के अनुकूलन Aspergillus नाइजर

Summary

एक ठीक करने के लिए पैदा करते हैं और विधि के लिए व्यापक filamentous कवक की आकारिकी विशेषताएँ

Protocol

1. रिएक्टर और खेती के सेटअप प्रारंभ

कुल 4 बायोरिएक्टर cultivations में आयोजित की जाती हैं.

1. 2.2 एल के एक काम की मात्रा के साथ ए की खेती के लिए एक 3 एल उभारा टैंक बायोरिएक्टर का प्रयोग करें SKAn1015 नाइजर.
2. रिएक्टर में 72.6 ग्राम ग्लूकोज monohydrate डालो और यह 1.9 एल विआयनीकृत पानी के साथ भरने.
3. रिएक्टर उपकरण ऐसे 3 चकरा के रूप में, एक दो डिस्क छह पंखों टरबाइन प्ररित करनेवाला, पीएच इलेक्ट्रोड, हवा फिल्टर के साथ एक गैस प्रवेश, एक ठंडा उंगली हवा फिल्टर के साथ एक निकास हवा कूलर, एयर फिल्टर के साथ बाँझ नमूना लेने के लिए एक विसर्जन ट्यूब स्थापित और मध्यम, inoculum एसिड, और आधार के लिए प्रवेश hoses.
4. 121 ° C पर 20 मिनट के लिए रिएक्टर आटोक्लेव.
5. एसिड आधार (2 एम एचसीएल, 2 एम NaOH) जलाशय और इसी पंप के साथ रिएक्टर कनेक्ट और पीएच नियंत्रण इकाई के साथ एक 5.0 के पीएच मान ± 0.05 सेट.
6. ठंडा पानी प्रणाली के साथ रिएक्टर लिंक और हीटिंग जैकेट डालरिएक्टर पोत के चारों ओर.
7. इसी नियंत्रण इकाई और 37 के तापमान सेट तापमान संवेदक के साथ स्थापित ± 0.1 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रण इकाई में.
8. रिएक्टर के ऊपर आंदोलन मोटर फिट और सेवा में 200 ^-1 मिनट के आंदोलन की गति के साथ लाना.
9. बाँझ न्यूनतम वृद्धि मध्यम ¹¹ गर्त एक बाँझ प्रवेश hoses (250 एमएल) के में जोड़ें. 121 ° C पर 20 मिनट के लिए मध्यम तैयारी के लिए सभी घटकों autoclaved गया और एक साथ मिलाया. तीन cultivations के लिए घटकों तालक सांद्रता में 1 जी / एल के पाउडर (3MgO • ₂ 4SiO • एच ₂ हे) (2 रिएक्टर), 3 जी / एल (3 रिएक्टर) और 10 छ / एल (4 रिएक्टर) शामिल हैं. उपयोग करने के लिए पहले 50 मिमी सोडियम एसीटेट बफर (6.5 पीएच) में फिर से सूक्ष्म कणों को निलंबित और यह बाँझ माध्यम से जोड़ें. नियंत्रण संस्कृतियों में (कणों बिना) 50 मिमी सोडियम एसीटेट बफर (6.5 पीएच) द्वारा सूक्ष्म कण निलंबन की जगह.
10. बीजाणु (inoculum) निलंबन जोड़ेंWucherpfennig एट तैयार. अल (2011) ¹¹ बाँझ प्रवेश hoses (50 एमएल) की गर्त कि 1x10 ⁶ एमएल ^-1 spores मात्रा की एकाग्रता. टीका (ज = 0 घंटे) की खेती की शुरुआत के निशान.
11. 1.0 एल मिनट ^-1 की दर के साथ प्रारंभ करें वातन.

2. 24 के बाद बाँझ नमूनाकरण, 48 और खेती के 72 घंटे

1. एक flacon ट्यूब में बाँझ संस्कृति शोरबा के 50 एमएल लो.
2. बायोमास सूखी वजन, β-fructofuranosidase गतिविधि और सूक्ष्म विश्लेषण का निर्धारण करने के लिए नमूना का प्रयोग करें.

3. बायोमास सूखी वजन का 24, 48 के बाद दृढ़ संकल्प और खेती के 72 घंटे

1. बायोमास नमूने नकल में कम से कम लिया जा रहे हैं.
2. वजन सूक्ष्म तराजू के साथ एक के बाद फिल्टर सेलूलोज़ desiccator में सुखाने और जुड़े निर्वात पानी जेट पंप के साथ एक BUCHNER कीप में फिल्टर जगह.
3. एक परिभाषित नमूना है (जैसे 10 एमएल) की मात्रा एक फ़िल्टरएन डी 10 एमएल विआयनीकृत पानी के साथ फिल्टर कुल्ला करने के लिए बायोमास से मध्यम यौगिकों को दूर.
4. शिकन फिल्टर एक बार बीच में, यह एक गिलास पेट्री डिश में डाल दिया और एक डिब्बे ड्रायर में वजन भक्ति (कम से कम 24 घंटे) तक डाल दिया.
5. Desiccator में फिल्टर शांत करने के लिए और वजन को मापने के.
6. के साथ और सूखे इस्तेमाल किया नमूना मात्रा से विभाजित बायोमास के बिना फिल्टर के वजन के बीच अंतर के रूप में बायोमास सूखी वजन की गणना.

4. भगवान / पॉड - निबंध द्वारा बाह्य β-fructofuranosidase के enzymatic गतिविधि के 24, 48 के बाद दृढ़ संकल्प और खेती के 72 घंटे

बर्फ पर नमूने लगातार स्टोर, जबकि उनके साथ काम कर रहे हैं.

1. फिल्टर 1.5 एमएल संस्कृति निलंबन गर्त एक सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर के माध्यम से एक सिरिंज के साथ एक प्रतिक्रिया ट्यूब में संस्कृति निलंबन दबाकर फिल्टर. -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग जब तक प्रतिक्रिया ट्यूब स्टोर.
2. प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए 20 का उपयोग करेंμL नमूना और 1.65 मीटर 0.05 एम फॉस्फेट बफर (5.4 पीएच) में भंग सूक्रोज से ग्लूकोज की प्रतिक्रिया आरंभ sucrose के 200 μL जोड़ने. नकल में कम से कम प्रतिक्रिया के बाहर कैरी.
3. एक हीटिंग ब्लॉक में 20 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को सेते हैं. एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर incubating के द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो. यह बर्फ पर भंडारण के द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण को ठंडा होने दें और नीचे में 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 13.000 जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा गाढ़ा पानी स्पिन
4. पीएच और ग्लूकोज में sucrose के तापमान पर निर्भर दरार खाते, 20 μL विआयनीकृत के बजाय 20 μL नमूना के पानी का उपयोग करके एक रिक्त मान ले.
5. संस्कृति शोरबा में अवशिष्ट ग्लूकोज के लिए खाते में, प्रत्येक नमूना के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण ले. कि नमूना के अंत का उपयोग 20 μL और हीटिंग द्वारा 95 डिग्री सेल्सियस पर sucrose के जोड़ने के लिए और के रूप में 4.3 चरण में वर्णित सेते हैं 10 से पहले मिनट के लिए β-fructofuranosidase निष्क्रिय करने के लिए.
6. नमूने ऐसी है कि निम्नलिखित meas पतलाured सोखना के कैलिब्रेटेड मूल्य रेंज में है.
7. तीन प्रतियों में सभी एंजाइमी assays के बाहर ले. एक माइक्रो अनुमापांक अच्छी तरह से थाली में 2 μL पतला नमूना लागू करें. ΜL नमूना 2 के बजाय दस अलग जानते सांद्रता (1 मिमी से 15 मिमी) के साथ दस ग्लूकोज के समाधान के 2 μL का उपयोग कर प्रत्येक द्वारा माइक्रो अनुमापांक प्लेट पर अंशांकन के लिए एक मानक सीमा लागू करें. के लिए शून्य बिंदु अंशांकन 2 μL विआयनीकृत के बजाय 2 μL नमूना पानी का उपयोग करें.
8. एक बहु विंदुक का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्मक समाधान की 200 μL जोड़ें.
9. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं.
10. 6 में सूक्ष्म अनुमापांक थाली स्टोर ° सी माप (ज्यादा से ज्यादा कुछ घंटे) तक.
11. 450 एक 96 अच्छी तरह से सूर्योदय सूक्ष्म प्लेट रीडर और मैगलन डेटा पुनर्प्राप्ति सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एनएम अवशोषण उपाय. मिश्रण समय सेट अप करने के लिए 5 सेकंड. और बाकी 1 सेकंड की अवधि.
12. एक स्प्रेडशीट के साथ परिणाम चार्ट खोलें और एक अंशांकन लाइन के निर्माण के मानक सीमा का उपयोग करके:
    जीlucose एकाग्रता = एक एक्स अवशोषण + ख
    
13. गतिविधि गणना:
    गतिविधि = (अवशोषण एक्स कमजोर पड़ने कारक रिक्त मूल्य) एक्स क + ख
    
14. गतिविधि β-fructofuranosidase नमूना और उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण की गतिविधियों के बीच अंतर की गणना से बाहर चित्रा.
15. निम्नलिखित उपयोग के लिए विशिष्ट उत्पादकता खाते बायोमास सूखी वजन और β से fructofuranosidase ¹¹ गतिविधि में लेने के द्वारा की गणना.

5. और खेती के 72 घंटे के बाद स्वचालित छवि विश्लेषण माइक्रोस्कोपी

1. लगभग 3 जगह एक प्लास्टिक पेट्री डिश में एमएल संस्कृति निलंबन औरउन्हें शारीरिक सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ पतला तक रूपात्मक संरचनाओं अलग हो रहे हैं.
2. एक खुर्दबीन के नीचे पेट्री डिश है, जो एक एकीकृत या जुड़ा कैमरा सुविधाएँ बैठाना. अधिग्रहण और नमूना प्रति रूपात्मक संरचनाओं के बारे में 100 छवियाँ (चित्रा 2) को बचाने के. ध्यान है कि प्रत्येक छवि पर कम से कम एक वस्तु पूरी तरह से कल्पना है भुगतान करते हैं.
3. छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम साथ ImageJ ¹² एक ही नमूना के सभी छवियों को खोलें. काले और सफेद प्रक्रिया उपकरण का उपयोग करके बनाएँ "" बायनरी (चित्रा 2) करने के लिए छवियों कन्वर्ट. छवियों की पूरी श्रृंखला के लिए आदेश लागू करने के लिए के रूप में एक मैक्रो कोड का उपयोग करें.
   रन आउट (बाइनरी बनाओ)
   
4. ImageJ साथ प्रसंस्कृत द्विआधारी छवियों को फिर से खोलें. गणना आकार कारकों Feret व्यास, अनुमान क्षेत्र, परिधि, घेरा, पहलू अनुपात, गोलाई und के दृढ़ता उपकरण का विश्लेषण "सेट" मापन के साथ हर छवि के लिए. एक सेरी के आदेश को लागू करने के लिएतों छवियों के रूप में निम्नानुसार एक मैक्रो कोड का उपयोग करें.
   रन आउट (8 बिट);
   रन आउट ("बाइनरी बनाओ");
   रन आउट (सेट स्केल ... "," दूरी = जाना जाता है एक्स = 1000 पिक्सेल = 1 यूनिट = माइक्रोन वैश्विक ");
   रन आउट ("सेट ... माप", "क्षेत्र परिधि आकार feret सीमा प्रदर्शन = कोई नहीं दशमलव = 3 अनुप्रेषित");
   रन आउट ("कण विश्लेषण ...", "आकार = 10,000 - इन्फिनिटी घेरा = 0.00-1.00 शो = प्रदर्शन की रूपरेखा");
   पिक्सल जो एक पैमाने पर पट्टी भर में एक सीधी रेखा के निर्माण से 1000 माइक्रोन के लिए संबद्ध की संख्या के रूप में निर्धारित एक्स. माइक्रोन में पैमाने पर पट्टी की लंबाई के साथ सीधी रेखा के पिक्सेल की संख्या सहसंबंधी.
5. परिणाम एक स्प्रेडशीट के साथ प्रत्येक छवि के लिए आकार कारक मान चार्ट खोलें. आकृति विज्ञान के रूप में प्रत्येक छवि के लिए इस प्रकार संख्या की गणना.
   
6. मूल्य और आकृति विज्ञान के खाते में एक नमूना के सभी छवियों लेने संख्या के लिए मानक विचलन का मतलब गणना. रेखांकन और विशिष्ट उत्पादकता के साथ आकृति विज्ञान संख्या की चित्रमय संबंध के लिए डेटा विश्लेषण प्रोग्राम का प्रयोग करें और गणितीय प्रतिगमन द्वारा गणितीय संबंध का निर्धारण.

6. प्रतिनिधि परिणाम

तालक सूक्ष्म कणों ए के अलावा के माध्यम से नाइजर Skan 1015 morphology एक सच गोली आकारिकी से छितरी या भी फुई वाला आकारिकी बदल रहा है. जबकि गोली आकारिकी मानक स्थितियों में प्रदर्शन किया है एक फुई वाला आकारिकी की पूरकता माध्यम से 10 ग्राम / एल तालक सूक्ष्म कणों की (चित्रा 4) के साथ बनाया है. समवर्ती से β-fructofuranosidase की गतिविधि लगभग 3 गुना ^3-5 बढ़ जाती है. 1 या 3 ग्राम / तालक पाउडर के एल अनुपूरण एक दोगुनी fructofuranosidase है गतिविधि (चित्रा 4) के साथ एक छितरी आकारिकी की ओर जाता है.

सूक्ष्म कण निर्भर आकारिकी व्यापक मोर द्वारा वर्णित किया जा सकता हैphology संख्या है जो स्वचालित छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित मापदंडों का उपयोग करके गणना की जा सकती है. पूरी तरह गोल और चिकनी छर्रों सूक्ष्म छवियों में परिपूर्ण हलकों के रूप में दिखाई देगा. ऐसे कणों के लिए आकृति विज्ञान संख्या 1 के एक मूल्य है. फुई वाला आकारिकी की छोटी टुकड़ा एक आयामी 0 की एक आकृति विज्ञान संख्या उपज पंक्ति के रूप में सरल किया जा सकता है. लम्बी अनियमित छर्रों या clumps की तरह सभी मध्यवर्ती रूपात्मक रूपों इसलिए 0 और 1 के बीच मूल्यों होगा. काफी बड़े कण एक बड़ी सतह या लम्बी कणों के साथ एक उच्च, एक नहीं बल्कि कम आकृति विज्ञान ^{11 की} संख्या में कवक, कण में परिणाम देगा.

मानक स्थितियों में एक रिएक्टर में morphology 0.8 चारों ओर एक आकृति विज्ञान संख्या दर्शाती है. 10 छ / एल तालक पाउडर के साथ 4 रिएक्टर में morphology 0.1 चारों ओर एक करोड़ सुविधाएँ. 2 रिएक्टरों और तालक पाउडर का 1 और 3 जी / एल, सांद्रता के साथ 3, आकृति विज्ञान संख्या के लिए इन चरम सीमाओं के बीच स्थित है, एक तितर - बितर morpho प्रदर्शनसना हुआ. के बाद से सूक्ष्म कण निर्भर आकारिकी निकट उत्पादकता β-fructofuranosidase के साथ संबंधित है, आकृति विज्ञान संख्या और उत्पादकता चित्रा 5 के लिए इसी तरह की एक गणितीय संबंध प्राप्त है.

चित्रा 1 प्रयोगात्मक डिजाइन और विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के समग्र योजना. ए नाइजर (के साथ या बिना सूक्ष्म कणों) 72 घंटे के लिए 3 टैंक बायोरिएक्टर हड़कंप मच गया एल में खेती की जाती है. 24 के बाद, 48 और 72 हेक्टेयर नमूना के बायोमास सूखी वजन और β-fructofuranosidase गतिविधि है, जो फिर से विशिष्ट उत्पादकता की गणना के लिए इस्तेमाल किया जाता है का निर्धारण करने के लिए लिया जाता है. 48 घंटे के बाद कवक आकारिकी माइक्रोस्कोप से जांच की है और डिजिटल छवि विश्लेषण द्वारा विशेषता है. छवि विश्लेषण के प्रासंगिक मानकों आकृति विज्ञान संख्या है, जो गणितीय विशिष्ट उत्पादकता के साथ सहसंबद्ध है संयुक्त रहे हैं.

चित्रा 2 ए से सूक्ष्म उत्पन्न रूपात्मक संरचनाओं की छवियों छवि प्रसंस्करण के लिए कदम. नाइजर. चरण 1: माइक्रोस्कोप के द्वारा छवि अधिग्रहण. चरण 2: यदि आवश्यक छवि में सुधार. चरण 3: छवि binarization, काले और सफेद (बाइनरी) छवि ImageJ में उत्पन्न. चरण 4: द्विआधारी छवि द्वारा संसाधित है और अवांछित वस्तु को मंजूरी दे दी है. चरण 5: रूपात्मक विश्लेषण खुला स्रोत प्रोग्राम ImageJ के कणों का विश्लेषण समारोह के साथ आयोजित किया जाता है.

चित्रा 3. ए के morphological अलग रूपों जोड़ा सूक्ष्म कणों की एकाग्रता पर निर्भर नाइजर. सूक्ष्म कणों की एकाग्रता बढ़ाने गोली आकार छोटे कोर खोल छर्रों, छोटी भेड़ और भी आज़ादी से छितरी फुई ठीक किया जा सकता है नीचे की कमी हुई. के रूप में की आकारिकी इंजीनियरिंगpergillus नाइजर SKAn1015 जलमग्न संस्कृति में सूक्ष्म कण पूरकता द्वारा. बिना microparticles है (ए) 10 मिलीग्राम / एल (बी), 0.1 छ / एल (सी), 0.2 छ / एल (डी), 0.3 छ / एल (ई), 0.6 छ / एल (एफ), 1.0 ग्राम / एल (जी), 1.5 छ / एल (एच), 2.0 छ / एल (मैं), 2.5 छ / एल (जे), 3.0 ग्राम / एल (कश्मीर), 3.5 छ / एल (एल) 4.0 छ / एल (एम ), 4.5 छ / एल (एन), 5.0 छ / एल (का.), 10 जी / एल (पी) 15, छ / एल (क्यू), 20 छ / एल (नि.), 30 जी / एल (एस) और 40-50 छ / एल (टी). छवियाँ प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा खेती की 72 घंटे के बाद ले जाया गया.

चित्रा 4 की निर्भरता Fructofuranosidase गतिविधि तालक सूक्ष्म कण एकाग्रता 1 / जी एल (रिएक्टर 2), 3 जी / एल (3 रिएक्टर) और 10 जी / एल (4 रिएक्टर). 1 रिएक्टर सूक्ष्म कणों के साथ पूरक है, यहाँ खेती मानक शर्तों के तहत आयोजित किया जाता है.

चित्रा 5 आकृति विज्ञान के प्रतिनिधि अच्छे संबंध ⁽² आर = 0.91).संख्या और विशिष्ट उत्पादकता. आकृति विज्ञान संख्या (भुज) विशिष्ट उत्पादकता (तालमेल) के खिलाफ साजिश रची है. Nonlinear प्रतिगमन घातीय सहसंबंध पैदावार.

Discussion

कवक आकारिकी की संशोधन जैव प्रौद्योगिकी में रुचि के कई दशकों के बाद से किया गया है. विभिन्न अध्ययनों के पीएच मान, शक्ति इनपुट, तापमान, मध्यम पोषक तत्वों या inoculum ¹ एकाग्रता के रूप में चयनित प्रक्रिया पैरामीटर भिन्न करने की कोशिश की है, लेकिन आकारिकी की बल्कि imprecise और अधूरा नियंत्रण, उच्च ऊर्जा लागत, निषेध प्रभाव या उत्पाद अस्थिरता इसके विपरीत, से ग्रस्त हैं, सूक्ष्म कणों की पूरकता tuned ठीक कण आकार और एकाग्रता की भिन्नता के माध्यम से कवक आकारिकी की एक सटीक इंजीनियरिंग की अनुमति देता है. यह नई संभावनाओं के अनुकूलन के लिए और उच्च उत्पादन आकारिकी की दर्जी डिजाइन के लिए ए के साथ जैव प्रौद्योगिकी उत्पादन में सूक्ष्म कणों का उपयोग करने के लिए खोलता है नाइजर और अन्य filamentous सूक्ष्मजीवों.

डिजिटल छवि विश्लेषण के लिए एक आसान प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य के कवक मैक्रो morphology विशेषताएँ विधि है. हालांकि, आकार, आकार और सतह के चरित्र के लिए मानकों की विविधताआतंकवाद रूपात्मक संरचनाओं के साहित्य में वर्णित कवक जटिल आकृति विज्ञान के त्वरित आकलन करता है. प्रासंगिक मानकों के संयोजन के रूप में प्रस्तुत आकृति विज्ञान संख्या, इस कमी से बचा जाता है और रूपात्मक संरचनाओं के व्यापक लक्षण वर्णन के लिए ही नहीं बल्कि उत्पादकता के साथ सीधे गणितीय संबंध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह फिर से दिया आकारिकी और आकारिकी की प्रक्रिया के लिए इसलिए एक अनुकूलन द्वारा उत्पादकता के एक अनुमान प्रदान संभव की जरूरत है.

आकृति विज्ञान नंबर का उपयोग करना, यह संभव है विभिन्न गोली और पेड़ों का झुरमुट ^4,5 morphologies के बीच अंतर है. आकृति विज्ञान संख्या के आगे विकास के लिए भग्न आयाम पर विचार करने के लिए वादा किया जा रहा है. एक भग्न आयाम जटिलता और बड़े पैमाने पर एक ¹³ वस्तु के गुण भरने की एक माप देता है और इसलिए फुई वाला आकारिकी की समग्र लक्षण वर्णन के लिए predestinated है.

करोड़एक उच्च उत्पादन फुई वाला morphology eation, तथापि, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर खेती में प्रक्रिया प्रदर्शन के साथ समस्याओं का नेतृत्व, क्योंकि फुई वाला विकास के फार्म पहले किया गया है बहुत अधिक से अधिक संस्कृति शोरबा विस्कोसिटी ² एक्ज़िबिट दिखाया हो सकता है. यह गर्मी और बड़े पैमाने पर स्थानांतरण और स्थिर गैर मिश्रित क्षेत्र है, जो एक उच्च शक्ति इनपुट और खेती और अधिक महंगा करने के लिए ¹ संचालित की आवश्यकता के गठन के साथ समस्याओं की ओर जाता है. इसलिए कवक आकारिकी और संस्कृति शोरबा दलदलापन के बीच संबंधों को जब आकारिकी बदल रहा है और आगे के मॉडल में शामिल माना जाना चाहिए.