015.
2. Giet 72,6 g glucose monohydraat in de reactor en vul het op met 1,9 L gedeïoniseerd water.
3. Installeer de reactor apparatuur zoals 3 schotten, een twee zes-bladige schijf turbine waaier, een pH-elektrode, een gas inlaat met lucht filter, een koel-vinger, een uitlaat luchtkoeler met lucht filter, een dompelbuis voor steriele bemonstering met luchtfilter en de inlaat slangen voor medium, inoculum, zuren en basen.
4. Autoclave de reactor bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
5. Sluit de reactor met het zuur-base reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) en de overeenkomstige pompen en het opzetten van een pH-waarde van 5,0 ± 0,05 met pH regeling.
6. Link de reactor met het koelwater systeem en zet de verwarmingsmantelin het reactorvat.
7. Installeer de temperatuursensor met bijbehorende controle-eenheid en tot een temperatuur van 37 ingesteld ± 0,1 ° C bij de temperatuur regeling.
8. Plaats de agitatie motor op de hoogte van de reactor en breng het in gebruik met een agitatie snelheid van 200 min ^-1.
9. Voeg de steriele minimale groeimedium ¹¹ door een van de steriele toevoerslangen (250 ml). Voor gemiddelde bereiding alle componenten waren autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min en gemengd. Drie teelten componenten omvatten talkpoeder (3MgO • 4SiO ₂ • H ₂ O) in concentraties van 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) en 10 g / L (reactor 4). Voor gebruik van de micro-deeltjes opnieuw in suspensie in 50 mM natriumacetaat buffer (pH 6,5) en de steriele medium toevoegen. In controlekweken (zonder deeltjes) vervangen micro deeltjes suspensie met 50 mM natriumacetaat buffer (pH 6,5).
10. Voeg de sporensuspensie (aantal kiemen) eens bereid Wucherpfennig et. al (2011) ¹¹ door een van de steriele toevoerslangen (50 ml), zodat de concentratie van sporen bedraagt ​​1X10 ml ^{6 -1.} De enting markeert het begin van de teelt (h = 0 h).
11. Start de beluchting met een snelheid van 1,0 L min ^-1.

2. Steriele Sampling na 24, 48 en 72 uur van de teelt

1. Neem 50 ml steriele cultuur bouillon in een flacon buis.
2. Gebruik monster voor het bepalen van biomassa droog gewicht, β-fructofuranosidase activiteit en microscopische analyse.

3. Bepaling van de Biomassa Gewicht na 24, 48 en 72 uur van de teelt

1. Biomassa monsters worden genomen ten minste in tweevoud.
2. Gewicht een cellulose filter met een microschaal na drogen in een exsiccator en plaats filter in een Büchner trechter aangesloten waterstraal vacuümpomp.
3. Filtreer een bepaald monster volume (bv. 10 ml) eennd Spoel het filter met 10 ml gedeïoniseerd water tot medium verbindingen te verwijderen uit de biomassa.
4. Rimpel het filter een keer in het midden, plaats hem in een glazen petrischaal en zet hem in een ruimte droger tot gewicht standvastigheid (minimaal 24 uur).
5. Koel het filter in een exsiccator en meet het gewicht.
6. Bereken de biomassa droge als het verschil tussen het gewicht van het filter met en zonder droge biomassa gedeeld door de gebruikte monstervolume.

4. Bepaling van de extracellulaire enzymatische activiteit van β-fructofuranosidase door GOD / POD-essay na 24, 48 en 72 uur van de teelt

Bewaar de monsters op het ijs voortdurend tijdens het werken met hen.

1. Filter 1,5 ml cultuur suspensie via een celluloseacetaat filter door de kweek suspensie met een injectiespuit door het filter in een reactiebuis. Bewaar de reactiebuis bij -20 ° C tot gebruik.
2. Voor het reactiemengsel gebruik 20il monster en voeg 200 ul 1,65 M sucrose opgelost in 0,05 M fosfaatbuffer (pH 5,4) de reactie van sucrose met glucose leiden. Cary de reactie ten minste in duplo.
3. Incubeer het reactiemengsel bij 40 ° C gedurende 20 min in een verwarmingsblok. Stop de reactie incuberen bij 95 ° C gedurende 10 min in een verwarmingsblok. Koel het reactiemengsel door slaan op ijs en draaien beneden het gecondenseerde water door centrifugeren bij 13.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
4. Om de pH en temperatuur afhankelijke splitsing van sucrose aan glucose rekeningnummer verrichten blanco met 20 pi gedeïoniseerd water in plaats van 20 pi monster.
5. Om rekening te houden resterende glucose in de cultuur bouillon, het uitvoeren van een negatieve controle voor elk monster. Daartoe gebruik 20 pi van het monster en inactiveren β-fructofuranosidase door verwarming bij 95 ° C gedurende 10 min voorafgaand aan de sucrose voegen en incubeer zoals beschreven in stap 4.3.
6. Verdun de monsters zodanig dat de volgende maatrefigureerde adsorptie in de gekalibreerde waardebereik.
7. Voer alle enzymatische assays in drievoud. Breng 2 pl verdunde monster in een micro-titer plaat goed. Breng een standaard assortiment voor de kalibratie van de micro-titer plaat door elk met 2 pl van tien glucose-oplossingen met tien verschillende kennis-concentraties (van 1 mm tot 15 mm) in plaats van 2 pl monster. Voor nulpunt kalibratie gebruik maken van 2 pl gedeïoniseerd water in plaats van 2 pl monster.
8. Voeg 200 pi van het reagens oplossing in elk putje met een multi pipet.
9. Incubeer het mengsel gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
10. Bewaar de micro-titer plaat op 6 ° C tot meting (een paar uur bij de meeste).
11. Meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een 96-wells plaat Sunrise micro-lezer en de Magellan data retrieval software. Stel de mengtijd tot 5 sec. en de rest periode tot 1 sec.
12. Open het resultaat grafiek met een spreadsheet en de bouw van een ijklijn met behulp van de standaard assortiment:
    glucose concentratie = a X + b absorptie
    
13. Bereken de activiteit:
    activiteit = (absorptie X verdunningsfactor-lege waarde) X a + b
    
14. Figuur uit de β-fructofuranosidase activiteit door het verschil te berekenen tussen de activiteiten van het monster en de juiste negatieve controle.
15. Bereken de specifieke productiviteit voor volgende gebruik door rekening te houden met biomassa droog gewicht en de β-fructofuranosidase activiteit ^11.

5. Microscopie en Automated Image Analysis na 72 uur van de teelt

1. Plaats ongeveer 3 ml cultuur suspensie in een plastic petrischaal enhen verdunnen fysiologische zoutoplossing tot morfologische structuren worden gescheiden.
2. Situeer de petrischaal onder de microscoop, die een geïntegreerde of aangesloten camera beschikt. Verwerven en op te slaan ongeveer 100 beelden (figuur 2) van morfologische structuren per monster. Let erop dat op elke afbeelding tenminste een object volledig is afgebeeld.
3. Open alle afbeeldingen van hetzelfde monster met de beeldverwerking programma ImageJ ^12. Zet de foto's naar zwart-wit met behulp van het process tool "Make Binary" (Figuur 2). Voor het aanbrengen van de opdracht voor de hele serie foto's gebruik maken van een macro-code als volgt.
   lopen (,, Make Binary ")
   
4. Open verwerkte binaire beelden ImageJ weer. Bereken de vormfactoren Feret de diameter, geprojecteerd oppervlakte, omtrek, circulariteit, aspect ratio, rondheid und degelijkheid voor elk beeld met de analyse tool "Set waardering". Voor het aanbrengen van de opdracht om een ​​series van beelden gebruik maken van een macro-code als volgt.
   draaien ("8-bit");
   draaien ("Maak Binary");
   draaien ("Set Schaal ...", "afstand = X = 1000 bekend pixel = 1 eenheid = um global");
   draaien ("Set Afmetingen ...", "gebied omtrek vorm van Feret de limiet scherm redirect = Geen decimaal = 3");
   draaien ("Analyseer deeltjes ...", "size = 10000-Infinity circulariteit = 0.00-1.00 show = Contouren display");
   Bepaal X het aantal pixels die tot 1000 pm correleert met de bouw van een rechte lijn in een schaal bar. Correleren aantal pixels van de rechte lijn met de lengte van de schaal bar pm.
5. Open het resultaat bundel waarin vormfactor waarden voor elk beeld met een spreadsheet. Bereken een Morfologie aantal als volgt over de afbeelding.
   
6. Bereken de gemiddelde waarde en standaarddeviatie voor de morfologie aantal, rekening houdend met alle afbeeldingen van een monster. Gebruik een grafische en data-analyse programma voor grafische correlatie van de morfologie nummer met de specifieke productiviteit en bepalen de mathematische relatie door wiskundige regressie.

6. Representatieve resultaten

Door toevoeging van talk micro deeltjes A. niger Skan 1015 morfologie is veranderd van een echte pellet morfologie van een gedispergeerd of zelfs mycelium morfologie. Overwegende dat de pellet morfologie is te zien in normale omstandigheden een mycelium morfologie wordt gecreëerd door suppletie van medium met 10 g / L van talk micro-deeltjes (figuur 4.). Tegelijkertijd de activiteit van β-fructofuranosidase verhoogt ongeveer 3 maal ^3-5. Een suppletie van 1 of 3 g / L van talkpoeder tot gedispergeerde morfologie, met een dubbele fructofuranosidase activiteit (figuur 4.).

De micro-deeltje afhankelijk morfologie volledig kan worden beschreven door de Morphology getal dat kan worden berekend met behulp van parameters bepaald door de automatische beeldanalyse. Perfect rond en glad pellets zal in microscopische beelden verschijnen als perfecte cirkels. Voor dergelijke deeltjes de morfologie getal met de waarde 1. De kleinste fragment van mycelium morfologie kan worden vereenvoudigd als eendimensionale lijn waarbij een morfologie aantal 0. Alle tussenliggende morfologische vormen, zoals langgerekte onregelmatige korrels of klompjes zal dus waarden tussen 0 en 1. Vrij grote deeltjes resulteren in een hoge schimmel deeltjes met een groot oppervlak of langwerpige deeltjes in een betrekkelijk laag morfologie nummer ^11.

Bij normale omstandigheden de morfologie in reactor 1 vertoont een Morfologie aantal rond de 0,8. De morfologie in reactor 4 met 10 g / L talkpoeder is voorzien van een Mn ongeveer 0,1. De morfologie nummer reactoren 2 en 3, met talkpoeder concentraties van 1 en 3 g / l ligt tussen deze uitersten, waaruit een gedispergeerd morfologie. Aangezien micro deeltjes afhankelijk morfologie is nauw verwant met de β-fructofuranosidase productiviteit wordt een mathematisch verband tussen morfologie aantal en productiviteit soortgelijke figuur 5 verkregen.

Figuur 1. Algemeen schema van de proefopzet en de analytische procedure. A. niger geteeld (met of zonder microdeeltjes) in een 3 L geroerde tank bioreactor gedurende 72 uur. Na 24 tot 48 en 72 ha monster voor het bepalen van biomassa drooggewicht en β-fructofuranosidase activiteit, die weer gebruikt voor de berekening van de specifieke productiviteit. Na 48 uur de schimmel morfologie wordt onderzocht onder de microscoop en wordt gekenmerkt door digitale beeldanalyse. Relevante parameters van beeldanalyse worden gecombineerd om een ​​morfologie getal, dat mathematische verband met de specifieke productiviteit.

Figuur 2. Stappen van beeldverwerking voor microscopische-gegenereerde beelden van morfologische structuren van A. niger. Stap 1: image overname door microscoop. Stap 2: image verbeteren indien nodig. Stap 3: beeld binarisatie, zwart-wit (binaire) beeld gegenereerd in ImageJ. Stap 4: het binaire beeld wordt verwerkt door en ongewenste object worden gewist. Stap 5: morfologische analyse wordt uitgevoerd met de "Analyseer deeltjes" functie van het open source programma ImageJ.

Figuur 3. Verschillende vormen van morfologische A. niger afhankelijk van de concentratie van toegevoegd microdeeltjes. Met de toenemende concentratie van micro-deeltjes toegevoegd de korrelgrootte nauwkeurig kan worden verlaagd tot kleine kern-schil pellets, kleine groepen en zelfs vrij verspreid mycelium. Morfologie techniek van Aspergillus niger SKAn1015 door micro deeltje suppletie in submerse cultuur. Zonder microdeeltjes (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O) 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) en 40-50 g / L (T). Afbeeldingen zijn gemaakt door lichtmicroscopie na 72 uur van de teelt.

Figuur 4. Fructofuranosidase activiteit in afhankelijkheid van talk micro deeltjesconcentratie 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) en 10 g / L (reactor 4). Reactor 1 is niet aangevuld met micro-deeltjes, hier de teelt wordt uitgevoerd onder normale omstandigheden.

Figuur 5. Representatieve goede correlatie ^(R2 = 0,91) van de morfologienummer en de specifieke productiviteit. De morfologie aantal uitgezet (abscis) tegen de specifieke productiviteit (ordinaat). Lineaire regressie levert de exponentiële relatie.

Discussion

De wijziging van schimmel morfologie interesse heeft gewekt in de biotechnologie sinds vele decennia. Verschillende studies hebben geprobeerd om gekozen procesparameters zoals de pH-waarde, het vermogen, temperatuur, medium voedingsstoffen of inoculum concentratie ¹ variëren, maar last hebben van eerder onnauwkeurig en onvolledig controle van de morfologie, hoge energiekosten, remming effecten of product instabiliteit, daarentegen, de suppletie van microdeeltjes kan een nauwkeurige techniek door middel van fungale morfologie afgestemd variatie van de deeltjesgrootte en-concentratie. Dit opent nieuwe mogelijkheden om micro-deeltjes te gebruiken voor optimalisatie en voor op maat gemaakte ontwerp van een hoog producerende morfologie in de biotechnologische productie met A. niger en draadvormige micro-organismen.

De digitale beeldanalyse is een makkelijk reproduceerbare methode om schimmel macro morfologie karakteriseren. Echter, de verscheidenheid van parameters voor grootte, vorm en oppervlakte kenmerkenter van morfologische structuren in de literatuur beschreven maakt snelle beoordeling van ingewikkelde schimmel morfologie. Het weergegeven aantal morfologie als een combinatie van de relevante parameters, voorkomt dit tekort en kan niet alleen worden gebruikt voor een volledige typering van morfologische structuren, maar ook voor directe correlatie met wiskundige productiviteit. Dit maakt opnieuw een inschatting van de productiviteit door gegeven morfologie en dus een aanpassing van de morfologie voor het proces moet mogelijk zijn.

De morfologie getal is het mogelijk onderscheid te maken tussen verschillende pellet en pol morfologie ^4,5. Voor de verdere ontwikkeling van de morfologie aantal de behandeling van de fractale dimensie lijkt te zijn veelbelovend. Een fractale dimensie geeft een meting van de complexiteit en de massa te vullen eigenschappen van een object ¹³ en is daarom voorbestemd voor holistische karakterisering van mycelium morfologie.

De creation van een hoge producerende mycelium morfologie, echter kan leiden tot problemen met het proces prestaties vooral in grootschalige teelt, omdat de myceliumgroei formulier is eerder aangetoond dat het vertonen een veel grotere cultuur bouillon viscositeiten ^2. Dit leidt tot problemen met warmte-en massaoverdracht en vorming van stilstaand niet gemengde gebieden, die een hoog vermogen en om de teelt duurder ^een Inherent. Daarom tussen schimmel morfologie en kweekvloeistof viscositeit moet worden gehouden bij het veranderen van de morfologie en worden opgenomen in andere modellen.