Tilpasning av Aspergillus niger Morfologi Gjennom Tilsetting av talkum mikropartikler

Summary

En metode for å nettopp skape og til omfattende karakterisere morfologi trådformede sopp

Abstract

Den trådformede sopp A. Niger er en mye brukt belastning i et bredt spekter av industrielle prosesser fra mat til farmasøytisk industri. En av de mest spennende og ofte ukontrollerbart kjennetegner denne trådformede organismen er dets komplekse morfologi. Det spenner fra tette kuleformede pellets til viskøs mycelia (figur 1). Ulike prosessparametre og ingredienser er kjent for å påvirke sopp morfologi ^en. Siden optimal produktivitet korrelerer sterkt med en bestemt morfologisk form, representerer sopp morfologi ofte flaskehalsen av produktiviteten i industriell produksjon.

En rett frem og elegant tilnærming til nøyaktig kontroll morfologisk form er tillegg av uorganiske uløselige mikropartikler (som hydrous magnesium silikat, aluminiumsoksid eller titan silikat oksid) til kultur medium bidrar til økt enzymproduksjon ^2-6. Siden det er en obvIOUs korrelasjon mellom mikro partikkel avhengige morfologi og enzym produksjon er det ønskelig å matematisk koble produktivitet og morfologiske utseende. Derfor en kvantitativ presis og helhetlig morfologiske beskrivelse er målrettet.

Derfor presenterer vi en metode for å generere og karakterisere mikro partikkel avhengige morfologiske strukturer og å korrelere sopp morfologi med produktiviteten (figur 1) som muligens bidrar til en bedre forståelse av morphogenesis av trådformede mikroorganismer.

Den rekombinant belastningen A. Niger SKAn1015 dyrkes i 72 timer i en 3 L rørt tank bioreaktor. Ved tilsetting av talkum mikropartikler i konsentrasjoner på 1 g / L, 3 g / l og 10 g / L før inokulering en rekke morfologiske strukturer er reproduserbart generert. Sterile prøver tatt etter 24, 48 og 72 timer for bestemmelse av vekst fremgang og aktivitet av produsert enzymet. Detdannet produktet er av høy verdi enzymet β-fructofuranosidase, en viktig biocatalyst for neo-sukker-formasjonen i mat eller farmasøytisk industri, som katalyserer blant annet reaksjonen av sukrose til glukose ^7-9. Derfor innebærer kvantifisering av glukose etter at sukrose mengden av produsert β-fructofuranosidase. Glukose kvantifisering er laget av en Gud / POD-Assay ^10, som er modifisert for high-throughput analyser i 96-brønnen mikro titer plater.

Fungal morfologi etter 72 timer er undersøkt av mikroskop og preget av digital bildeanalyse. Dermed blir partikkel form faktorer for sopp makro morfologi som Feret diameter, anslått areal, omkrets, sirkularitet, sideforhold, rundhet und soliditet beregnes med åpen kildekode bildebehandlingsprogram ImageJ. Relevante parametere er kombinert til en dimensjonsløs morfologi nummer (Mn) ^11, som muliggjør en omfattende karakterisering avsopp morfologi. Den nære sammenhengen av morfologi antall og produktivitet fremheves av matematisk regresjon.

Protocol

1. Reactor Oppsett og Start av Dyrking

4 bioreaktor jordbearbeiding totalt blir gjennomført.

1. Bruk en 3 L rørt tank bioreaktor med en fungerende volum på 2,2 L for dyrking av A. Niger SKAn1015.
2. Hell 72,6 g glukose monohydrat inn i reaktoren, og fylle den opp med 1,9 L avionisert vann.
3. Installer reaktoren utstyr som 3 Bafflene, en to seks-blader disk turbin impeller, en pH elektrode, en gass innløp med luft filter, en avkjølende finger, en avtrekksluft kjøler med luft filter, en nedsenking tube for sterilt prøvetaking med luft filter og inngang slanger for medium, podestoff, syre og base.
4. Autoklaver reaktoren ved 121 ° C i 20 min.
5. Koble reaktoren med syre-base reservoar (2 M HCl, 2 M NaOH) og de tilsvarende pumper og sette opp en pH-verdi på 5,0 ± 0,05 med pH kontrollenheten.
6. Lenke reaktoren med kjøling-vann system og sette varmekapperundt reaktortanken.
7. Installer temperaturføleren med tilhørende kontrollenhet og sette opp en temperatur på 37 ± 0,1 ° C ved temperaturstyringsenhet.
8. Monter agitasjon motor på toppen av reaktoren og bringe det inn i tjeneste med en uro hastighet på 200 min ^-1.
9. Legg til sterile minimal vekst medium ¹¹ gjennom en av de sterile innløpet slangene (250 ml). For middels forberedelse alle komponentene ble autoklaveres ved 121 ° C i 20 min og blandet sammen. For tre jordbearbeiding komponentene inkluderer talkum pulver (3MgO • 4SiO ₂ • H ₂ O) i konsentrasjonene av 1 g / L (reaktor 2), 3 g / L (reaktor 3) og 10 g / L (reaktor 4). Før bruk, re-suspendere mikropartikler i 50 mM natriumacetat buffer (pH 6,5) og legge den til sterilt medium. I kontroll kulturer (uten partikler) erstatte mikro partikkel fjæringen med 50 mM natriumacetat buffer (pH 6,5).
10. Legg sporeoppløsning (podestoff) ens utarbeidet i Wucherpfennig et. al (2011) ¹¹ gjennom en av de sterile innløpet slangene (50 ml) slik at konsentrasjonen av sporer utgjør 1x10 ⁶ ml ^-1. Inokuleringen markerer starten på dyrking (h = 0 h).
11. Start lufting med en rate på 1,0 L min ^-1.

2. Steril Prøvetaking etter 24, 48 og 72 timer av Dyrking

1. Ta 50 ml sterilt kultur buljong i en flacon tube.
2. Bruk utvalget for bestemmelse av biomasse tørrvekt, β-fructofuranosidase aktivitet og mikroskopisk analyse.

3. Fastsettelse av biomasse Tørrvekt etter 24, 48 og 72 timer av Dyrking

1. Biomasse prøvene skal tas minst i to eksemplarer.
2. Vekt en cellulose filter med en mikro skalaer etter tørking i eksikkator og legg filteret i en Büchner trakt med tilkoblet vann-jet vakuumpumpe.
3. Filtrere et definert prøvevolum (f.eks 10 ml) ennd skylle filteret med 10 ml avionisert vann for å fjerne middels forbindelser fra biomasse.
4. Rynke filteret en gang i midten, legg den i et glass petriskål og sette det inn i en kupé tørketrommel til vekt constancy (minst 24 h).
5. Avkjøl filteret i en eksikkator og måle vekten.
6. Beregn biomasse tørrvekt som differansen mellom vekten av filter med og uten tørket biomasse fordelt på brukte prøvevolum.

4. Fastsettelse av ekstracellulær enzymatisk aktivitet av β-fructofuranosidase av Gud / POD-essay etter 24, 48 og 72 timer av Dyrking

Oppbevar prøvene på is hele tiden mens du arbeider med dem.

1. Filter 1,5 mL kultur suspensjon gjennom en celluloseacetat filter ved å trykke på kulturen suspensjonen med en sprøyte gjennom filteret i en reaksjon tube. Oppbevar reaksjonsrøret ved -20 ° C til bruk.
2. For reaksjonsblandingen bruke 20mL prøve og legge 200 mL av 1,65 M sukrose løst i 0,05 M fosfat buffer (pH 5,4) for å starte reaksjonen fra sukrose til glukose. Cary ut reaksjonen i alle fall i to eksemplarer.
3. Inkuber reaksjonsblandingen ved 40 ° C i 20 min i en oppvarming blokk. Stopp reaksjonen ved å inkubere ved 95 ° C i 10 min i en oppvarming blokk. Kjøl reaksjonsblandingen ved å lagre den på is og spinne ned det kondenserte vannet ved sentrifuger ved 13.000 g for 10 min ved 4 ° C.
4. Til konto pH og temperatur avhengig spalting av sukrose til glukose, gjennomføre en tom verdi ved å bruke 20 mL avionisert vann i stedet for 20 mL prøve.
5. Til konto for gjenværende glukose i kulturen kjøttkraft, utføre en negativ kontroll for hver prøve. For at sluttbruk 20 mL av prøven og inaktiverer β-fructofuranosidase ved oppvarming ved 95 ° C i 10 min før for å legge til sukrose og inkuberes som beskrevet i trinn 4.3.
6. Fortynn prøvene slik at følgende målermåles adsorpsjon er i den kalibrerte verdiområdet.
7. Gjennomføre alle enzymatiske essay i tre eksemplarer. Påfør 2 mL fortynnet prøve i en mikro titer plate godt. Påfør en standard serie for kalibrering på mikro titer plate ved hver med 2 mL av ti glukoseoppløsninger med ti forskjellige kjenner konsentrasjoner (fra 1 mm til 15 mm) i stedet for 2 mL prøve. For nullpunktet kalibrering bruke 2 mL avionisert vann i stedet for 2 mL prøve.
8. Tilsett 200 mL av reagensen løsning til hver brønn ved hjelp av en multi pipette.
9. Inkuber blandingen i 10 minutter ved romtemperatur.
10. Oppbevar mikro titer platen ved 6 ° C til mål (noen få timer på de fleste).
11. Mål absorpsjon ved 450 nm ved hjelp av en 96-brønn Sunrise mikro plateavleseren og Magellan innhenting av data programvare. Still blandetiden opp til 5 sek. og resten perioden fram til 1 sek.
12. Åpne resultatet diagrammet med et regneark og konstruere en kalibrering linje ved hjelp av standard område:
    glucose konsentrasjon = a X absorpsjon + b
    
13. Beregn aktivitet:
    aktivitet = (absorpsjon X fortynningsfaktoren-blank verdi) X a + b
    
14. Regne ut den β-fructofuranosidase aktivitet ved å beregne forskjellen mellom virksomheten i utvalget og den egnet negativ kontroll.
15. Beregn spesifikk produktivitet for følgende bruk ved å ta hensyn til biomasse tørrvekt og β-fructofuranosidase aktivitet ^11.

5. Mikroskopi og automatisert bildeanalyse etter 72 timers Dyrking

1. Sted rundt 3 ml kultur suspensjon i en plast petriskål ogfortynne dem med fysiologisk natriumkloridoppløsning før morfologiske strukturer blir separert.
2. Plasser petriskål under et mikroskop, som har en integrert eller tilkoblet kamera. Erverve og lagre rundt 100 bilder (figur 2) av morfologiske strukturer per prøve. Vær oppmerksom på at på hvert bilde på minst ett objekt er helt avbildet.
3. Åpne alle bilder av den samme prøven med bildebehandling programmet ImageJ ^12. Konverter bildene til svart og hvitt ved hjelp av prosessen verktøyet "Lag Binary" (figur 2). For å bruke kommandoen til hele serien av bilder bruker du en makro kode som følger.
   løpe (,, Gjør Binary ")
   
4. Åpne bearbeidede binære bilder med ImageJ igjen. Beregn formen faktorer Feret diameter, anslått areal, omkrets, sirkularitet, sideforhold, rundhet und soliditet for hvert bilde med analysere verktøyet "Set Measurement". For å bruke kommandoen til en Series av bilder bruker du en makro kode som følger.
   kjøre ("8-bit");
   kjøre ("Gjør Binary");
   kjøre ("Set Scale ...", "avstand = X kjent = 1000 pixel = 1 enhet = mikrometer global");
   kjøre ("Sett Mål ...", "areal omkrets form feret grense skjerm viderekobler = Ingen desimal = 3");
   kjøre ("Analyze Partikler ...", "size = 10000-Infinity sirkularitet = 0,00 til 1,00 showet = Outlines display");
   Bestem X som antall piksler som korrelerer til 1000 mikrometer ved å konstruere en rett linje over en skala bar. Correlate antall piksler i rett linje med lengden av skalaen bar i mikrometer.
5. Åpne resultatet diagrammet inneholder form factor verdiene for hvert bilde med et regneark. Beregn en Morfologi nummer som følger for hvert bilde.
   
6. Beregn middelverdi og standardavvik for morfologi tallet tar hensyn til alle bilder av en prøve. Bruk en grafisk og data analyse program for grafisk korrelasjon av morfologi tallet med den spesifikke produktivitet og bestemme den matematiske forhold ved matematisk regresjon.

6. Representative Resultater

Gjennom tilførsel av talkum mikro partikler A. Niger Skan 1015 morfologi er forandret fra en sann pellet morfologi til en spredt eller mycelial morfologi. Mens pellet morfologi er utstilt ved normaltilstand en mycelial morfologi er skapt av tilskudd av medium med 10 g / L av talkum mikropartikler (figur 4.). Samtidig aktiviteten av β-fructofuranosidase øker rundt tre ganger ^3-5. Et tilskudd på 1 eller 3 g / L av talkum pulver fører til en spredt morfologi, med en doblet fructofuranosidase aktivitet (figur 4.).

Mikro partikkel avhengige morfologi kan være omfattende beskrevet av Morphology nummer som kan beregnes ved hjelp av parametere bestemt ved automatisk bildeanalyse. Perfekt runde og glatte pellets vil i mikroskopiske bilder vises som perfekte sirkler. For slike partikler morfologi nummeret har en verdi på 1. Den minste fragment av mycelial morfologi kan forenkles som en endimensjonal linje gir en Morfologi antall 0. Alle mellomliggende morfologiske former som avlange uregelmessige pellets eller klumper vil derfor ha verdier mellom 0 og 1. Ganske store partikler vil resultere i en høy, sopp partikler med en stor overflate eller avlange partikler, i en ganske lav Morfologi nummer ^11.

Ved normaltilstand morfologi i reaktoren en utstillinger en Morfologi rekke rundt 0,8. Morfologi i reaktoren 4 med 10 g / l talkum pulver har en Mn rundt 0,1. Morfologi tall for reaktorer 2 og 3, med talkum pulver konsentrasjoner av 1 og 3 g / L, ligger mellom disse ytterpunktene, viser en spredt Morphologi. Siden micro partikkel avhengig morfologi er nært beslektet med β-fructofuranosidase produktivitet, er en matematisk sammenheng av morfologi nummer og produktivitet som ligner på Figur 5 innhentet.

Figur 1. Generelle ordningen for eksperimentell design og den analytiske prosedyren. A. Niger er dyrket (med eller uten mikropartikler) i en 3 L rørt tank bioreaktor for 72 timer. Etter 24, blir 48 og 72 ha prøve som er tatt for bestemmelse av biomasse tørr vekt og β-fructofuranosidase aktivitet, som igjen brukes til beregning av den spesifikke produktivitet. Etter 48 timers soppens morfologi blir undersøkt av mikroskop og preget av digital bildeanalyse. Relevante parametere for bildeanalyse kombineres til en Morfologi tall, noe som er matematisk korrelert med spesifikke produktivitet.

Figur 2. Steps av bildebehandlingen for mikroskopisk-genererte bilder av morfologiske strukturer fra A. Niger. Trinn 1: image oppkjøpet av mikroskop. Trinn 2: image forbedring om nødvendig. Trinn 3: image binarization, svart-hvitt (binær) image generert på ImageJ. Trinn 4: det binære bildet er behandlet av og uønsket objekt slettes. Trinn 5: morfologisk analyse er utført med "Analyze partikler" funksjonen til åpen kildekode-program ImageJ.

Figur 3. Ulike morfologiske former for A. Niger avhengig av konsentrasjonen av tilsatte mikropartikler. Med økende konsentrasjon av mikropartikler lagt til pelletstørrelse kan være nettopp redusert ned til små kjerne-skall pellets, små flokker og selv fritt spredt mycel. Morfologi prosjektering av Aspergillus Niger SKAn1015 av micro partikkel tilskudd i neddykket kultur. Uten mikropartikler (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) og 40-50 g / L (T). Bilder ble tatt av lysmikroskopi etter 72 timer av kultivering.

Figur 4. Fructofuranosidase aktivitet i avhengighet av talkum mikro partikkelkonsentrasjonen 1 g / L (reaktor 2), 3 g / L (reaktor 3) og 10 g / L (reaktor 4). Reactor 1 er ikke supplert med mikropartikler, her ved dyrking er utført under vanlige forhold.

Figur 5. Representant god korrelasjon (R ² = 0,91) av Morfologinummer og den spesifikke produktivitet. Morfologi nummer plottes (abscissen) mot den spesifikke produktivitet (samordner). Ulineær regresjon gir den eksponentielle korrelasjon.

Discussion

Modifikasjonen av sopp morfologi har vært av interesse for bioteknologi ettersom mange tiår. Ulike studier har forsøkt å variere valgte prosessen parametere som pH-verdi, strøminntak, temperatur, medium næringsstoffer eller podestoff konsentrasjon ^en, men lider heller upresis og ufullstendig kontroll av morfologi, høye energikostnader, hemming virkninger eller produkt ustabilitet, derimot, tilskudd av mikropartikler gir en presis prosjektering av sopp morfologi gjennom finjustert variasjon av partikkelstørrelse og konsentrasjon. Dette åpner nye muligheter for å bruke mikropartikler for optimalisering og for skreddersydd design av høy produserende morfologi i bioteknologisk produksjon med A. Niger og andre trådformede mikroorganismer.

Den digitale bildeanalyse er en lett reproduserbar metode for å karakterisere sopp makro morfologi. Men rekke parametere for størrelse, form og overflate pregetter av morfologiske strukturer som er beskrevet i litteraturen gjør rask vurdering av sopp morfologi komplisert. Det presenteres Morfologi tallet som en kombinasjon av relevante parametere, unngår denne mangelen, og kan brukes ikke bare for en omfattende karakterisering av morfologiske strukturer, men også for direkte matematisk sammenheng med produktivitet. Dette gjør igjen en estimering av produktiviteten ved gitte morfologi og derfor en tilpasning av morfologi for prosessen trenger mulig.

Bruke Morfologi tallet, er det mulig å skille mellom ulike pellet og klumper seg morfologi ^4,5. For videre utvikling av Morfologi antall hensynet til fraktalen dimensjonen synes å være lovende. En fraktal dimensjon gir en måling av kompleksitet og masse fylle egenskaper for et objekt ^13, og er derfor forutbestemt for helhetlig karakterisering av mycelial morfologi.

CReation av et høyt produserende mycelial morfologi, derimot, kan føre til problemer med en prosess, særlig i stor skala dyrking, fordi mycelial veksten skjemaet er tidligere vist å utstille mye større kultur kjøttkraft viskositeter ^to. Dette fører til problemer med varme-og massetransport og dannelse av stagnerende ikke blandede soner, som krever en høyere makt innspill og gjøre dyrking dyrere å drive ^en. Derfor forholdet mellom sopp morfologi og kultur buljong viskositeten bør vurderes ved endring av morfologi og bli innlemmet i ytterligere modeller.