Personnalisation des Aspergillus Niger Morphologie par addition de micro-particules de talc

Summary

Une méthode pour générer et précisément à leur morphologie globale du champignon filamenteux

Abstract

Le champignon filamenteux A. Niger est une souche largement utilisés dans un large éventail de procédés industriels de l'alimentation à l'industrie pharmaceutique. Une des caractéristiques les plus fascinantes et souvent incontrôlables de cet organisme filamenteux est sa morphologie complexe. Il va de granules sphériques denses à visqueux mycélium (Figure 1). Différents paramètres du procédé et les ingrédients sont connus pour influencer la morphologie fongique ^1. Depuis une productivité optimale est fortement corrélé avec une forme morphologique spécifique, la morphologie fongique représente souvent le goulot d'étranglement de la productivité dans la production industrielle.

Une démarche simple et élégant pour contrôler avec précision la forme morphologique est l'ajout d'inorganiques insolubles micro particules (comme silicate de magnésium hydraté, d'oxyde d'aluminium ou d'oxyde de titane de silicate) à milieu de culture contribuant à la production d'enzymes augmenté ^2-6. Comme il ya une OBVcorrélation entre la morphologie des particules ious micro dépendante et la production d'enzymes, il est souhaitable de lier mathématiquement la productivité et l'aspect morphologique. Par conséquent, une description précise et quantitative globale morphologique est ciblé.

Ainsi, nous présentons une méthode pour générer et caractériser des micro particules dépendantes des structures morphologiques et de corréler la morphologie fongique de la productivité (Figure 1) qui contribue éventuellement à une meilleure compréhension de la morphogenèse des micro-organismes filamenteux.

La souche recombinante A. Niger SKAn1015 est cultivé pendant 72 h dans un bioréacteur agité de 3 L du réservoir. Par addition de micro-particules de talc à des concentrations de 1 g / L, 3 g / L et 10 g / L avant l'inoculation une variété de structures morphologiques est reproductible généré. Échantillons stériles sont prises après les heures de 24, 48 et 72 pour la détermination des progrès accomplis croissance et l'activité de l'enzyme produite. Laproduit formé est l'enzyme de grande valeur β-fructofurannosidase, un biocatalyseur important pour néo-sucre dans la formation industrie alimentaire ou pharmaceutique, qui catalyse la réaction entre autres de saccharose au glucose ^7-9. Par conséquent, la quantification du glucose après addition de saccharose implique la quantité de β-fructofuranosidase produit. La quantification du glucose se fait par un Dieu / POD-test ^10, qui est modifiée pour analyse à haut débit dans des plaques de titrage à 96 puits micro.

Morphologie fongique après 72 heures est examiné au microscope et caractérisé par analyse d'image numérique. Ce faisant, les facteurs de forme des particules de morphologie macro fongique comme diamètre Féret, surface projetée, le périmètre, la circularité, ratio d'aspect, la solidité und rondeur sont calculées avec le open source de traitement d'image ImageJ programme. Les paramètres pertinents sont combinés à un certain nombre sans dimension Morphologie (Mn) ^11, qui permet une caractérisation complète desmorphologie fongique. La corrélation étroite entre le nombre Morphologie et la productivité sont mis en évidence par la régression mathématique.

Protocol

1. Configuration du réacteur et de démarrage de la culture du

4 cultures bioréacteurs au total sont effectuées.

1. Utilisation d'un bioréacteur 3 L réservoir agité avec un volume de travail de 2,2 L à la culture de A. Niger SKAn1015.
2. Verser 72,6 g de glucose monohydraté dans le réacteur et le remplir avec 1,9 L d'eau déminéralisée.
3. Installez l'équipement réacteur tel que 3 chicanes, deux à six pales turbine de disque, une électrode de pH, une entrée de gaz avec filtre à air, un doigt de refroidissement, un refroidisseur d'air d'échappement avec filtre à air, un tube plongeur pour l'échantillonnage stérile avec filtre à air les tuyaux d'arrivée et de support, l'inoculum, l'acide et la base.
4. Autoclaver le réacteur à 121 ° C pendant 20 min.
5. Connecter le réacteur avec le réservoir d'acide-base (2 M de HCl, 2 M de NaOH) et les pompes correspondantes et mettre en place une valeur de pH de 5,0 ± 0,05 avec l'unité de contrôle du pH.
6. Relier le réacteur avec le système de refroidissement à eau et mis l'enveloppe chauffanteautour de la cuve du réacteur.
7. Installez le capteur de température avec l'unité de commande correspondant et mettre en place une température de 37 ± 0,1 ° C à l'unité de contrôle de température.
8. Appliquer le moteur d'agitation au-dessus du réacteur et la mettre en service avec une vitesse d'agitation de 200 min ^-1.
9. Ajouter le milieu stérile minimale croissance de ¹¹ creux l'un des tuyaux d'arrivée d'stériles (250 ml). Pour la préparation de tous les composants ont été moyennes en autoclave à 121 ° C pendant 20 min et mélangés. Pour trois cultures les composants comprennent le talc en poudre (3MgO • ₂ • 4SiO H ₂ O) dans les concentrations de 1 g / L (réacteur 2), 3 g / L (réacteur 3) et 10 g / L (réacteur 4). Avant d'utiliser, de remettre en suspension les micro-particules dans 50 mM de tampon acétate de sodium (pH 6,5) et l'ajouter dans le milieu stérile. Dans les cultures de contrôle (sans particules) remplacer la suspension de particules micro de 50 mM de tampon acétate de sodium (pH 6,5).
10. Ajouter la suspension de spores (inoculum) uns établi en Wucherpfennig et. Al (2011) ¹¹ auge un des tuyaux d'entrée stérile (50 ml) de sorte que la concentration de montants spores à 1X10 ⁶ ml ^-1. L'inoculation marque le début de la culture (h = 0 h).
11. Début de l'aération avec un taux de 1,0 L ^-1 min.

2. D'échantillonnage stériles après 24, 48 et 72 h de culture

1. Prendre 50 ml de bouillon de culture stérile dans un tube flacon.
2. Utilisez l'échantillon pour la détermination du poids de la biomasse sèche, β-fructofuranosidase activité et l'analyse microscopique.

3. Détermination du poids de la biomasse sèche après 24, 48 et 72 h de culture

1. Échantillons de biomasse sont à prendre au moins en double.
2. Un filtre en poids de cellulose avec une balance micro après séchage dans un dessiccateur et placer le filtre dans un entonnoir de Büchner avec pompe à vide connectée à jet d'eau.
3. Filtrer un volume d'échantillon défini (par exemple 10 ml) d'unee rincer le filtre avec de l'eau déminéralisée 10 ml pour éliminer les composés moyen de la biomasse.
4. Rides du filtre une fois dans le milieu, le placer dans un plat en verre de Petri et le mettre dans un sèche-compartiment jusqu'à constance de poids (au moins 24 h).
5. Refroidir le filtre dans un dessiccateur et de mesurer le poids.
6. Calculer le poids sec de la biomasse à la différence entre le poids du filtre avec et sans biomasse séchée divisé par le volume d'échantillon utilisé.

4. Détermination de l'activité enzymatique extracellulaire des β-fructofuranosidase par DIEU / POD-essai après 24, 48 et 72 h de culture

Conserver les échantillons sur glace en permanence tout en travaillant avec eux.

1. Filtre 1,5 ml suspension de culture auge un acétate de cellulose filtre en appuyant sur la suspension de la culture avec une seringue à travers le filtre dans un tube de réaction. Stocker le tube de réaction à -20 ° C jusqu'à son utilisation.
2. Pour le mélange réactionnel utiliser 20échantillon et ajouter 200 ul ul de 1,65 M de saccharose dissous dans du tampon phosphate 0,05 M (pH 5,4) pour initier la réaction à partir du saccharose en glucose. Cary la réaction au moins en double.
3. Incuber le mélange réactionnel à 40 ° C pendant 20 min dans un bloc de chauffage. Arrêter la réaction par incubation à 95 ° C pendant 10 min dans un bloc de chauffage. Refroidir le mélange réactionnel en le stockant sur la glace et centrifuger l'eau condensée par centrifugation à 13.000 g pendant 10 min à 4 ° C.
4. Afin de tenir compte du pH et le clivage dépendant de la température de saccharose en glucose, mener à bien une valeur vide à l'aide d'eau de 20 uL désionisée au lieu de 20 uL d'échantillon.
5. Pour tenir compte de glucose résiduel dans le bouillon de culture, effectuer un contrôle négatif pour chaque échantillon. Pour que l'utilisation finale 20 ul de l'échantillon et inactiver β-fructofuranosidase par chauffage à 95 ° C pendant 10 min avant d'ajouter du saccharose et incuber comme décrit dans l'étape 4.3.
6. Diluer les échantillons tels que les mesu suivantesURED d'adsorption est dans la plage de valeurs calibrées.
7. Effectuer tous les dosages enzymatiques, en trois exemplaires. Appliquer un échantillon de 2 ul dilué dans une plaque de titrage micro bien. Appliquer une gamme standard de calibrage sur la plaque de titrage par chaque micro utilisant 2 pi de dix solutions de glucose avec des concentrations dix découvrir différentes (de 1 mM à 15 mM) à la place de deux échantillons pL. Pour réglage du point zéro utiliser 2 pi d'eau déminéralisée au lieu de 2 ul d'échantillon.
8. Ajouter 200 ul de la solution de réactif dans chaque puits en utilisant une pipette multi.
9. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante.
10. Rangez la plaque de titrage micro à 6 ° C jusqu'à ce que la mesure (quelques heures tout au plus).
11. Mesurer l'absorption à 450 nm en utilisant un lecteur de 96 puits Sunrise plaque micro et le logiciel de récupération de données Magellan. Réglez le temps de mélange à 5 sec. et la période de repos jusqu'à 1 sec.
12. Ouvrir le tableau de résultat avec une feuille de calcul et de construire une courbe d'étalonnage en utilisant la gamme standard:
    glucose concentration = a + b X d'absorption
    
13. Calculer l'activité:
    = activité (absorption X facteur de dilution-valeur vide) X a + b
    
14. Figure de l'activité β-fructofuranosidase en calculant la différence entre les activités de l'échantillon et le contrôle négative appropriée.
15. Calculer la productivité spécifique pour l'utilisation suivante, en tenant compte du poids de la biomasse sèche et β-fructofuranosidase activité ^11.

5. Microscopie et analyse d'images automatisé après 72 h de culture

1. Lieu d'environ 3 ml de suspension de la culture dans un plat de Petri en plastique etles diluer avec une solution de chlorure de sodium physiologique jusqu'à ce que les structures morphologiques sont séparés.
2. Situer la boîte de Petri sous un microscope, qui dispose d'un appareil photo intégré ou connecté. Acquérir et économiser environ 100 images (Figure 2) des structures morphologiques par échantillon. Veillez à ce que sur chaque image au moins un objet est complètement représenté.
3. Ouvrez toutes les images d'un même échantillon avec le programme de traitement d'image ImageJ ^12. Convertir des images en noir et blanc en utilisant l'outil de processus "Faire binaire" (Figure 2). Pour l'application de la commande à toute la série d'images d'utiliser un code de macro comme suit.
   exécuter (,, Faire binaire ")
   
4. Ouvrez les images binaires transformés avec ImageJ nouveau. Calculer le diamètre de la forme facteurs Féret, surface projetée, le périmètre, la circularité, ratio d'aspect, la solidité und rondeur pour chaque image avec la "mesure Set" outil d'analyse. Pour l'application de la commande à un Series d'images utiliser un code de macro comme suit.
   run ("8-bit");
   exécuter («Faire binaire");
   run ("Scale Set ...", "distance = X connue = 1000 pixel = 1 unité = um mondiale");
   exécuter («Mesures Set ...», «limite d'affichage de zone de forme périmètre Féret rediriger décimal = Aucun = 3");
   exécuter («analyser les particules ...", "size = 10000-Infinity circularité = 0,00 à 1,00 show = Décrit affichage");
   Déterminer que X le nombre de pixels qui est corrélée à 1000 um, en construisant une ligne droite à travers une barre d'échelle. Corréler le nombre de pixels de la ligne droite avec la longueur de la barre d'échelle dans um.
5. Ouvrez le tableau résultat contient des valeurs de facteur de forme pour chaque image avec une feuille de calcul. Calculer un certain nombre Morphologie comme suit pour chaque image.
   
6. Calculer la valeur moyenne et écart-type pour le nombre Morphologie tenant compte de toutes les images d'un échantillon. Utilisez un graphique et d'analyse de données pour la corrélation graphique du nombre Morphologie avec la productivité spécifique et de déterminer la relation mathématique par régression mathématique.

6. Les résultats représentatifs

Grâce à plus de talc micro particules A. Niger SKAN 1015 morphologie est changé d'une morphologie vraie culot à une morphologie dispersée ou même du mycélium. Alors que la morphologie culot est exposé à des conditions normales une morphologie du mycélium est créé par la supplémentation du milieu avec 10 g / L de micro-particules de talc (Figure 4.). Parallèlement l'activité de β-fructofuranosidase augmente autour de ^3-5 mars fois. Un supplément de 1 ou 3 g / l de poudre de talc conduit à une morphologie dispersée, ayant une activité fructofurannosidase doublé (figure 4.).

La morphologie des particules micro dépendante peut être décrite de manière exhaustive par le Morphologie nombre qui peut être calculé en utilisant les paramètres déterminés par analyse d'image automatique. Granules parfaitement rondes et lisses seront en images microscopiques apparaissent comme des cercles parfaits. Pour de telles particules de morphologie le nombre a une valeur de 1. Le plus petit fragment de la morphologie du mycélium peut être simplifiée comme une ligne unidimensionnelle pour obtenir un nombre de 0 Morphologie. Toutes les formes intermédiaires morphologiques comme boulettes allongées ou irrégulières bouquets aura donc des valeurs comprises entre 0 et 1. Particules relativement grandes se traduira par un niveau élevé, particules fongiques avec une grande surface ou particules allongées, dans un certain nombre Morphologie plutôt faible ^11.

Dans des conditions standard de la morphologie dans le réacteur 1 présente un certain nombre Morphologie autour de 0,8. La morphologie dans le réacteur 4 avec 10 g de poudre / L talc dispose d'un Mn d'environ 0,1. Le nombre Morphologie pour les réacteurs 2 et 3, avec des concentrations de poudre de talc 1 et 3 g / L, se situe entre ces deux extrêmes, la démonstration d'une dispersion morphologie. Depuis la morphologie des particules micro dépendante est étroitement liée à la productivité β-fructofuranosidase, une corrélation mathématique du nombre Morphologie et la productivité similaire à la figure 5 est obtenu.

Figure 1. D'ensemble de la conception expérimentale et de la procédure analytique. A. Niger est cultivée (avec ou sans micro-particules) dans un bioréacteur agité de 3 L du réservoir pendant 72 h. Après 24, 48 et 72 ha d'échantillon est prélevé pour la détermination du poids de la biomasse sèche et β-fructofuranosidase activité, qui sont à nouveau utilisés pour le calcul de la productivité spécifique. Après 48 h la morphologie fongique est examiné au microscope et caractérisé par analyse d'image numérique. Les paramètres pertinents de l'analyse d'image sont combinés à un certain nombre de morphologie, qui est corrélée avec l'mathématique productivité spécifique.

Figure 2. Étapes de traitement d'image pour microscopique des images générées par des structures morphologiques de A. Niger. Etape 1: acquisition de l'image au microscope. Étape 2: amélioration de l'image si nécessaire. Étape 3: binarisation d'image, en noir et blanc (binaire) image générée dans ImageJ. Étape 4: l'image binaire est traitée par et objet indésirable sont effacés. Étape 5: analyse morphologique est effectuée avec le "Analyser particules" en fonction de la source de programme ouvert ImageJ.

Figure 3. Différentes formes morphologiques de A. dépend de la concentration de micro-particules ajoutée Niger. Avec une concentration croissante de micro-particules de la taille ajouté à granulés peut être précisément diminué jusqu'à de petites boulettes de core-shell, des troupeaux de petits et le mycélium même librement dispersé. Morphologie de l'ingénierie Commepergillus Niger SKAn1015 par la supplémentation en micro-particules en culture submergée. Sans microparticules (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O), 10 g / l (p), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) et 40-50 g / L (T). Les images ont été prises en microscopie optique après 72 h de culture.

Figure 4. Activité FRUCTOFURANOSIDASE en fonction de talc micro particules concentration de 1 g / L (réacteur 2), 3 g / L (réacteur 3) et 10 g / L (réacteur 4). Le réacteur 1 n'est pas complétée par les micro-particules, ici la culture est réalisée dans des conditions standard.

Figure 5. Représentant une bonne corrélation (R ² = 0,91) de la morphologienombre et la productivité spécifique. Le nombre Morphologie est tracée (en abscisse) contre la productivité spécifique (en ordonnée). La régression non linéaire donne la corrélation exponentielle.

Discussion

La modification de la morphologie fongique a été d'intérêt en matière de biotechnologie depuis de nombreuses décennies. Différentes études ont tenté de faire varier les paramètres du procédé choisis tels que la valeur pH, puissance, température, nutriments moyennes ou ¹ concentration de l'inoculum, mais souffrent de contrôle plutôt imprécise et incomplète de la morphologie, les coûts élevés de l'énergie, des effets d'inhibition ou de l'instabilité du produit, En revanche, la supplémentation en micro-particules permet une ingénierie précise de la morphologie fongique grâce à affiner la variation de la taille des particules et la concentration. Cela ouvre de nouvelles possibilités d'utiliser les micro-particules pour l'optimisation et conception sur mesure de la morphologie production élevée dans la production biotechnologique avec A. Niger et d'autres micro-organismes filamenteux.

L'analyse d'image numérique est une méthode facile reproductible pour caractériser la morphologie macro fongique. Cependant, la variété de paramètres pour ca taille, la forme et la surfaceter des structures morphologiques décrits dans la littérature fait une évaluation rapide de la morphologie fongique compliquée. Le nombre Morphologie présenté comme une combinaison de paramètres pertinents, évite cette lacune et peut être utilisé non seulement pour la caractérisation complète des structures morphologiques, mais aussi pour la corrélation mathématique direct avec la productivité. Cela rend encore une fois une estimation de la productivité par la morphologie donnée et donc une personnalisation de la morphologie des processus doit possible.

En utilisant le numéro Morphologie, il est possible de distinguer entre les différents granulés et morphologies touffe ^4,5. Pour les développements futurs du nombre Morphologie de l'examen de la dimension fractale semble être prometteuse. Une dimension fractale donne une mesure de la complexité et la masse de remplissage des propriétés d'un objet ¹³ et est donc prédestiné pour la caractérisation globale de la morphologie du mycélium.

Le creation d'une morphologie de haut mycélienne production, cependant, pourrait conduire à des problèmes avec la performance du processus en particulier dans la culture à grande échelle, parce que la forme la croissance du mycélium a été démontré antérieurement que présentent beaucoup plus de viscosités bouillon de culture ^2. Cela conduit à des problèmes avec le transfert de chaleur et de masse et la formation de la stagnation des zones non mixtes, qui nécessitent une entrée de puissance plus élevée et rendre la culture plus coûteux à exploiter ^1. Par conséquent, la relation entre la morphologie fongique et de la viscosité bouillon de culture doit être considérée lors du changement de la morphologie et être incorporées dans d'autres modèles.