התאמה אישית של אספרגילוס ניז'ר מורפולוגיה באמצעות תוספת של חלקיקי טלק מיקרו

Summary

שיטה בדיוק להפיק באופן מקיף לאפיין המורפולוגיה של פטריות פילמנטיות

Abstract

א פטריות פילמנטיות ניז'ר ​​היא זן שימוש נרחב במגוון רחב של תהליכים תעשייתיים, החל מזון כדי תעשיית התרופות. אחד המאפיינים המסקרנים ביותר ובלתי נשלט לעתים קרובות של אורגניזם זה פילמנטיות הוא מורפולוגיה המורכב שלה. זה נע בין כדורי כדוריים צפופים כדי mycelia צמיגה (איור 1). פרמטרים שונים בתהליך וחומרי גלם ידועים להשפיע מורפולוגיה פטרייתי ^1. מאז התפוקה האופטימלי וקושרת חזק עם צורה מורפולוגית ספציפית, מורפולוגיה פטרייתי לעיתים קרובות מהווה את צוואר הבקבוק של פריון הייצור התעשייתי.

גישה קדימה אלגנטי ישר לשלוט במדויק צורה מורפולוגית הוא תוספת של מיקרו חלקיקים אורגניים מסיסים (כמו מגנזיום סיליקט להזרקה, אלומיניום אוקסיד או תחמוצת טיטניום סיליקט) עד בינוני תרבות תרומה ייצור האנזים גדל ^2-6. מאז יש obvious קשר בין המורפולוגיה החלקיקים מיקרו תלוי ייצור האנזים רצוי מתמטית לקשר את הפרודוקטיביות ואת המראה הצורני. לכן תיאור כמותי מורפולוגי מדויק הוליסטית ממוקדת.

לכן, אנו מציגים שיטה להפקת ולאפיין מיקרו תלויים החלקיקים מבנים מורפולוגיים, כדי לקשר בין המורפולוגיה פטרייתי עם פרודוקטיביות (איור 1) אשר ככל הנראה תורם להבנה טובה יותר של המורפוגנזה של מיקרואורגניזמים פילמנטיות.

א זן רקומביננטי ניז'ר ​​SKAn1015 מעובדת במשך 72 שעות ב L 3 עוררה bioreactor הטנק. על ידי תוספת של חלקיקי טלק מיקרו בריכוז של 1 גר '/ ל', 3 גר '/ ל' ו - 10 גר '/ ל' לפני חיסון מגוון רחב של מבנים מורפולוגיים נוצר reproducibly. דגימות סטריליות נלקחים לאחר 24 שעות, 48 ו 72 לקביעת ההתקדמות הצמיחה והפעילות של האנזים מיוצר.המוצר שנוצר הוא אנזים גבוהה ערך β-fructofuranosidase, biocatalyst חשוב ליצירת ניאו הסוכר במזון או תעשיית התרופות, אשר מזרז בין היתר את התגובה של סוכרוז לגלוקוז ^7-9. לכן, כימות של גלוקוז לאחר הוספת סוכרוז מרמז כמות fructofuranosidase-β מיוצר. כימות גלוקוז נעשה על ידי אלוהים / POD-Assay ^10, אשר שונה לניתוח תפוקה גבוהה ב 96-גם מיקרו צלחות titer.

מורפולוגיה פטרייתי לאחר 72 שעות נבדק על ידי מיקרוסקופ ומאופיינת על ידי ניתוח תמונה דיגיטלית. בעשותו כן, צורת החלקיקים גורמי המאקרו מורפולוגיה פטרייתי כמו בקוטר של Feret, באזור המוקרן, המערכת, המעגליות, יחס גובה, und מוצקות עגלגלות מחושבים עם התמונה קוד פתוח לעיבוד תוכנית ImageJ. הפרמטרים הרלוונטיים משולבים למספר מורפולוגיה מימדים (Mn) ^11, המאפשרת אפיון מקיף שלפטרייתי המורפולוגיה. קשר הדוק של מספר מורפולוגיה ופריון מודגשים על ידי רגרסיה מתמטית.

Protocol

1. הכור התקנה התחלה של טיפוח

4 cultivations bioreactor בסך הכל מתנהלים.

1. השתמש 3 עוררה L bioreactor מיכל עם נפח העבודה של L 2.2 לגידול של א ' ניז'ר ​​SKAn1015.
2. שופכים 72.6 גרם גלוקוז מונוהידראט לכור ולמלא את זה עם מים 1.9 ליטר deionized.
3. התקנת ציוד הכור כמו 3 רטטים, 2 6 להב הטורבינה מניע דיסק, אלקטרודת pH, כניסת גז עם מסנן אוויר, אצבע קירור, אוויר קריר הפליטה עם מסנן אוויר, צינור טבילה עבור דגימה סטריליים עם מסנן אוויר ו כניסת צינורות עבור, חומצה בינוני, הבידוד ובסיס.
4. החיטוי הכור ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
5. חבר את הכור עם מאגר חומצה בסיס (2 מ 'HCl, 2 M NaOH) לבין משאבות המתאימים ולהקים pH ערך של 5.0 ± 0.05 עם יחידת בקרת pH.
6. לקשר את הכור עם מערכת קירור מים ולשים מעיל חימוםסביב הכור.
7. התקנת חיישן טמפרטורה עם יחידת הבקרה המתאים להגדיר טמפרטורה של 37 ± 0.1 מעלות צלזיוס על יחידת בקרת טמפרטורה.
8. להתאים את המנוע על גבי תסיסה של הכור ויביאו אותו שירות במהירות תסיסה של 200 דקות ^-1.
9. הוסף בינוני סטרילית מינימלית צמיחה ¹¹ שוקת אחת צינורות כניסת סטריליים (250 מ"ל). להכנת בינוני כל הרכיבים היו autoclaved ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ומערבבים יחד. במשך שלושה cultivations הרכיבים כוללים אבקת טלק (3MgO • 4SiO ₂ • H ₂ O) בריכוזים של 1 גר '/ ל' (כור 2), 3 גר '/ ל' (בכור 3) ו - 10 גר '/ ל' (הכור 4). לפני השימוש, מחדש להשעות את חלקיקי מיקרו ב 50 חיץ נתרן אצטט מ"מ (pH 6.5) ולהוסיף אותו בינוני סטרילית. בתרבויות שליטה (ללא חלקיקים) להחליף את ההשעיה החלקיקים מיקרו ידי 50 חיץ נתרן אצטט מ"מ (pH 6.5).
10. מוסיפים את ההשעיה נבג (הבידוד)זה הוכן Wucherpfennig et. אל (2011) ¹¹ שוקת אחת צינורות כניסת סטריליים (50 מ"ל), כך ריכוז כמויות נבגי ל 1x10 ⁶ מ"ל ^-1. חיסון הוא תחילתה של טיפוח (ח = H 0).
11. התחל אוורור עם שיעור של 1.0 ל ^-1 דקות.

2. דגימה סטריליים לאחר 24, 48 ו - 72 שעות של טיפוח

1. קח 50 מ"ל של מרק התרבות סטרילי לתוך צינור flacon.
2. השתמש במדגם לקביעת משקל ביומסה יבש, β-fructofuranosidase הפעילות ניתוח מיקרוסקופי.

3. קביעת משקל יבש ביומסה לאחר 24, 48 ו - 72 שעות של טיפוח

1. דגימות ביומסה הם להילקח לפחות בשני עותקים.
2. משקל מסנן תאית עם קשקשים מיקרו לאחר ייבוש תא ייבוש ומניחים את המסנן משפך בוכנר עם משאבת מים הזרקת מחובר ואקום.
3. סנן נפח דגימה מוגדרים (למשל 10 מ"ל)ND לשטוף את המסנן במים deionized 10 מ"ל להסיר תרכובות בינוני מביומסה.
4. קמטים פילטר פעם אחת באמצע, יש להניח אותו בכלי זכוכית פטרי והכניס אותו לתוך המייבש בתא עד קביעות משקל (לפחות 24 שעות).
5. לקרר את מסנן תא ייבוש ולמדוד את המשקל.
6. לחשב את משקל ביומסה יבש כמו ההבדל בין משקל של המסנן עם ובלי ביומסה יבשים חלקי נפח המדגם.

4. קביעת פעילות אנזימתי של תאי β-fructofuranosidase מאמרו-POD אלוהים / אחרי 24, 48 ו - 72 שעות של טיפוח

לאחסן דגימות על הקרח כל הזמן תוך כדי עבודה איתם.

1. סנן 1.5 ההשעיה מ"ל תרבות שוקת אצטט תאית המסנן על ידי לחיצה על ההשעיה התרבות בעזרת מזרק דרך המסנן לתוך צינור התגובה. אחסן את צינור התגובה ב -20 ° C עד השימוש.
2. לקבלת תערובת התגובה להשתמש 20מדגם μL ולהוסיף 200 μL של סוכרוז 1.65 מ מומס חיץ M 0.05 פוספט (pH 5.4) ליזום את התגובה של סוכרוז לגלוקוז. קרי את התגובה לפחות בשני עותקים.
3. דגירה תערובת התגובה על 40 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בתוך גוש חימום. לעצור את התגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתוך גוש חימום. מצננים את תערובת התגובה על ידי אחסונם על הקרח לסובב את המים מרוכז על ידי צנטריפוגה ב 13.000 גרם ל 10 דקות ב 4 ° C.
4. לחשבון ה-pH ואת הטמפרטורה תלויה המחשוף של סוכרוז לגלוקוז, לבצע את ערך ריק באמצעות מים 20 deionized μL במקום 20 מדגם μL.
5. כדי להסביר את רמת הסוכר השיורי במרק התרבות, לבצע ביקורת שלילית על מדגם זה. לזה μL שימוש 20 סוף המדגם להשבית β-fructofuranosidase על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני הוספת סוכרוז דגירה כפי שמתואר בשלב 4.3.
6. לדלל את דגימות כזה כי את MEAs הבאיםured ספיחה הוא בטווח ערך מכויל.
7. לבצע את כל מבחני אנזימטיות בשלושה העתקים. החל 2 מדגם בדילול מלא μL בצלחת titer מיקרו היטב. החל מגוון תקן כיול על צלחת titer מיקרו ידי כל משתמש 2 μL עשרה פתרונות גלוקוז עם עשרה ריכוזים יודעים שונים (מ 1 מ"מ עד 15 מ"מ) במקום מדגם 2 μL. עבור כיול נקודת האפס להשתמש במים 2 deionized μL במקום 2 מדגם μL.
8. הוספת 200 μL של הפתרון מגיב היטב כל באמצעות פיפטה רב.
9. דגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
10. אחסן את הצלחת titer מיקרו ב 6 ° C עד המדידה (כמה שעות לכל היותר).
11. מדידת הבליעה ב -450 ננומטר באמצעות 96-Sunrise גם קורא מיקרו הצלחת התוכנה נתונים מגלן אחזור. קבע את הזמן ערבוב עד 5 שניות. והשאר לתקופה של עד 1 שניות.
12. פתח את טבלת התוצאה עם גיליון אלקטרוני ולבנות קו כיול באמצעות מגוון רגילה:
    glucose ריכוז = X קליטה + ב
    
13. חשב את הפעילות:
    פעילות = (קליטה X גורם לדילול ערך אפס) X + b
    
14. להבין את הפעילות β-fructofuranosidase על ידי חישוב ההפרש בין פעילות המדגם שליטה שליליות מתאימות.
15. חשב את התפוקה ספציפי לשימוש על ידי הבאה תוך משקל חשבון ביומסה יבשה β-fructofuranosidase פעילות ^11.

5. מיקרוסקופ ניתוח תמונה אוטומטי לאחר 72 שעות של טיפוח

1. סביב מקום 3 מ"ל תרבות ההשעיה בצלחת פטרי פלסטיקלדלל אותם עם תמיסה פיזיולוגית נתרן כלורי עד מבנים מורפולוגיים מופרדים.
2. למקם את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ, אילו תכונות מצלמה משולבת או מחובר. להשיג ולשמור על 100 תמונות (איור 2) של מבנים מורפולוגיים לפי המדגם. שימו לב כי על כל תמונה אחת לפחות האובייקט בתמונה לגמרי.
3. פתח את כל התמונות של מדגם זהה עם תוכנית עיבוד תמונה ImageJ ^12. להמיר את התמונות בשחור לבן על ידי שימוש באפשרות תהליך "הפוך בינארי" (איור 2). להחלת הפקודה לסדרה שלמה של תמונות להשתמש בקוד המאקרו כדלקמן.
   לרוץ (,, הפוך את בינארי ")
   
4. פתח את התמונות בינאריים מעובדים עם ImageJ שוב. חישוב קוטר גורמים צורה של Feret, באזור המוקרן, המערכת, המעגליות, יחס גובה, und עגלגלות מוצקות על כל תמונה עם "ערכת מדידה" לנתח את הכלי. להחלת הפקודה סריES של תמונות להשתמש בקוד המאקרו כדלקמן.
   להפעיל ("8-bit");
   להפעיל ("הפוך בינארי");
   להפעיל ("סולם סט ...", "מרחק = X הידוע = 1000 פיקסל = 1 יחידה = מיקרומטר העולמי");
   להפעיל ("המדידות הגדר ...", "תצוגת מגבלת שטח המערכת הצורה של feret redirect = העשרונית אף = 3");
   להפעיל ("ניתוח חלקיקים ...", "size = 10000-Infinity מעגליות = 0.00-1.00 = הצג מתווה התצוגה");
   לקבוע X כמספר הפיקסלים אשר וקושרת ב -1000 מיקרומטר על ידי בניית קו ישר על הבר מידה. לתאם את מספר הפיקסלים של קו ישר באורך של פס בקנה מידה מיקרומטר.
5. פתח את טבלת התוצאה המכיל גורם ערכי הצורה עבור כל תמונה עם גיליון אלקטרוני. חישוב מספר מורפולוגיה באופן הבא עבור כל תמונה.
   
6. כלומר לחשב ערך סטיית התקן של מספר מורפולוגיה לקחת בחשבון את כל התמונות של מדגם 1. השתמש גרפים וניתוח נתונים עבור תוכנית מתאם גרפי של מספר מורפולוגיה עם תפוקה מסוימת ולקבוע את הקשר המתמטי של רגרסיה מתמטית.

6. נציג תוצאות

באמצעות תוספת של טלק מיקרו חלקיקים א ניז'ר ​​SKAn 1015 המורפולוגיה היא שונה מורפולוגיה גלולה נאמן מורפולוגיה מפוזרים או mycelial אפילו. בעוד מורפולוגיה גלולה מוצג בתנאים סטנדרטיים מורפולוגיה mycelial נוצר על ידי תוספת של המדיום עם 10 גר '/ ל' של חלקיקי טלק מיקרו (איור 4.). במקביל לפעילות של fructofuranosidase-β עולה סביב ^03-05 מרס קיפול. תוספת של 1 או 3 גר '/ ל' של אבקת טלק מוביל מורפולוגיה התפזרו, עם פעילות fructofuranosidase הוכפל (איור 4.).

מורפולוגיה החלקיקים מיקרו תלויה ניתן לתאר באופן מקיף על ידי מורphology מספר אשר ניתן לחשב באמצעות פרמטרים שנקבעו על ידי ניתוח התמונה אוטומטית. כדורי עגול לגמרי וחלק יהיה ב תמונות מיקרוסקופיות מופיעים עיגולים מושלמים. עבור חלקיקים כאלה מספר מורפולוגיה יש ערך של 1. שבר הקטן ביותר של מורפולוגיה mycelial ניתן לפשט כקו חד ממדית מניב מספר מורפולוגיה של 0. כל צורות מורפולוגיות ביניים כמו כדורי סדיר או גושים מאורכים יהיה ולכן יש ערכים בין 0 ל -1. חלקיקים גדולים יחסית תגרום, חלקיקים גבוהים פטריות עם משטח גדול או חלקיקים מאורכים, במספר מורפולוגיה נמוכה ולא ^11.

בתנאים סטנדרטיים מורפולוגיה בכור 1 מוצגים מספר מורפולוגיה סביב 0.8. מורפולוגיה בכור 4 עם 10 גר '/ ל' אבקת טלק תכונות Mn סביב 0.1. מספר מורפולוגיה של כורים 2 ו -3, עם ריכוזים אבקת טלק של 1 ו - 3 גר '/ ל', הנמצא בין הקצוות הללו, הוכחת morpho התפזרומשעמם. מאז מורפולוגיה החלקיקים מיקרו תלויה קשורה קשר הדוק עם פרודוקטיביות β-fructofuranosidase, קשר מתמטי של מספר מורפולוגיה ופרודוקטיביות דומה איור 5 מתקבל.

באיור 1. תוכנית כוללת של עיצוב ניסיוני ההליך הטיפולי. א ניז'ר ​​מעובד (עם או בלי חלקיקים זעירים) ב L 3 עוררה bioreactor טנק של 72 שעות. לאחר 24, 48 ו - 72 מדגם חה נלקח לקביעת משקל ביומסה יבשה β-fructofuranosidase הפעילות, אשר שוב משמשים לחישוב יעילות מסוימת. לאחר 48 שעות מורפולוגיה פטרייתי נבדק על ידי מיקרוסקופ ומאופיינת על ידי ניתוח תמונה דיגיטלית. הפרמטרים הרלוונטיים של ניתוח התמונה משולבים למספר מורפולוגיה, שהיא מתמטית בקורלציה עם יעילות מסוימת.

איור 2. שלבים של עיבוד תמונה עבור מיקרוסקופית שנוצר תמונות של מבנים מורפולוגיים של א ' ניז'ר. שלב 1: רכישת התמונה של מיקרוסקופ. שלב 2: שיפור התמונה במידת הצורך. שלב 3: binarization תמונה, שחור ולבן (בינארי) התמונה שנוצר ImageJ. שלב 4: תמונה בינארית מעובד על ידי והאובייקט לא רצוי נמחקים. שלב 5: ניתוח מורפולוגי מתבצע באמצעות הפונקציה "ניתוח חלקיקים" של התוכנית קוד פתוח ImageJ.

איור 3. צורות מורפולוגיות שונות של א ' תלוי בריכוז של חלקיקים זעירים מוסף ניז'ר. עם ריכוז גדל והולך של מיקרו חלקיקים הוסיף בגודל גלולה יכולה להיות ירידה דווקא אל הליבה מעטפת כדוריות קטנות, להקות קטנות תפטיר אפילו התפזרו באופן חופשי. מורפולוגיה של הנדסה כמוpergillus ניז'ר ​​SKAn1015 ע"י תוספת חלקיקים מיקרו בתרבות מתחת למים. ללא microparticles (א), 10 מ"ג / ל '(ב'), 0.1 גר '/ ל' (ג), 0.2 גר '/ ל' (ד '), 0.3 גר' / ל '(ה), 0.6 גר' / ל '(F), 1.0 גר' / ל ' (ז), 1.5 גר '/ ל' (ע), 2.0 גר '/ ל' (אני), 2.5 גר '/ ל' (J), 3.0 גר '/ ל' (K), 3.5 גר '/ ל' (ל '), 4.0 גר' / ל '(M ), 4.5 גר '/ ל' (N), 5.0 גר '/ ל' (O), 10 גר '/ ל' (P), 15 גר '/ ל' (Q), 20 גר '/ ל' (R), 30 גר '/ ל' (S) 40-50 גר '/ ל' (ט). התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופ אור לאחר 72 שעות של טיפוח.

איור 4. פעילות Fructofuranosidase ב התלות של טלק החלקיקים מיקרו ריכוז 1 גר '/ ל' (כור 2), 3 גר '/ ל' (בכור 3) ו - 10 גר '/ ל' (הכור 4). הכור 1 לא השלימו עם חלקיקים זעירים, כאן הטיפוח מתבצע בתנאים רגילים.

איור 5. קורלציה טובה נציג (R ² = 0.91) של מורפולוגיהמספר יעילות מסוימת. מספר מורפולוגיה הוא זמם (abscissa) נגד הפרודוקטיביות ספציפי (לתאם). רגרסיה ליניארית מניב קשר מעריכי.

Discussion

שינוי של מורפולוגיה פטרייתי כבר עניין בביוטכנולוגיה מאז עשרות שנים. מחקרים שונים ניסו לשנות פרמטרים של התהליך נבחרה כגון ערך ה-pH, כניסת חשמל, טמפרטורה, חומרי מזון בינוני או ריכוז הבידוד ^1, אבל סובלים שליטה מדויקת למדי שלם של מורפולוגיה, עלויות האנרגיה הגבוהות, אפקטים עיכוב או חוסר יציבות המוצר, לעומת זאת, תוספת של חלקיקי מיקרו מאפשר הנדסה מדויקת של מורפולוגיה פטרייתי דרך וריאציה מכויל של גודל החלקיקים וריכוז. זה פותח אפשרויות חדשות לשימוש חלקיקי מיקרו לצורך מיטוב לעיצוב תפורים המורפולוגיה לייצור גבוה הייצור הביוטכנולוגי עם א ' ניז'ר ​​ו פילמנטיות מיקרואורגניזמים אחרים.

ניתוח תמונה דיגיטלית היא שיטה לשחזור קל לאפיין את המורפולוגיה מאקרו פטרייתי. עם זאת, מגוון רחב של פרמטרים המאפיינים, גודל, צורה השטחטר של מבנים מורפולוגיים המתואר בספרות עושה הערכה מהירה של מורפולוגיה פטרייתי מסובך. מספר מורפולוגיה הציג כשילוב של הפרמטרים הרלוונטיים, ימנע חוסר זה והוא יכול לשמש לא רק אפיון מקיף של מבנים מורפולוגיים, אלא גם קשר מתמטי ישיר עם פרודוקטיביות. זה שוב הופך את הערכת היעילות של מורפולוגיה נתון ולכן התאמה אישית של המורפולוגיה של התהליך צריך האפשר.

משתמש מספר מורפולוגיה, ניתן להבחין בין גלולה שונים מורפולוגיות גוש ^4.5. להמשך פיתוח של מספר מורפולוגיה תמורת מימד פרקטלית נראה מבטיח. מימד פרקטלית נותנת מדידה מורכבות ומסה מילוי המאפיינים של האובייקט ¹³ והוא predestinated ולכן לאפיון הוליסטי של מורפולוגיה mycelial.

CReation המורפולוגיה גבוהה mycelial לייצור, לעומת זאת, עלול לגרום בעיות עם הביצועים תהליך במיוחד לגידול בקנה מידה גדול, כי צורת הגידול mycelial הוכח בעבר להפגין הרבה יותר מרק viscosities תרבות ^2. זה מוביל בעיות עם מעבר חום ומסה היווצרות של מים עומדים באזורים שאינם מעורבים, אשר דורשים תשומת חשמל גבוה ולעשות טיפוח יקר יותר להפעיל ^1. לכן הקשר בין המורפולוגיה פטריות מרק צמיגות התרבות יש לשקול בעת שינוי המורפולוגיה להיות משולב בדגמים נוספים.