Summary
Este protocolo descreve a estimulação da cultura de fibroblastos de baixa intensidade, com ultra-sons pulsada, que impulsiona a formação de adesão focal e Rac1 activação imitando acoplamento do receptor de matriz transmembranar, sindecam-4. Esta abordagem permite a investigação de uma técnica de sucesso clínico no nível celular, proporcionando assim as oportunidades de refinamento da terapia.
Abstract
Em organismos multicelulares, o comportamento das células é ditada por interacções com a matriz extracelular. Consequências da matriz engajamento alcance da regulação da migração e proliferação celular, a secreção e até mesmo a diferenciação. Os sinais subjacentes cada um destes processos complexos surgem a partir das interacções moleculares dos receptores da matriz extracelular sobre a superfície da célula. As integrinas são os receptores prototípicos e fornecer uma ligação mecânica entre a matriz extracelular e do citoesqueleto, bem como o início de alguns dos cascatas de adesão dependente de sinalização. No entanto, está se tornando cada vez mais evidente que os receptores transmembrana adicionais funcionar juntamente com as integrinas para regular tanto a integrina a si mesmo e sinais a jusante. O mais elegante destes exemplos é o proteoglicano transmembranar, sindecam-4, que coopera com α β 5 1-integrina durante a adesão a fibronectina. Modelos in vivo demonstrcomeu a importância da sindecam-4 de sinalização, como sindecam-4 mata-mata-ratos apresentam retardo de cicatrização devido à migração de fibroblastos 1,2 ineficiente. Em animais de tipo selvagem, a migração de fibroblastos em relação uma ferida é desencadeada pelo aparecimento de fibronectina que fugas a partir de capilares danificado e é depositado por macrófagos em tecido lesionado. Portanto, há grande interesse em descobrir estratégias que aumentam a fibronectina dependentes de sinalização e poderia acelerar processos de reparação.
Os componentes integrina mediadas e sindecam-4-mediada de fibronectina dependentes de sinalização podem ser separados por células estimulantes com fragmentos fibronectina recombinantes. Embora acoplamento integrina é essencial para a adesão celular, certos fibronectina dependentes de sinais são regulados por sindecam-4. Sindecam-4 activa o sinal Rac1 protrusiva 3, faz com que a integrina redistribuição 1, os gatilhos recrutamento de moléculas do citoesqueleto, tais como vinculina, para focaladerências 4, induzindo assim a migração direcional 3. Nós olhamos para estratégias alternativas para a ativação de tais sinais e descobriu que de baixa intensidade ultra-som pulsado (LIPUS) podem imitar os efeitos da sindecam-4 engajamento 5. Neste protocolo, descrevemos o método através do qual 30 mW / cm 2, 1,5 ultra-som MHz, pulsado a 1 kHz (Fig. 1) pode ser aplicado a fibroblastos em cultura (Fig. 2) para induzir activação Rac1 e formação de adesão focal. A estimulação de ultra-som é aplicada a um máximo de 20 minutos, como esta combinação de parâmetros, foi encontrada a ser mais eficaz para a aceleração da reparação de fracturas clínica 6. O método utiliza fragmentos recombinantes de fibronectina para envolver α β 5 1-integrina, sem envolvimento do sindecam-4, e requer a inibição da síntese de proteínas por cicloheximida para bloquear deposição de matriz adicional pelos fibroblastos., O efeito positivo of ultra-som sobre os mecanismos de reparo é bem documentada 7,8, e compreendendo o efeito molecular do ultra-som na cultura que deve ser capaz de refinar a técnica terapêutica para melhorar os resultados clínicos.
Protocol
1. As superfícies de revestimento com o ligando Matrix
- O ultra-som será aplicado a células em 3,5 cm de poços, quer como pratos individuais ou como uma placa de 6 poços. Para ensaios bioquímicos ligando revestimento, directamente sobre o plástico. Para imunofluorescência, vidro fervura lamelas três vezes em água e MilliQ lugar 4 lamelas para o fundo de cada poço.
- As superfícies de vidro deve ser derivatizados para assegurar revestimento ligante eficiente. Dissolver sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide éster em PBS a 1 mM. Adicionar 2 ml a cada poço e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Lave as superfícies derivatizados 3 vezes com PBS.
- Casaco, quer de vidro ou de plástico não tratada derivatizado com o ligando de integrina. Aplicar 2 ml de 10 ug / ml integrina ligand9, dissolvido em PBS contendo Ca 2 + e Mg 2 + a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C.
- Preparar monoparticulate BSA por aquecimento BSA a 1%, dissolvido em PBS, a 85 ° C durante 13 minutos. Permitirarrefecer e então passar através de um filtro de 0,45 mícrons.
- Lavar-ligando superfícies revestidas com 3 vezes com PBS e bloqueio com BSA a monoparticulate durante 30 minutos.
2. Preparação de Células
- Para controlar o ambiente da matriz ao longo da experiência, a síntese de proteína deve ser bloqueada por adição de 25 cicloheximida ug / ml a 80% confluentes de fibroblastos durante 2 horas.
- Lavar cicloheximida células tratadas com PBS e destacar do frasco de cultura utilizando 0,5 mg / ml de tripsina / EDTA.
- As células destacadas de colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 minutos.
- Ressuspender as células em DMEM/25 mM de HEPES, 25 ug / ml cicloheximida.
- Contar densidade celular da suspensão usando um hemocitómetro e diluir até 105 ml-1.
- Incubar as células a 37 ° C durante 20 minutos para recuperar a integrina de superfície.
- Enxaguar o ligando-revestido, BSA-bloqueados poços 3 vezes com PBS.
- Ml de sementes 2 da suspensão de células em cada poço.
- Allocélulas w para espalhar durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
3. Estimulação ultra-som
- Aqueceu-se a matriz emissor de ultra-som e gel de acoplamento para 37 ° C.
- Aplique uma gota do tamanho de ervilha de acoplamento gel para cada emissor.
- Teste que cada emissor é funcional usando um detector de ultra-som diodo indicador.
- Colocar os poços na matriz emissor. Retornar matriz para 37 ° C, 5% de CO 2 a temperatura e deixa-se equilibrar durante 10 minutos.
- Ligue o sinal de ultra-som.
- O sinal de ultra-som desactivará após 20 minutos, imitando o regime terapêutico. Se os tempos mais curtos de estimulação são necessárias, as chapas devem ser removidos da matriz no momento apropriado de pontos. Em todos os casos usar não estimulada placas, como controlo negativo.
4. Análise de Adesão Focal por imunofluorescência
- Para a análise de formação de adesão focal, aplicar o sinal de ultra-som 20 minutose então permitir que as estruturas para desenvolver durante mais 40 minutos, mantendo as células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Aspirar meios de comunicação e fixar as células mediante a aplicação de 2 ml de paraformaldeído a 4% em PBS. Incubar durante 14 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar paraformaldeído e lavar três vezes com PBS, aplicando o PBS suavemente para baixo da borda do poço para evitar a geração de forças de cisalhamento.
- Transfira cada lamela a partir dos 3,5 cm bem a uma placa de 24 cavidades para a coloração de imunofluorescência subsequente.
- Têmpera paraformaldeído residual mediante a aplicação de 0,5 ml 0,1 M glicina em PBS a cada um dos 24 poços. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirado glicina e enxaguar três vezes com PBS.
- Permeabilise células mediante a aplicação de 0,5 ml de Triton 0,5% X-100 (w / v) em PBS. Incubar durante 4 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirado Triton X-100 e enxaguar três vezes com PBS.
- Bloquear mediante a aplicação de 0,5 ml de 3% (w / v) de BSA em PBS. Incubar durante uma noite a 4 & dpor exemplo; C.
- Stain vinculina contendo adesão focal com hVIN-1 anticorpo diluído 1:400 em bloco de BSA. Incubar durante uma hora à temperatura ambiente.
- Lavar três vezes com PBS.
- Aplicar fluoróforo (DyLight 488) anticorpo secundário conjugado (diluído 1:200) e actina mancha com TRITC-faloidin conjugado (diluído 1:200) no bloco de BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Lavar três vezes com PBS, e uma vez com água.
- Montar em uma lâmina de vidro em uma posição invertida usando Prolongar montagem Gold.
5. Quantificação de Rac1 Ativação por Pull-down Ensaio
- Para a análise de Rac1 activação, aplicar o sinal de ultra-som de 20 minutos para as células a 37 ° C, 5% de CO 2. Ao avaliar os tempos de resposta mais longos do que 20 minutos, aplicar o sinal de ultra-som durante 20 minutos e manter as células a 37 ° C, 5% de CO2 durante o tempo restante para permitir que a resposta para se desenvolver.
- Aspirar e mídia local bems em gelo. Lavar os poços com 2 ml de PBS frio e aspirado. Garantir qualquer PBS residual é removido, deixando poços inclinado para 1 minuto, seguido por aspiração completa.
- Lisar as células em gelo com 35 uL de tampão de lise (10% de glicerol, 20 mM de Hepes pH 7,4, 140 mM de NaCl, 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sódio, 4 mM de EGTA, 4 mM de EDTA, 1 × inibidor da protease completa) por poço. Neste exemplo, 6 poços são utilizados por ponto de tempo para gerar uL 210 de lisado de células. Mais poços ou menos podem ser utilizados, mas o volume total deve lisado total de ~ 200 uL.
- Células Scrape cuidadosamente com raspador de células a fim de assegurar a lise das células completas e deixar poços inclinado durante 1 minuto para permitir lisado para a piscina.
- Transferir para um lisado gelada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (pooling lisados a partir de regime de tratamento mesma) e centrifugação a 21.000 xg durante 2 minutos a 4 ° C para sedimentar os restos celulares.
- Transferir 180 uL de lisado de gelada tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 130 ul de tampão de lise e 25 uL PAK-glutpérolas de agarose athione 10. Manter restante lisado bruto a -20 ° C para a separação de gel subsequente.
- Capturar Rac1 activo sobre os grânulos de agarose de glutationa-PAK pela rotação tubos durante 40 minutos a 4 ° C.
- Colheita de agarose grânulo conjugados por centrifugação a 2000 × g durante 1 minuto a 4 ° C.
- Lavagem grânulo conjuga três vezes com 500 uL de tampão de lise, a colheita grânulos por centrifugação a 2000x g sobrenadante e descartando depois de cada lavagem. Cuidadosamente remover qualquer tampão de lavagem restante lise com uma pipeta de 200 uL.
- Eluir cada amostra por adição de 35 uL de tampão de carregamento de SDS-PAGE e incubar a 85 ° C em um bloco de aquecimento com agitação durante 5 minutos. Remover grânulos por centrifugação a 21.000 xg durante 1 minuto.
- Resolver eluato grânulo por SDS-PAGE, transferência para nitrocelulose e sonda para a Rac1.
6. Os resultados representativos
Neste protocolo, descrevemos a indução de vinculina-manchaed adesões focais e Rac1 atividade por ultra-som. Para a experiência de adesão focal, a posição de linha de base é que os fibroblastos, distribuídos sobre um ligando de α β 5 1-integrina não formam vinculina contendo aderências (Fig. 3A), a menos que um receptor de fibronectina em segundo lugar, sindecam-4, está envolvida por adição de ligando solúvel (Fig. 3B) 3,4. No entanto, a estimulação com ultra-som induz a formação de adesão focal para a mesma extensão como acoplamento de sindecam-4 (Fig. 3C), indicando que a estimulação de ultra-som pode substituir determinados componentes da via de sinalização de fibronectina-dependente 5. O principal obstáculo com este protocolo está eliminando a formação de adesão focal na ausência de estimulantes. Inibição da síntese de proteínas incompleta por cicloheximida irá permitir a deposição de matriz que é suficiente para que as células auto-estimular. Superlotação de células pode também conduzir a baixo nível de adesão focal formation e uma má resposta ao ultra-som como crosstalk entre célula-célula e célula-matriz de contatos vai complicar um experimento que foi projetado para isolar um único estímulo. Como um desenvolvimento do ensaio básico que mostram a mesma experiência, repetiu com fibroblastos que faltam sindecam-4 (Fig. 4). Estes fibroblastos ainda respondem aos ultra-sons (Fig. 4C), mas não respondem ao sindecam-4 ligando (Fig. 4B). O experimento utilizando Sdc4 - / - fibroblastos demonstra que o ultrassom pode realmente ignorar a necessidade de receptores de fibronectina certas, e ilustra como o protocolo simples podem ser desenvolvidos para obter informações adicionais sobre a via de sinalização.
Para a experiência bioquímica demonstramos que ultra-som pode induzir activação de Rac1, utilizando um ensaio de pull-down que é uma adaptação do método descrito por Del Pozo et al. 10. Precipitação do activo Rac1 0, 10, 30 e 60 minutos após iniciação de estimulação de ultra-som revela que Rac1 picos de actividade em 10-30 minutos, antes de retornar à linha de base (Fig. 5). Blotting lisados bruto para vinculina garante carregamento equivalente entre os pontos de tempo. O resultado assemelha-se a ativação de Rac1 pelo engajamento de sindecam-4 3, mas é um pouco mais prolongada do que a ativação pela fibronectina. Portanto 8-10 repete são normalmente necessários para a obtenção de dados significativos. Ativação de Rac1 é responsável por compromisso de células para a formação de adesão focal e nascentes adesões focais começam a se formar em 10-30 minutos, coincidindo com Rac1 ativação. Uma vez iniciado, essas aderências continuará a amadurecer em placas de adesão das grandes mostradas nas Figuras 3 e 4.
Figura 1. A forma de onda de ultra-som. O ultra-som é composto por um sinal intermitente 1,5 MHz que, devido à baixa amplitude (30 mW / cm <sup> 2, média espacial, a média temporal) não tem efeito de aquecimento.
Figura 2. Representação esquemática do fluxo de trabalho para preparação e estimulação de células com ultra-som.
Figura 3. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos. Os fibroblastos foram espalhados sobre o fragmento de integrina de ligação da fibronectina (A) antes da estimulação com o fragmento de sindecam-4-a ligação da fibronectina (B) ou de ultra-som (C). Após 60 minutos de estimulação, as células foram fixadas, coradas para vinculina e actina, e fotografada pela epifluorescência. Barra = 10 uM.
Figura 4. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos falta sindecam-4.
Figura 5. Ativação de Rac1 por ultra-som. As células foram estimuladas durante 0, 10, 30 e 60 minutos, com 6 poços utilizados por ponto de tempo. A quantidade de GTP-Rac1 presentes em amostras de um curso de tempo Rac1 pull-down ensaio foi visualizada por incubação com anticorpo anti-Rac1 sobre uma western blot (imagem de cima). Quantificação da intensidade da banda (média de 8-10 repetições) revela aumento Rac1 umctividades resultante a partir do sinal de ultra-som com 10 e 30 minutos, antes de retornar para níveis basais de 60 minutos (gráfico). As barras de erro representam SEM
Discussion
Neste protocolo que descrevem o método pelo qual um tratamento que é normalmente aplicado a pacientes humanos pode ser utilizado em baseados em células experimentos. O objetivo final é entender o mecanismo molecular de ação ultra-som para que a terapia pode ser refinado. Neste protocolo, usamos fibroblastos embrionários (MEFs) como um sistema de célula de modelo, mas ultra-som tem sido também foi encontrado para ser eficaz em primárias fibroblastos de prepúcio humano 5, as células estaminais mesenquimais, osteoblastos e condrócitos 6. Usamos Rac1 activação como um ensaio bioquímico exemplo, mas o método pode ser utilizado igualmente para testar regulação da fosforilação da proteína ou a formação de complexos de proteína por imunoprecipitação. Para o exemplo de imunofluorescência que demonstram um efeito sobre a formação de ultra-som de adesão focal, mas redistribuição de qualquer molécula poderia ser examinado. Por exemplo, pode-se testar o recrutamento de factores citosólicos para a membrana plasmática, colocalisation de proteins em vesículas de tráfico ou examinar o efeito do ultra-som sobre a organização do fuso mitótico. Até agora, confinado-nos a testar fibronectina dependentes de vias, por efeito de ultra-som em células em colagénio, ou na presença de factores de crescimento podem ser testados para construir uma imagem de ultra-som como afecta o comportamento das células em um meio complexo que mais assemelha uma situação in vivo. Um desafio maior será o de testar o efeito de ultra-som usando lapso de tempo de imagem, onde a presença do emissor bloqueando o caminho da luz e vibrações ultra-sons a partir dos presentes adicionais obstáculos técnicos. No entanto, o facto de a aplicação terapêutica requer apenas 20 minutos de estimulação por dia sugere que a análise do comportamento celular após uma explosão de estimulação pode muito bem ser produtivo.
Disclosures
Andrew Harrison é um funcionário da Smith & Nephew UK Limited.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Wellcome Trust 088419 concessão para MDB e patrocínio da Smith & Nephew UK Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
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