Summary
يصف هذا بروتوكول تحفيز الخلايا الليفية مثقف مع الموجات فوق الصوتية المنخفضة الحدة نابض، وهو ما يدفع التنسيق تشكيل التصاق وRac1 تفعيل عن طريق محاكاة إشراك عبر الغشاء مستقبلات مصفوفة، syndecan-4. ويسمح هذا النهج من التحقيق تقنية السريرية ناجح على المستوى الخلوي، وبالتالي توفير فرص للتحسين من العلاج.
Abstract
في الكائنات متعددة الخلايا، وتملي سلوك الخلية عن طريق التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية. نتائج مصفوفة الارتباط مجموعة من تنظيم الهجرة الخلية، وانتشار الأسلحة النووية، إلى إفراز وحتى التفريق. الإشارات الكامنة وراء كل من هذه العمليات المعقدة تنشأ من التفاعلات الجزيئية من مستقبلات المصفوفة خارج الخلية على سطح الخلية. integrins يست المستقبلات prototypic وتقديم وصلة ميكانيكية بين المصفوفة خارج الخلية والهيكل الخلوي، وكذلك الشروع في بعض من أجهزة الطرد المركزي التي تعتمد على الالتصاق مما يشير. ومع ذلك، فإنه بات من الواضح بشكل متزايد أن مستقبلات عبر الغشاء إضافية تعمل جنبا إلى جنب مع لل integrins لتنظيم كل من إنتغرين نفسها وإشارات المصب. وأكثر أناقة من هذه الأمثلة هو بروتيوغليكان عبر الغشاء، syndecan-4، والتي تتعاون مع β α 5 1-إنتغرين خلال التصاق إلى فبرونيكتين. في النماذج الحية demonstrأكلت على أهمية إشارات-4 syndecan، كما syndecan-4-خروج المغلوب الفئران تبدي تخلف الشفاء بسبب عدم كفاءة الخلايا الليفية 1،2 الهجرة. في البرية من نوع الحيوانات، ويتم تشغيل الهجرة من الخلايا الليفية نحو الجرح من قبل ظهور فبرونيكتين أن يترسب تتسرب من الشعيرات الدموية التالفة والتي الضامة في النسيج المصاب. ولذلك هناك اهتمام كبير في اكتشاف الاستراتيجيات التي تعزز فبرونيكتين التي تعتمد على الإشارات، ويمكن تسريع عمليات الإصلاح.
ويمكن فصل مكونات إنتغرين بوساطة وsyndecan-4-بوساطة من فبرونيكتين التي تعتمد على إشارات من الخلايا المحفزة مع شظايا فبرونيكتين المؤتلف. على الرغم من أن إنتغرين المشاركة أمر ضروري للالتصاق الخلية، وينظم بعض فبرونيكتين التي تعتمد على الاشارات التي syndecan-4. Syndecan-4 ينشط إشارة Rac1 تبارزي 3، يسبب إنتغرين إعادة توزيع 1، مشغلات تجنيد جزيئات هيكل الخلية، مثل vinculin، إلى التنسيقالتصاقات 4، ويدفع بذلك الاتجاه 3 هجرة. كنا نبحث عن استراتيجيات بديلة لتفعيل مثل هذه الاشارات، ووجدت أن الموجات فوق الصوتية المنخفضة الحدة نابض (LIPUS) يمكن أن تحاكي آثار الاشتباك-4 syndecan 5. في هذا البروتوكول وصفنا الطريقة التي يمكن تطبيقها على 30 ميغاواط / سم 2، 1.5 ميغاهيرتز الموجات فوق الصوتية، نابض في 1 كيلو هرتز (الشكل 1) إلى الخلايا الليفية في ثقافة (الشكل 2) للحث على Rac1 التنشيط والتنسيق تشكيل الالتصاق. يتم تطبيق التحفيز الموجات فوق الصوتية لمدة أقصاها 20 دقيقة، كما تم العثور على هذه المجموعة من المعلمات لتكون الأكثر فعالية لتسريع اصلاح كسر السريرية 6. ويستخدم أسلوب شظايا فبرونيكتين المؤتلف للانخراط α β 5 1-إنتغرين، دون إشراك syndecan-4، ويتطلب تثبيط تخليق البروتين بواسطة سيكلوهيكسيميد لمنع ترسب مصفوفة إضافية من الخلايا الليفية.، وتأثير إيجابي سموثق بشكل جيد و الموجات فوق الصوتية على آليات إصلاح 7،8، و من خلال فهم تأثير الجزيئية الموجات فوق الصوتية في الثقافة يجب أن نكون قادرين على صقل هذه التقنية العلاجية لتحسين النتائج السريرية.
Protocol
1. طلاء الأسطح مع يجند مصفوفة
- وسيتم تطبيق الموجات فوق الصوتية على الخلايا في 3.5 سم، والآبار، وإما على أطباق فردية أو على شكل لوحة 6 جيدا. لفحوصات الكيمياء الحيوية، ومعطف يجند مباشرة على البلاستيك. لالمناعي، والزجاج يغلي coverslips ثلاث مرات في الماء MilliQ ومكان 4 coverslips في الجزء السفلي من كل بئر.
- يجب أن تكون الواجهات الزجاجية derivatized لضمان كفاءة طلاء يجند. حل sulpho-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide استر في برنامج تلفزيوني في 1 ملم. إضافة 2 مل لكل جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الأسطح derivatized 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- معطف إما الزجاج أو البلاستيك غير المعالجة derivatized مع يجند إنتغرين. تطبيق 2 مل من 10 ميكروغرام / مل إنتغرين ligand9، الذائب في برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + على كل جيد واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إعداد monoparticulate جيش صرب البوسنة عن طريق تسخين BSA 1٪، وحلت في برنامج تلفزيوني، إلى 85 درجة مئوية لمدة 13 دقيقة. السماح لللتبرد، ثم تمرر من خلال مرشح 0.45-ميكرون.
- غسل يجند المغلفة السطوح 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وكتلة مع جيش صرب البوسنة monoparticulate لمدة 30 دقيقة.
2. إعداد خلايا
- للسيطرة على البيئة مصفوفة في كافة مراحل التجربة، يجب أن يكون قد تم حظره من قبل تخليق البروتين إضافة سيكلوهيكسيميد ميكروغرام / 25 مل إلى 80٪ من الخلايا الليفية متكدسة لمدة 2 ساعة.
- شطف سيكلوهيكسيميد المعالجة الخلايا مع برنامج تلفزيوني وفصل من القارورة ثقافة باستخدام 0.5 ملغ / التربسين مل / EDTA.
- حصاد خلايا منفصلة عن طريق الطرد المركزي في ز 500x لمدة 5 دقائق.
- Resuspend الخلايا في HEPES ملي DMEM/25، 25 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد.
- عد كثافة خلية من التعليق باستخدام haemocytometer ويضعف إلى 105 مل-1.
- احتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لاستعادة إنتغرين السطح.
- شطف يجند المغلفة، BSA، سدت الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- البذور 2 مل من تعليق خلية في كل بئر.
- ألوخلايا w لنشر لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
3. الموجات فوق الصوتية تحفيز
- تدفئة مجموعة باعث الموجات فوق الصوتية وهلام اقتران إلى 37 درجة مئوية.
- تطبيق فقاعة بحجم حبة البازلاء من اقتران هلام إلى كل باعث.
- اختبار أن كل باعث وظيفية تستخدم الصمام الثنائي مؤشر للكشف عن الموجات فوق الصوتية.
- وضع الآبار في مجموعة باعث. عودة مجموعة الى 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون (2) وتسمح للحرارة لكي تتوازن لمدة 10 دقائق.
- التبديل على إشارة الموجات فوق الصوتية.
- فإن إشارة الموجات فوق الصوتية تنشيط بعد 20 دقيقة، ومحاكاة النظام العلاجي. إذا كانت هناك حاجة أقصر الأوقات التحفيز، يجب إزالة لوحات من مجموعة في الوقت المناسب نقاط. في جميع الحالات استخدام unstimulated لوحات مثل لسيطرة سلبية.
4. تنسيق تحليل التصاق بواسطة المناعي
- لتحليل تشكيل التصاق التنسيق، وتطبيق إشارة الموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقةومن ثم السماح لتطوير هياكل لمزيد من 40 دقيقة عن طريق الحفاظ على خلايا في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- نضح وسائل الاعلام وتحديد الخلايا من خلال تطبيق بارافورمالدهيد 2 مل 4٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 14 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح لامتصاص العرق وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، وتطبيق برنامج تلفزيوني بلطف إلى أسفل حافة البئر لتجنب توليد قوى القص.
- نقل كل ساترة من الطول 3،5 جيدا الى لوحة 24-جيدا لتلطيخ مناعي لاحق.
- سقى لامتصاص العرق المتبقي من خلال تطبيق 0.5 مل 0،1 M جليكاين في برنامج تلفزيوني على كل من الآبار 24. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح جليكاين وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- Permeabilise الخلايا من خلال تطبيق 0.5 مل تريتون 0.5٪ X-100 (W / V) في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح تريتون X-100 وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- منع من خلال تطبيق 0.5 مل 3٪ (W / V) في جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني. احتضان بين عشية وضحاها في 4 و دعلى سبيل المثال، C.
- وصمة عار vinculin المحتوية على التصاق التنسيق مع الجسم المضاد-1 hVIN 1:400 المخفف في كتلة جيش صرب البوسنة. احتضان لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- تطبق fluorophore (DyLight 488)، مترافق الأضداد الثانوية (المخفف 1:200) وصمة عار مع الأكتين TRITC مترافق phalloidin (المخفف 1:200) في كتلة جيش صرب البوسنة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ومرة واحدة مع المياه.
- جبل على شريحة زجاجية في وضع مقلوب باستخدام إطالة mountant الذهب.
5. الكمي للRac1 التنشيط بواسطة المنسدلة الفحص
- لتحليل Rac1 التنشيط، وتطبيق إشارة الموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة على الخلايا عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2. عند تقييم أوقات الاستجابة وقتا أطول من 20 دقيقة، وتطبيق إشارة الموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون 2 للوقت المتبقي للسماح للاستجابة للتطور.
- وسائل الإعلام، ونضح مكان جيدق على الجليد. شطف الآبار مع 2 مل PBS الباردة ونضح. تتم إزالة أي ضمان PBS المتبقية من خلال ترك آبار مائلة لمدة 1 دقيقة تليها طموح شامل.
- ليز الخلايا على الجليد مع 35 العازلة تحلل ميكروليتر (الجلسرين بنسبة 10٪، و 20 درجة الحموضة Hepes ملي 7.4، 140 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ NP40، و 0.5٪ Deoxycholate الصوديوم، 4 مم EGTA، 4 مم EDTA، 1 × كاملة مثبط للبروتياز) لكل بئر. في هذا المثال، يتم استخدام 6 آبار في نقطة زمنية لتوليد ميكرولتر 210 من المحللة الخلية. ويمكن استخدام الآبار أكثر أو أقل ولكن اجمالي حجم المحللة أن إجمالي ~ 200 ميكروليتر.
- تميل الخلايا كشط تماما مع مكشطة خلية كاملة لضمان تحلل الخلية وترك الآبار لمدة 1 دقيقة للسماح للالمحللة للتجمع.
- نقل المحللة إلى أنبوب مثلج microfuge 1.5 مل (lysates تجمع من النظام العلاجي نفسه)، وتدور في 21000 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة مئوية 4 إلى حطام الخلوية بيليه.
- نقل 180 ميكرولتر من المحللة للبرودة الجليد 1.5 مل أنابيب microfuge التي تحتوي على 130 ميكرولتر من العازلة تحلل و 25 ميكرولتر PAK-تخمةathione الخرز الاغاروز 10. إبقاء المحللة الخام المتبقية في -20 درجة مئوية لمدة فصل هلام لاحق.
- القبض على Rac1 نشطة على حبات الاغاروز PAK-الجلوتاثيون عن طريق تناوب الأنابيب لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- حصاد الاغاروز حبة تقارن بواسطة الطرد المركزي عند 2000 × ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تغسل حبة ثلاث مرات تقارن مع 500 العازلة ميكروليتر تحلل، حصاد حبات بواسطة الطرد المركزي في ز 2000x وطاف رميه بعد كل غسيل. إزالة بعناية أي غسيل تحلل ما تبقى العازلة مع ماصة 200 ميكروليتر.
- أزل كل عينة من خلال إضافة 35 ميكرولتر العازلة تحميل SDS-PAGE واحتضانها في 85 درجة مئوية في حرارة كتلة تهتز لمدة 5 دقائق. إزالة حبات بواسطة الطرد المركزي في 21000 × ز لمدة 1 دقيقة.
- حل شطافة حبة بواسطة SDS-PAGE، ونقل إلى النيتروسليلوز ودقق في Rac1.
6. ممثل النتائج
في هذا البروتوكول وصفنا للتحريض وصمة عار vinculinإد الالتصاقات البؤرية وRac1 نشاط بواسطة الموجات فوق الصوتية. وتشارك في التجربة التصاق التنسيق، والموقف الأساسي هو أن الخلايا الليفية تنتشر على يجند من 5 α β 1-إنتغرين لا تشكل vinculin المحتوية على الالتصاقات (الشكل 3A) ما لم مستقبلات فبرونيكتين الثانية، syndecan-4، وذلك إضافة قابل للذوبان يجند (الشكل 3B) 3،4. ومع ذلك، والتحفيز مع الموجات فوق الصوتية يؤدي الى التنسيق تشكيل الالتصاق بالقدر نفسه كما إشراك syndecan-4 (الشكل 3C)، مشيرا إلى أن التحفيز الموجات فوق الصوتية يمكن أن تكون بديلا عن مكونات معينة من مسار الإشارات فبرونيكتين التي تعتمد على 5. العقبة الرئيسية لهذا البروتوكول، والقضاء على التنسيق تشكيل التصاق في حالة عدم وجود المنشطات. وكبت غير مكتملة من تخليق البروتين بواسطة سيكلوهيكسيميد السماح ترسب مصفوفة غير كافية للحصول على الخلايا لتحفيز صناعة السيارات. ويمكن للخلايا اكتظاظ يؤدي أيضا إلى انخفاض مستوى التشكل التصاق التنسيقوسوف ن وضعف الاستجابة إلى الموجات فوق الصوتية والحديث المتبادل بين خلية خلية خلية والاتصالات مصفوفة تعقيد التجربة التي تهدف الى عزل حافز واحد. كما تطور من الفحص الأساسية نظهر نفس التجربة، مع تكرار الليفية تفتقر syndecan-4 (الشكل 4). هذه الخلايا الليفية لا تزال تستجيب لبالموجات فوق الصوتية (الشكل 4C)، ولكن لا تستجيب للsyndecan-4 يجند (الشكل 4B). التجربة باستخدام Sdc4 - / - الليفية يدل على أن الموجات فوق الصوتية يمكن تجاوز بالفعل الحاجة لمستقبلات فبرونيكتين معينة، ويوضح كيف يمكن تطوير بروتوكول بسيط للحصول على معلومات إضافية حول مسار الإشارات.
للتجربة البيوكيميائية علينا أن نبرهن على الموجات فوق الصوتية يمكن أن تحفز تفعيل Rac1، وذلك باستخدام الفحص المنسدلة الذي هو التكيف للطريقة التي وصفها ديل بوزو وآخرون 10. شركة. هطول الأمطار من Rac1 نشط 0، 10 و 30 و 60 دقيقة بعد INItiation من التحفيز الموجات فوق الصوتية تكشف عن أن القمم نشاط Rac1 في 10-30 دقيقة، قبل أن تعود إلى خط الأساس (الشكل 5). النشاف lysates الخام vinculin يضمن تحميل أي ما يعادل ما بين نقاط الوقت. النتيجة يشبه تفعيل Rac1 بواسطة إشراك syndecan-4 3، ولكن قليلا أكثر مطولة من التنشيط بواسطة فبرونيكتين. ولذلك عادة ما تكون مطلوبة لتحقيق 8-10 تكرار بيانات هامة. تفعيل Rac1 هي المسؤولة عن التزام من الخلايا لتكوين الالتصاق التنسيق، والالتصاقات البؤرية الوليدة يبدأ بتشكيل في 10-30 دقيقة، وبالتزامن مع Rac1 التنشيط. بدأت مرة واحدة، وسوف تستمر هذه الالتصاقات إلى أن تنضج في لويحات التصاق كبير هو مبين في أرقام 3 و 4.
الشكل 1. وشكل موجة الموجات فوق الصوتية. الموجات فوق الصوتية يتألف من 1،5 ميغاهيرتز متقطعة إشارة إلى أنه نظرا لسعة منخفضة (30 ميجاوات / سم <سوب> 2، متوسط المكاني، ومتوسط الزمانية) ليس له أي تأثير التسخين.
الشكل 2. تمثيل تخطيطي لسير العمل لإعداد وتنشيط الخلايا مع الموجات فوق الصوتية.
الشكل 3. الحث الموجات فوق الصوتية لتشكيل التصاق تنسيق في الخلايا الليفية. وانتشرت الخلايا الليفية على شظية إنتغرين ملزم من فبرونيكتين (A) قبل التحفيز مع جزء syndecan-4-ملزم من فبرونيكتين (B) أو الموجات فوق الصوتية (C). بعد 60 دقيقة من التحفيز، تم إصلاح الخلايا، لطخت vinculin والأكتين، وتصويرها بواسطة epifluorescence. شريط = 10 ميكرون.
الشكل 4. الحث الموجات فوق الصوتية لتشكيل التصاق تنسيق في الخلايا الليفية تفتقر syndecan-4.
الشكل 5. تفعيل Rac1 بواسطة الموجات فوق الصوتية. وقد حفز الخلايا لدقائق 0، 10، 30 و 60 مع 6 الآبار المستخدمة في نقطة زمنية. وكانت كمية الحالي Rac1 GTP في عينات من Rac1 المنسدلة فحص دوام تصور من قبل حضانة مع المضادة للRac1 الأضداد على لطخة غربية (الصورة العليا). يكشف زيادة الكمي لشدة الموجات (متوسط من 8-10 مكررات) Rac1 1ctivity الناتجة عن إشارة الموجات فوق الصوتية في 10 و 30 دقيقة، قبل أن يعود إلى مستويات خط الأساس في 60 دقيقة (الرسم البياني). أشرطة الخطأ تمثل ووزارة شؤون المرأة
Discussion
في هذا البروتوكول وصفنا الطريقة التي يمكن استخدامها لعلاج الذي يتم تطبيقه عادة للمرضى الإنسان في الخلية المستندة إلى التجارب. والهدف النهائي هو لفهم الآلية الجزيئية للعمل الموجات فوق الصوتية بحيث يمكن أن يتم تكريره في العلاج. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) كنموذج نظام الخلية، ولكن لم يتم العثور على الموجات فوق الصوتية أيضا أن تكون فعالة في الخلايا الليفية الأولية القلفة الإنسان 5، والخلايا الجذعية الوسيطة، وبانيات غضروفية 6. نحن نستخدم Rac1 تفعيل باعتباره فحص سبيل المثال الكيمياء الحيوية، ولكن يمكن استخدام أسلوب بالتساوي لاختبار تنظيم الفسفرة البروتين أو تشكيل مجمعات البروتين بواسطة مناعي. للمثال مناعي نظهر تأثير الموجات فوق الصوتية على تشكيل التصاق التنسيق، ولكن يمكن دراسة إعادة توزيع أي جزيء. على سبيل المثال، يمكن للمرء اختبار توظيف العوامل عصاري خلوي إلى غشاء البلازما، colocalisation من المتواجدالإضافية في الحويصلات الاتجار أو دراسة تأثير الموجات فوق الصوتية في منظمة مغزل الإنقسامية. حتى الآن لم يقتصر أنفسنا لاختبار فبرونيكتين التي تعتمد على المسارات، وذلك من تأثير الموجات فوق الصوتية على الخلايا على الكولاجين، أو في وجود عوامل النمو يمكن اختبار لبناء صورة لكيفية الموجات فوق الصوتية يؤثر على سلوك الخلية في بيئة معقدة أكثر يشبه وضعا في الجسم الحي. وسوف يكون أكبر تحد لاختبار تأثير الموجات فوق الصوتية باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير، حيث وجود باعث عرقلة مسار الضوء والاهتزازات من العقبات الموجات فوق الصوتية الحالي فنية إضافية. ومع ذلك، فإن حقيقة أن تطبيق العلاج يتطلب 20 دقيقة فقط في اليوم الواحد من التحفيز يشير إلى أن تحليل سلوك الخلية بعد موجة من التحفيز قد تكون مثمرة.
Disclosures
أندرو هاريسون هو موظف في شركة سميث ونفيو المحدودة في المملكة المتحدة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل منحة ويلكوم ترست 088419 إلى MDB ورعايته من قبل سميث ونفيو المحدودة في المملكة المتحدة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
References
- Bass, M. D. A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis. Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).
- Echtermeyer, F. Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4. J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).
- Bass, M. D. Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix. J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).
- Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments. Embo. J. 5, 665-670 (1986).
- Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1. J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).
- Claes, L., Willie, B. The enhancement of bone regeneration by ultrasound. Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).
- Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound. J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).
- Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study. J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).
- Danen, E. H. Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1. J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).
- Makarem, R. Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1. J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).
