Anpassning av Aspergillus niger Morfologi genom tillsats av talk mikropartiklar

Summary

En metod för att exakt generera och att fullständigt karaktärisera morfologi av fintrådiga svamp

Abstract

Den filamentösa svampen A. niger är en allmänt använd stam i ett brett spektrum av industriella processer från mat till läkemedelsindustrin. En av de mest spännande och ofta okontrollerbara egenskaperna hos denna fintrådiga organism är dess komplex morfologi. Den sträcker sig från täta sfäriska pellets för viskösa mycel (figur 1). Olika processparametrar och ingredienser är kända för att påverka svamp morfologi ^1. Eftersom optimal produktivitet korrelerar starkt med en viss morfologisk form, representerar svamp morfologin ofta flaskhalsen produktiviteten i industriell produktion.

En rakt fram och elegant sätt att exakt kontrollera morfologisk form är tillsatsen av oorganiska olösliga mikropartiklar (t.ex. vattenhaltigt magnesium-silikat, aluminiumoxid eller titan-silikat-oxid) till odlingsmediet som bidrar till ökad enzymproduktion ^2-6. Eftersom det finns en obvious samband mellan mikro partikel beroende morfologi och enzymproduktion det är önskvärt att matematiskt länka produktivitet och morfologiska utseende. Därför är en kvantitativ exakt och helhetssyn morfologiska beskrivningen är riktad.

Därför presenterar vi en metod för att generera och karaktärisera mikro partiklar beroende morfologiska strukturer och att korrelera svamp morfologi med produktivitet (figur 1) som möjligen bidrar till en bättre förståelse för morfogenes av trådformiga mikroorganismer.

Den rekombinanta stammen A. niger SKAn1015 odlas i 72 timmar i en 3 L omrörd tank bioreaktor. Genom tillsats av talk mikropartiklar i koncentrationer av 1 g / I, 3 g / L och 10 g / L innan inokulering en mängd av morfologiska strukturer är reproducerbart genereras. Sterila prover tas efter 24, 48 och 72 timmar för bestämning av tillväxt framsteg och aktivitet producerade enzymet. Denbildade produkten är värdefulla enzym β-fruktofuranosidaset, en viktig biokatalysator för neo-socker-bildning i livsmedel eller farmaceutiska industrin, som katalyserar bl reaktionen av sackaros till glukos ^7-9. Därför medför kvantifiering av glukos efter tillsats av sackaros mängden producerad β-fruktofuranosidaset. Glukos kvantifiering görs genom ett GOD / POD-analys ^10, som är modifierad för hög genomströmning analys i 96-brunnars mikro titerplattor.

Svamp morfologi efter 72 timmar undersöks i mikroskop och kännetecknas av digital bildanalys. På så sätt är partiklar formfaktorer för svamp makro morfologi som Feret diameter, projicerade area, omkrets, cirkularitet, bildförhållande, rundhet und soliditet beräknas med öppen källkod bildbehandlingsprogram ImageJ. Relevanta parametrar kombineras till en dimensionslös Morfologi antal (Mn) ^11, vilket möjliggör en fullständig karakterisering avsvamp morfologi. Det nära sambandet mellan morfologi antalet och produktivitet är markerade genom matematisk regression.

Protocol

1. Reaktor Setup och start av odling

4 bioreaktor odlingar totalt genomförs.

1. Använda en 3 L omrörd tank bioreaktor med en arbetsvolym av 2,2 L för odling av A. niger SKAn1015.
2. Häll 72,6 g glukos monohydrat in i reaktorn och fyll upp med 1,9 L avjoniserat vatten.
3. Installera reaktorn utrustning såsom 3 bafflar, en två sex blad disk turbinomrörare, en pH-elektrod, en gasinlopp med luft filter, ett kyl-finger, ett avgassystem luftkylare med luft filter, en nedsänkning rör för steril provtagning med luftfilter och inlopp slangar för medium, inokulat, syra och bas.
4. Autoklavera i reaktorn vid 121 ° C under 20 minuter.
5. Ansluta reaktorn med syra-bas-reservoar (2 M HCl, 2 M NaOH) och de motsvarande pumpar och ställa in ett pH-värde av 5,0 ± 0,05 med det pH-reglerande enhet.
6. Länka reaktorn med kylvatten system och sätta värmemantelnrunt i reaktorkärlet.
7. Installera temperatursensor med motsvarande styrenhet och inrättat en temperatur av 37 ± 0,1 ° C vid den temperatur styrenheten.
8. Montera agitation motorn ovanpå av reaktorn och ta i drift med en omrörningshastighet på 200 min ^-1.
9. Tillsätt sterilt minimala tillväxtmediet ¹¹ tråg en av de sterila tilloppsslangar (250 ml). För mediet framställning alla komponenter autoklaverades vid 121 ° C under 20 min och blandades samman. Under tre odlingar komponenterna innefattar talkpulver (3MgO • 4SiO ₂ • _H2O) i koncentrationer av 1 g / L (reaktor 2), 3 g / L (reaktor 3) och 10 g / L (reaktor 4). Före användning, återsuspendera mikropartiklar i 50 mM natriumacetat (pH 6,5) och lägga till det sterila mediet. I kontrollkulturer (utan partiklar) ersätta mikro partikelsuspensionen av 50 mM natriumacetatbuffert (pH 6,5).
10. Lägg till sporsuspensionen (inokulat) ens upprättats i Wucherpfennig et. fl (2011) ¹¹ tråg en av de sterila tilloppsslangar (50 ml) så att koncentrationen av sporer uppgår till 1X10 ⁶ ml ^-1. Den ympning markerar starten för odling (h = 0 h).
11. Starta luftning med en hastighet av 1,0 L min ^-1.

2. Steril Provtagning efter 24, 48 och 72 timmar av odling

1. Ta 50 ml steril odlingsbuljong i ett flacon rör.
2. Använd prov för bestämning av biomassa torrvikt, β-fruktofuranosidaset aktivitet och mikroskopisk analys.

3. Fastställande av biomassa Torrvikt efter 24, 48 och 72 timmar av odling

1. Biomassa prover skall tas minst två gånger.
2. Vikt ett cellulosa filter med en mikronivå efter torkning i exsickator och placera filtret i en Buchnertratt med ansluten vatten-jet vakuumpump.
3. Filtrera en definierad volym prov (t.ex. 10 ml) ennd skölj filtret med 10 ml avjoniserat vatten för att avlägsna mediet föreningar från biomassan.
4. Wrinkle filtret en gång i mitten, placera den i ett glas Petri-skål och lägg den i ett fack tork tills vikten konstant (minst 24 h).
5. Svalna filtret i en exsickator och mäta vikten.
6. Beräkna biomassa torrvikt som skillnaden mellan vikten av filtret med och utan torkade biomassan dividerat med det prov som används volym.

4. Bestämning av den extracellulära enzymatiska aktiviteten av β-fruktofuranosidaset som GOD / POD-essä efter 24, 48 och 72 h av odling

Förvara proverna på is hela tiden medan du arbetar med dem.

1. Filter 1,5 ml kultur suspensionen tråg ett cellulosaacetatfilter genom att trycka på kulturen suspensionen med en spruta genom filtret in i ett reaktionsrör. Lagra reaktionsrör vid -20 ° C tills användning.
2. För reaktionsblandningen använda 20il prov och tillsätt 200 | il av 1,65 M sackaros löst i 0,05 M fosfatbuffert (pH 5,4) för att initiera reaktionen av sackaros till glukos. Cary ut reaktionen minst två gånger.
3. Inkubera reaktionsblandningen vid 40 ° C under 20 min i ett värmeblock. Stoppa reaktionen genom inkubering vid 95 ° C under 10 min i ett värmeblock. Kyl reaktionsblandningen genom att lagra den på is och centrifugera ner det kondenserade vattnet genom centrifugering vid 13,000 g under 10 min vid 4 ° C.
4. Att redovisa pH och temperatur beroende klyvning av sackaros till glukos, genomföra ett tomt värde genom att använda 20 xl avjoniserat vatten i stället för 20 pl prov.
5. För att kompensera för kvarvarande glukos i odlingsmediet, utföra en negativ kontroll för varje prov. För detta ändamål används 20 | il av provet och inaktivera β-fruktofuranosidaset genom upphettning vid 95 ° C under 10 min före tillsätt sackaros och inkuberas såsom beskrivits i steg 4.3.
6. Späda proven så att följande åtgärmätt adsorption är i det kalibrerade värdet intervallet.
7. Utför alla enzymatiska analyser i tre exemplar. Applicera 2 pl utspätt prov i en mikrotiterplatta väl. Applicera ett standardsortiment för kalibrering på mikrotiterplatta av varje med 2 pl tio glukoslösningar med tio olika know koncentrationer (från 1 mm till 15 mm) istället för 2 pl prov. För nollpunktskalibrering använda 2 pl avjoniserat vatten istället för 2 pl prov.
8. Tillsätt 200 pl av reagenslösningen till varje brunn genom användning av en multi-pipett.
9. Inkubera blandningen under 10 min vid rumstemperatur.
10. Lagra mikrotiterplatta vid 6 ° C tills mätning (några timmar som mest).
11. Mät absorptionen vid 450 nm med en 96-håls Sunrise mikro plattläsare och Magellan datahämtning programvara. Ställa in blandningstiden upp till 5 sek. och resten perioden fram till 1 sek.
12. Öppna resultatet sjökortet med ett kalkylprogram och konstruera en kalibreringskurva genom att använda standardsortiment:
    glucose koncentration = ett X absorption + b
    
13. Beräkna aktivitet:
    aktivitet = (absorption X spädningsfaktor-tomt värde) X A + B
    
14. Räkna ut β-fruktofuranosidaset aktiviteten genom att beräkna skillnaden mellan verksamhet provet och lämplig negativ kontroll.
15. Beräkna den specifika produktiviteten för följande användning genom att ta hänsyn biomassa torrvikt och β-fruktofuranosidaset aktivitet ^11.

5. Mikroskopi och automatiserad bildanalys efter 72 h odling

1. Plats runt 3 ml kultur suspension i en petriskål av plast ochspäda dem med fysiologisk natriumkloridlösning tills de morfologiska strukturerna är separerade.
2. Placera petriskålens under ett mikroskop, som har en inbyggd eller ansluten kamera. Skaffa och spara ca 100 bilder (figur 2) av morfologiska strukturer per prov. Var uppmärksam att på varje bild åtminstone ett objekt helt på bilden.
3. Öppna alla bilder av samma prov med bildbehandlingsprogram ImageJ ^12. Konvertera bilder till svartvitt med hjälp av processverktyg "Make Binär" (figur 2). För applicering av kommandot till hela serien av bilder använder en makrokod enligt följande.
   kör (,, Make Binary ")
   
4. Öppna de bearbetade binära bilder med ImageJ igen. Beräkna formfaktorer Feret diameter, projicerade area, omkrets, cirkularitet, bildförhållande, rundhet und soliditet för varje bild med analysverktyg "Set Measurement". För applicering av kommandot en series av bilder använder en makrokod enligt följande.
   springa ("8-bitars");
   kör ("Gör Binary");
   kör ("Set Skala ...", "avstånd = X känt = 1000 pixel = 1 enhet = m global");
   kör ("Set Mått ...", "området omkrets formen Feret s gräns display omdirigera = Ingen decimal = 3");
   kör ("analysera partiklar ...", "size = 10 tusen-Infinity cirkularitet = 0,00-1,00 show = konturer display");
   Bestäm X som antalet pixlar som korrelerar till 1000 m genom att bygga en rak linje över en skala bar. Korrelera antalet pixlar i rät linje med längden av Skalstrecket i | im.
5. Öppna resultatet diagrammet som innehåller värden formfaktor för varje bild med ett kalkylblad. Beräkna en Morfologi antal som följer för varje bild.
   
6. Beräkna medelvärde och standardavvikelse för morfologi antalet med hänsyn till alla bilder på ett prov. Använd en grafritande och dataanalys program för grafisk korrelation av morfologin nummer med den specifika produktiviteten och bestämma den matematiska samband genom matematisk regression.

6. Representativa resultat

Genom tillsats av talk mikropartiklar A. niger Skan 1015 morfologi ändras från en sann pelleten morfologi till en dispergerad eller till och med mycel morfologi. Medan pellets morfologi ut på standardförhållanden ett mycel morfologi skapas genom komplettering av medium med 10 g / L talk mikropartiklar (Figur 4.). Samtidigt aktiviteten hos β-fruktofuranosidaset ökar runt 3 gånger ^3-5. En komplettering av 1 eller 3 g / L av talkpuder leder till en dispergerad morfologi, med en fördubblad fruktofuranosidaset aktivitet (Figur 4.).

Mikro partikel beroende morfologi kan övergripande beskrivas med Morphology antal som kan beräknas med hjälp av parametrar som bestäms av automatisk bildanalys. Perfekt runda och släta pellets kommer i mikroskopiska bilder visas som perfekta cirklar. För sådana partiklar morfologin antal har ett värde av 1. Det minsta fragmentet av mycel morfologi kan förenklas som en endimensionell linje vilket gav en morfologi antal 0. Alla mellanliggande morfologiska former som avlånga oregelbundna pellets eller klumpar kommer därför att ha värden mellan 0 och 1. Ganska stora partiklar kommer att resultera i en hög, svamp partiklar med en stor yta eller långsträckta partiklar, i ett ganska lågt Morfologi nummer ^11.

Vid normala förhållanden morfologi i reaktor 1 uppvisar en morfologi nummer omkring 0,8. Morfologin i reaktorn 4 med 10 g / L talkpulver har en Mn omkring 0,1. Morfologin nummer för reaktorerna 2 och 3, med talkpuder koncentrationer av 1 och 3 g / L, ligger mellan dessa ytterligheter, visar en spridd morphonik. Eftersom mikro partikel beroende morfologi är nära besläktad med β-fruktofuranosidaset produktivitet, en matematisk korrelation av Morfologi antal och produktivitet som liknar figur 5 erhålls.

Figur 1. Övergripande syftet med experimentell design och den analytiska proceduren. A. niger odlas (med eller utan mikropartiklar) i en 3 liters omrörd tank bioreaktor under 72 timmar. Efter 24, 48 och 72 hektar prov för bestämning av biomassa torrvikt och β-fruktofuranosidaset aktivitet som återigen används för beräkning av den specifika produktiviteten. Efter 48 h svampens morfologi undersöktes med mikroskop och karakteriserades genom bildanalys. Relevanta parametrarna för bildanalys kombineras till en morfologi antal, som är matematiskt korrelerat med den specifika produktiviteten.

Figur 2. Steg bildbehandling för mikroskopisk-genererade bilder av morfologiska strukturer från A. niger. Steg 1: image förvärv av mikroskop. Steg 2: bildförbättring om det behövs. Steg 3: image binäriseringsprocess, svart-vit (binär) bild genereras i ImageJ. Steg 4: den binära bilden behandlas av och oönskade föremål rensas. Steg 5: morfologisk analys utförs med "analysera partiklar" funktion open source program ImageJ.

Figur 3. Olika morfologiska former av A. niger beroende av koncentrationen av tillsatta mikropartiklar. Med ökande koncentration av mikropartiklar till pelleten storleken exakt kan minskas ner till liten kärna och skal pellets, små flockar och även fritt spridda mycel. Morfologi konstruktion av Sompergillus niger SKAn1015 av Micro partikel tillskott i nedsänkt kultur. Utan mikropartiklar (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / l (n), 5,0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) och 40-50 g / L (t). Bilder tagna av ljusmikroskop efter 72 h odling.

Figur 4. Fruktofuranosidaset aktivitet i beroende av talk mikro partikelkoncentration 1 g / L (reaktor 2), 3 g / L (reaktor 3) och 10 g / L (reaktor 4). Reaktorn 1 är inte kompletterat med mikropartiklar, här odling utförs under standardbetingelser.

Figur 5. Representativa god korrelation (R = ² 0,91) av MorfologiAntalet och den specifika produktiviteten. Morfologin antal plottas (abskissa) mot den specifika produktiviteten (ordinata). Icke-linjär regression ger den exponentiella korrelation.

Discussion

Ändringen av svamp morfologi har varit av intresse för bioteknik sedan många decennier. Olika studier har försökt att variera valda processparametrar såsom pH-värde, ineffekt, temperatur, näringsämnen mediet eller inokulum koncentration ^1, men lider av ganska inexakt och ofullständig kontroll av morfologin, höga energikostnader, effekter hämning eller produkten instabilitet, I motsats härtill att tillskott av mikropartiklar tillåter en exakt konstruktion av svamp morfologi genom finjusteras variation av partikelstorlek och koncentration. Detta öppnar nya möjligheter att använda mikropartiklar för optimering och skräddarsydda design av högproducerande morfologi i bioteknisk produktion med A. niger och andra fintrådiga mikroorganismer.

Den digitala bildanalys är en enkel reproducerbar metod för att karaktärisera svamp macro morfologi. Emellertid den mängd parametrar för storlek, form och yta egenskater av morfologiska strukturer som beskrivs i litteraturen gör snabb bedömning av svamp komplicerad morfologi. Den presenterade Morfologi tal som en kombination av relevanta parametrar, undviker denna brist och kan användas inte bara för omfattande karakterisering av morfologiska strukturer, utan också för direkt matematisk korrelation med produktivitet. Detta gör återigen en uppskattning av produktiviteten genom att ges morfologi och därmed en anpassning av morfologi för processen måste möjligt.

Med hjälp av morfologi numret, är det möjligt att skilja mellan olika pellets och morfologier klumpa ^4,5. För vidareutveckling av morfologin numret behandlingen av fraktala dimensionen verkar vara lovande. En fraktal dimension ger ett mått på komplexiteten och massa fylla egenskaperna för ett objekt ¹³ och är därför förutbestämt för holistisk karakterisering av mycel morfologi.

CReation av en hög producerande mycel morfologi, kan dock leda till problem med processernas prestanda, särskilt i stor skala odling, eftersom myceltillväxten formen har tidigare visat sig uppvisa mycket större kulturbuljong viskositeter ^2. Detta leder till problem med värme och masstransport och bildande av stillastående icke blandade områden, som kräver en högre ineffekt och göra odlingen dyrare att driva ^1. Därför förhållandet mellan svamp morfologi och kultur buljongen viskositet bör beaktas vid byte av morfologi och införlivas i ytterligare modeller.