Induksjon av adhesjonsmolekylhemmer avhengige signaler ved hjelp Lav-intensitet ultralyd

Summary

Denne protokollen beskriver stimulering av kultiverte fibroblaster med lav intensitet pulserende ultralyd, som driver fokal heft formasjon og Rac1 aktivisering ved å etterligne engasjement transmembrane matrisen reseptor, syndecan-4. Denne tilnærmingen gjør at etterforskningen av en vellykket klinisk teknikk på cellenivå, og dermed gi muligheter for videreutvikling av terapi.

Abstract

I flercellede organismer, er celle atferd diktert av interaksjoner med ekstracellulær matrix. Konsekvenser av matrix-engasjement spenner fra regulering av celle migrasjon og spredning, til sekresjon og selv differensiering. Signalene underliggende hver av disse komplekse prosesser oppstå fra de molekylære interaksjoner av ekstracellulær matrix reseptorer på overflaten av cellen. Integriner er prototypic reseptorene og gir en mekanisk kobling mellom ekstracellulær matriks og cytoskjelettet, samt initiere noen av heft-avhengige signalveier kaskader. Men det er stadig tydeligere at ytterligere transmembrane reseptorer fungere sammen med de integriner å regulere både integrin selv og signaler nedstrøms. Den mest elegante av disse eksemplene er det transmembrane proteoglykan, syndecan-4, som samarbeider med α ₅ β _1-integrin i løpet av vedheft til fibronectin. In vivo modeller demonstrspiste viktigheten av syndecan-4 signalering, som syndecan-4-knockout mus viser healing utviklingshemning på grunn av ineffektiv fibroblast migrasjon ^1,2. I vill type dyr, er migrasjon av fibroblaster mot en såret utløst av utseendet fibronectin at lekkasjer fra skadede blodkar og blir avsatt av makrofager i skadde vevet. Derfor er det stor interesse i å finne strategier som forbedrer fibronectin-avhengige signalering og kunne akselerere reparasjonsprosesser.

De integrin-medierte og syndecan-4-mediert komponenter av fibronectin-avhengige signalering kan separeres ved å stimulere celler med rekombinant fibronectin fragmenter. Selv integrin engasjement er viktig for celle adhesjon, visse fibronectin-avhengige signaler regulert av syndecan-4. Syndecan-4 aktiverer Rac1 protrusive signal ^3, fører integrin ^en omfordeling, utløser rekruttering av cytoskeletal molekyler, slik som vinculin, til fokalsammenvoksninger ^4, og dermed induserer retningsbestemt migrasjon ^tre. Vi har sett etter alternative strategier for å aktivere slike signaler, og fant at lav intensitet pulset ultralyd (LIPUS) kan etterligne effekten av syndecan-4 engasjement ^fem. I denne protokollen beskriver vi metoden som 30 mW / cm ^2, 1,5 MHz ultralyd, pulset ved 1 kHz (Fig. 1) kan brukes til fibroblaster i kultur (Fig. 2) for å indusere Rac1 aktivering og fokal heft formasjon. Ultralyd stimulering er søkt om maksimalt 20 minutter, da denne kombinasjonen av parametre har blitt funnet å være mest effektivt for akselerasjon av klinisk brudd reparasjon ^seks. Metoden bruker rekombinante fibronectin fragmenter å engasjere α ₅ β _1-integrin, uten engasjement av syndecan-4, og krever hemming av proteinsyntesen ved cycloheximid å blokkere deponering av ytterligere matrise av fibroblaster., Den positive effekten of ultralyd på reparasjonsmekanismene er godt dokumentert ^7,8, og ved å forstå den molekylære virkningen av ultralyd i kultur bør vi være i stand til å avgrense den terapeutiske teknikken for å forbedre kliniske utfall.

Protocol

1. Coating Overflater med Matrix Ligand

1. Ultralyd vil bli brukt på celler i 3,5-cm brønner, enten som individuelle retter eller som en seks-brønns plate. For biokjemiske analyser, frakk ligand direkte på plast. For immunfluorescens, Dekkglass koke glass tre ganger i MilliQ vann og plass 4 Dekkglass inn i bunnen av hver brønn.
2. Glassflater må være derivatized å sikre effektiv ligand belegg. Løs sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester i PBS på 1 mm. Tilsett 2 ml til hver brønn og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur.
3. Vask derivatized flater 3 ganger med PBS.
4. Coat enten derivatized glass eller ubehandlet plast med integrin ligand. Påfør 2 ml av 10 ug / ml integrin ligand9, oppløst i PBS inneholder Ca ^{2 +} og Mg ^{2 +} i hver brønn og inkuber natten ved 4 ° C.
5. Forbered monoparticulate BSA ved oppvarming 1% BSA, oppløst i PBS, til 85 ° C i 13 minutter. Tillatavkjøles og deretter passerer gjennom et 0,45-mikrometer filter.
6. Vask ligand-belagte overflater 3 ganger med PBS og blokk med monoparticulate BSA i 30 minutter.

2. Utarbeidelse av celler

1. For å kontrollere matrisen miljøet gjennom hele eksperimentet, bør proteinsyntesen blokkeres ved tilsetting av 25 mikrogram / ml cycloheximid til 80% konfluent fibroblaster i 2 timer.
2. Skyll cycloheximid-behandlede celler med PBS og løsner fra kultur kolben med 0,5 mg / ml trypsin / EDTA.
3. Harvests frittliggende cellene ved sentrifugering ved 500x g i 5 minutter.
4. Resuspender celler i DMEM/25 mm HEPES, 25 mikrogram / ml cycloheximid.
5. Telle celle tetthet av suspensjonen med en haemocytometer og fortynn til 105 ml-1.
6. Inkuber cellene ved 37 ° C i 20 minutter for å gjenopprette overflaten integrin.
7. Skyll ligand-belagt, BSA-blokkerte brønner 3 ganger med PBS.
8. Seed 2 ml av cellesuspensjon i hver brønn.
9. Allow celler til spredning for 2 timer ved 37 ° C, 5% CO _2.

3. Ultralyd Stimulering

1. Varm ultralyd emitter matrisen og kopling gel til 37 ° C.
2. Påfør en ert størrelse blob av kopling gel til hver emitter.
3. Test at hver emitter er funksjonelt å bruke en ultralyd indikator diode detektor.
4. Plasser brønner på emitter array. Tilbake array til 37 ° C, 5% CO ₂ og la temperaturen stabilisere seg i 10 minutter.
5. Slå på ultralyd signal.
6. Ultralyd signalet vil deaktivere etter 20 minutter, hermet den terapeutiske regimet. Dersom kortere stimulering ganger er nødvendig, bør platene fjernes fra tabellen på riktig tidspunkt-poeng. I alle tilfeller bruke unstimulated plater som negativ kontroll.

4. Focal Heft Analyse av Immunfluorescens

1. For analyse av fokal vedheft formasjon, gjelder det 20-minutters ultralyd signalog deretter la strukturer for å utvikle ytterligere 40 minutter ved å opprettholde cellene ved 37 ° C, 5% CO _2.
2. Aspirer media og fikse celler ved å bruke 2 ml 4% paraformaldehyde i PBS. Inkuber i 14 minutter ved romtemperatur.
3. Aspirer paraformaldehyde og skyll tre ganger med PBS, bruk av PBS forsiktig ned kanten av brønnen for å unngå generasjon av skjærkrefter.
4. Overfør hver dekkglass fra den 3,5 cm godt til en 24-brønns plate for påfølgende immunofluorescent farging.
5. Slukk residual paraformaldehyde ved å bruke 0,5 ml 0,1 M glysin i PBS til hver av de 24 brønner. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
6. Aspirer glysin og skyll tre ganger med PBS.
7. Permeabilise celler ved å bruke 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) i PBS. Inkuber i 4 minutter ved romtemperatur.
8. Aspirer Triton X-100 og skyll tre ganger med PBS.
9. Blokker ved å bruke 0,5 ml 3% (w / v) BSA i PBS. Inkuber over natten ved 4 & df.eks; C.
10. Flekk vinculin-inneholder brennvidde heft med hVIN-1 antistoff fortynnes 1:400 i BSA blokk. Inkuber en time ved romtemperatur.
11. Skyll tre ganger med PBS.
12. Påfør fluoroforen (DyLight 488)-konjugert sekundært antistoff (utvannet 1:200) og beis aktin med TRITC-konjugert phalloidin (fortynnet 1:200) i BSA blokk. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
13. Skyll tre ganger med PBS, og en gang med vann.
14. Monter på en glass-slide i en invertert posisjon ved hjelp Forleng Gold mountant.

5. Kvantifisering av Rac1 Aktivering av Pull-down Assay

1. For analyse av Rac1 aktivering, bruke 20 minutter ultralyd signal til cellene ved 37 ° C, 5% CO _2. Ved vurderingen responstid lengre enn 20 minutter, bruke ultralyd signal i 20 minutter og vedlikeholde celler ved 37 ° C, 5% CO ₂ for gjenværende tid til å la responsen å utvikle.
2. Sug media og plass i gods på is. Skyll brønner med 2 ml kald PBS og aspirer. Sikre eventuelle gjenværende PBS fjernes ved å forlate brønner på skrå i 1 minutt etterfulgt av grundig aspirasjon.
3. Lyse cellene på is med 35 mL lysis buffer (10% glyserol, 20 mm Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Sodium deoxycholate, 4 mm EGTA, 4 mm EDTA, 1 × komplett proteasehemmer) per brønn. I dette eksemplet er 6 brønner brukt per tidspunkt for å generere 210 mL av celle lysate. Flere eller færre brønner kan brukes, men totalt lysate volum bør utgjøre ~ 200 mL.
4. Scrape celler grundig med celle scraper å sikre fullstendig cellelyse og la brønner på skrå i 1 minutt å tillate lysate til bassenget.
5. Overfør lysate til en iskald 1,5 ml microfuge tube (pooling lysates fra samme behandling regime) og spinn på 21 000 × g for 2 minutter ved 4 ° C til pellet mobilnettet rusk.
6. Overføring 180 mL av lysate til iskald 1,5 ml microfuge rør som inneholder 130 mL av lysis buffer og 25 mL PAK-glutathione agarose perler ^10. Hold gjenværende olje lysate ved -20 ° C for påfølgende gel separasjon.
7. Capture aktiv Rac1 på PAK-glutation agarose perler ved å rotere rør i 40 minutter ved 4 ° C.
8. Harvest-agarose perle konjugater ved sentrifugering ved 2000 × g i 1 minutt ved 4 ° C.
9. Vask perle konjugater tre ganger med 500 mL lysis buffer, høsting perler ved sentrifugering på 2000x g og forkaster supernatant etter hver vask. Fjern forsiktig eventuelle gjenværende lysis vaskebuffer med en 200 mL pipette.
10. Eluer hver prøve ved å legge til 35 mL SDS-PAGE lasting buffer og inkuberes ved 85 ° C på en skjelvende varme blokk i 5 minutter. Fjern perler ved sentrifugering på 21 000 × g for 1 minutt.
11. Løse perle eluatet med SDS-PAGE, overføre til nitrocellulose og probe for Rac1.

6. Representative Resultater

I denne protokollen beskriver vi induksjon av vinculin-flekkened fokale sammenvoksninger og Rac1 aktivitet ved ultralyd. For det sentrale vedheft eksperimentet, er den opprinnelige posisjonen som fibroblaster spredt på en ligand av α ₅ β _1-integrin ikke danner vinculin som inneholder sammenvoksninger (Fig. 3A) med mindre en andre fibronectin reseptor, syndecan-4, er engasjert ved tilsetting av løselig ligand (Fig. 3B) ^3,4. Men induserer stimulering med ultralyd fokale vedheft formasjon i samme grad som engasjement av syndecan-4 (Fig. 3C), som indikerer at ultralyd stimulering kan erstatte visse komponenter av fibronectin-avhengige signalveien ^5. Nøkkelen hinderet med denne protokollen er å eliminere fokale heft formasjon i fravær av sentralstimulerende. Ufullstendig hemming av proteinsyntesen ved cycloheximid vil tillate matrise nedfall som er tilstrekkelig for cellene til auto-stimulere. Overbefolkning av celler kan også føre til lav-nivå brennvidde heft formation og dårlig respons på ultralyd som crosstalk mellom celle-celle og celle-matrise kontaktene vil komplisere et eksperiment som er utformet for å isolere en enkelt stimulus. Som en utvikling av den grunnleggende analysen viser vi den samme eksperiment, gjentatt med fibroblaster mangler syndecan-4 (Fig. 4). Disse fibroblaster fortsatt svare på ultralyd (Fig. 4C), men mislykkes i å svare på syndecan-4 ligand (Fig. 4B). Eksperimentet med Sdc4 - / - fibroblaster viser at ultralyd kan faktisk omgå behovet for visse fibronectin reseptorer, og illustrerer hvordan enkel protokoll kan utvikles til å få ekstra informasjon om signalveien.

For den biokjemiske eksperimentet viser vi at ultralyd kan indusere aktivering av Rac1, ved hjelp av en rullegardin analysen som er en tilpasning av metoden beskrevet av Del Pozo et al. ^Ti. Nedbør av aktiv 0 Rac1, 10, 30 og 60 minutter etter initiation av ultralyd stimulering avslører at Rac1 aktivitet topper på 10-30 minutter, før retur til grunnlinjen (Fig. 5). Blotting råolje lysates for vinculin sikrer tilsvarende lasting mellom tidspunkter. Resultatet ligner aktivering av Rac1 ved engasjement av syndecan-4 ^3, men er litt mer langvarig enn aktivering av fibronectin. Derfor 8-10 repetisjoner er vanligvis nødvendig for å oppnå betydelige data. Aktivering av Rac1 er ansvarlig for engasjement av celler til fokal heft formasjon, og begynnende fokale adhesions begynner å dannes på 10-30 minutter, som sammenfaller med Rac1 aktivering. Når startet, vil disse sammenvoksninger fortsette å modnes inn i de store vedheft plaketter vist i figur 3 og 4.

Figur 1. Ultralyden bølgen form. Ultralyd består en periodisk 1,5 MHz signal at på grunn av lav amplitude (30 mW / cm <sup> 2, har romlig gjennomsnitt temporal gjennomsnitt) ingen varmeeffekt.

Figur 2. Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten for utarbeidelse og stimulering av celler med ultralyd.

Figur 3. Ultralyd induksjon av fokal vedheft formasjon i fibroblaster. Fibroblaster ble spredt på integrin-bindende fragment av fibronectin (A) før stimulering med syndecan-4-binding fragment av fibronectin (B) eller ultralyd (C). Etter 60 minutters stimulering ble cellene fast, farget for vinculin og aktin, og avbildes ved epifluorescence. Bar = 10 mikrometer.

Figur 4. Ultralyd induksjon av fokal vedheft formasjon i fibroblaster mangler syndecan-4. Sdc4 - / - fibroblaster var fibronectin-ufølsom, ultralyd fortsatt induserte fokal vedheft formasjon, noe som indikerer at ultralyd omgår matrise reseptoren engasjement. Bar = 10 mikrometer.

Figur 5. Aktivering av Rac1 av ultralyd. Celler ble stimulert for 0, 10, 30 og 60 minutter med 6 brønner som brukes per tidspunkt. Mengden GTP-Rac1 tilstede i prøver fra en Rac1 pull-down analysen tidsforløpet ble visualisert ved inkubasjon med anti-Rac1 antistoff på en Western Blot (øverst bilde). Kvantifisering av bandet intensiteten (gjennomsnitt på 8-10 replikat) avslører økt Rac1 enctivity følge av ultralyd signal på 10 og 30 minutter, før han returnerte til baseline nivå på 60 minutter (graf). Feilfelt representerer sem

Discussion

I denne protokollen beskriver vi metoden som en behandling som normalt brukes på menneskelige pasienter kan brukes i celle-baserte eksperimenter. Det ultimate målet er å forstå den molekylære mekanismen av ultralyd handling, slik at behandlingen kan forbedres. I denne protokollen, bruker vi mus embryonale fibroblaster (MEFs) som en modell celle system, men ultralyd er også blitt funnet å være effektiv i primære humane foreskin fibroblaster ^5, stamceller og osteoblaster og chondrocytes ^6. Vi bruker Rac1 aktivering som et eksempel biokjemiske analysen, men metoden kan brukes like å teste regulering av protein fosforylering eller dannelse av protein komplekser med immunoprecipitation. For immunofluorescent eksempel viser vi en effekt ultralyd på fokal vedheft formasjon, men omfordeling av alle molekyl kunne bli undersøkt. For eksempel kan en teste rekruttering av cytosoliske faktorer til plasma membran, colocalisation av Proteins i smugling blemmer eller undersøke effekten av ultralyd på mitotisk spindel organisasjon. Så langt har vi begrenset oss til å teste fibronectin-avhengige veier, av effekten av ultralyd på celler på kollagen, eller i nærvær av vekstfaktorer kan bli testet for å bygge opp et bilde av hvordan ultralyd påvirker celle atferd i et komplekst miljø som mer ligner en in vivo situasjon. En større utfordring vil være å teste effekten av ultralyd ved hjelp av time-lapse imaging, der tilstedeværelse av emitter blokkerer lyset banen og vibrasjoner fra ultralyd presentere ytterligere tekniske hindringer. Imidlertid tyder det faktum at terapeutisk anvendelse krever bare 20 minutter av stimulering per dag at analyse av celle atferd etter et utbrudd av stimulering kan godt være produktiv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester	Fisher Scientific	PN22312	25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C
6-well tissue culture plate	Corning	3516	Plastic from other companies can coat poorly
13-mm glass coverslip	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3336	Glass from other companies can coat poorly
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
PBS, Ca2+ Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662
50K integrin ligand (fibronectin fragment)			Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698	Can be stored as 10mg/ml stock in water
DMEM/25 mM HEPES	Sigma-Aldrich	D6171
Exogen 4000+	Smith & Nephew Inc.
Ultrasound coupling gel	Smith & Nephew Inc.
SAFHS indicator	Smith & Nephew Inc.
hVIN-1	Sigma-Aldrich	V9264
DyLight 488-conjugated anti-mouse	Stratagene, Agilent Technologies	715-485-150
TRITC-labelled phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930
cOmplete protease inhibitor (EDTA free)	Roche Group	056 489 001	100× stock made up from tablet stored at -20°C
PAK-glutathione agarose beads			Construct description and preparation in 10
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Make 1M stock and pH to 7.4
NaCl	Fisher Scientific	S/0160/65
NP40	Sigma-Aldrich	I3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134