Induktion av vidhäftning beroende signaler med hjälp av låg intensitet ultraljud

Summary

Detta protokoll beskriver stimulering av odlade fibroblaster med låg intensitet pulserande ultraljud, som driver fokal adhesion bildning och RAC1 aktivering genom att härma ingrepp transmembrana matrisen receptorn, syndekan-4. Detta tillvägagångssätt gör undersökning av en framgångsrik klinisk teknik på cellnivå, vilket ger möjligheter till förbättring av behandlingen.

Abstract

I multicellulära organismer, är cellbeteende dikteras av interaktioner med den extracellulära matrisen. Konsekvenserna av matris-ingrepp sträcker sig från regleringen av cell-migration och-proliferation, utsöndring och även differentiering. Signalerna ligger var och en av dessa komplexa processer uppstå från de molekylära interaktioner av extracellulära matrix-receptorer på ytan av cellen. Integriner är den prototypiska receptorer och ger en mekanisk koppling mellan extracellulär matrix och cytoskelettet, såväl som att initiera en del av de adhesionsberoende signalkaskader. Emellertid har det blivit alltmer uppenbart att ytterligare transmembranreceptorer fungera parallellt med de integriner att reglera både den integrin självt och signaler nedströms. Den mest eleganta av dessa exempel är den transmembrana proteoglykan, syndekan-4, som samarbetar med α ₅ β _1-integrin under vidhäftning till fibronektin. In vivo-modeller demonstratöreråt vikten av syndekan-4 signalering, som syndekan-4-knockoutmöss uppvisar healing retardation på grund av ineffektiv fibroblast migration ^1,2. I vildtyp djur är migration av fibroblaster mot ett sår triggas av förekomsten av fibronektin som läcker från skadade blodkärl och avsattes genom makrofager i skadad vävnad. Därför finns ett stort intresse för att upptäcka strategier som förbättrar fibronektin-beroende signalering och kan påskynda reparationsprocesser.

Integrin-medierade och syndekan-4-medierad komponenterna i fibronektin-beroende signalering kan separeras genom att stimulera celler med rekombinanta fibronektinfragment. Även integrin engagemang är avgörande för cell adhesion, vissa fibronektin-beroende signaler regleras av syndekan-4. Syndekan-4 aktiverar RAC1 utskjutande signalen ^3, orsakar integrin omfördelning ^1, utlösare rekrytering av cytoskelett-molekyler, såsom vinkulin, till fokalsammanväxningar ^4, och därmed inducerar riktad migration ^3. Vi har sökt alternativa strategier för att aktivera sådana signaler och fann att låg intensitet pulserande ultraljud (LIPUS) kan efterlikna effekterna av syndekan-4 engagemang ^5. I detta protokoll beskriver vi den metod med vilken 30 mW / cm ^2, 1,5 MHz ultraljud, pulserades vid 1 kHz (fig. 1) kan appliceras på fibroblaster i kultur (fig. 2) för att inducera RAC1 aktivering och fokal adhesion formation. Ultraljud stimulering tillämpas för högst 20 minuter, eftersom denna kombination av parametrar har visat sig vara mest effektiva för acceleration av kliniska frakturer reparation ^6. Metoden använder rekombinanta fibronektinfragment att ingripa med α ₅ β _1-integrin, utan ingrepp av syndekan-4, och kräver hämning av proteinsyntes genom cykloheximid för att blockera avsättning av ytterligare matris av fibroblasterna., Den positiva effekten of ultraljud reparationsmekanismer är väl dokumenterat ^7,8 och genom att förstå den molekylära effekten av ultraljud i kultur vi ska kunna förbättra den terapeutiska tekniken för att förbättra de kliniska resultaten.

Protocol

1. Beläggning Ytor med Matrix-ligand

1. Ultraljud kommer att tillämpas på celler i 3,5-cm brunnar, antingen som individuella skålar eller en 6-brunnsplatta. För biokemiska analyser, kappa liganden direkt på plasten. För immunofluorescens, täckglas koka glas tre gånger i MilliQ vatten och placera 4 täckglas i botten av varje brunn.
2. Glasytor måste vara derivatiseras att säkerställa en effektiv ligand beläggning. Lös sulfo-m-maleimidobensoyl-N-hydrosuccinimide ester i PBS vid 1 mM. Tillsätt 2 ml till varje brunn och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
3. Tvätta de derivatiserade ytorna 3 gånger med PBS.
4. Coat antingen derivatiserade glas eller obehandlad plast med integrin ligand. Tillämpas 2 ml 10 pg / ml integrin ligand9, löst i PBS innehållande ^{Ca2 +} och ^{Mg2 +-till} varje brunn och inkubera över natten vid 4 ° C.
5. Framställ monoparticulate BSA genom upphettning 1% BSA, löst i PBS, till 85 ° C under 13 minuter. Tillåtasvalna och sedan passera genom en 0,45 | im filter.
6. Tvätta ligand-belagda ytor 3 gånger med PBS och blockera med monoparticulate BSA under 30 minuter.

2. Beredning av celler

1. Att styra matrisen miljön under hela experimentet, bör proteinsyntes blockeras genom tillsats av 25 | ig / ml cykloheximid till 80% konfluenta fibroblaster under 2 timmar.
2. Skölj cykloheximid-behandlade celler med PBS och lossas från odlingskolven med användning av 0,5 mg / ml trypsin / EDTA.
3. Skörd lösgjorda cellerna genom centrifugering vid 500 X g under 5 minuter.
4. Återsuspendera cellerna i DMEM/25 mM HEPES, 25 | ig / ml cykloheximid.
5. Räkna celltäthet av suspensionen med användning av en hemocytometer och späds till 105 ml-1.
6. Inkubera cellerna vid 37 ° C under 20 minuter för att utvinna yta integrin.
7. Skölj-ligand-belagd, BSA-blockerade brunnarna 3 gånger med PBS.
8. Frö 2 ml av cellsuspensionen i varje brunn.
9. Allow cellerna att kunna spridas i 2 timmar vid 37 ° C, _5% CO2.

3. Ultraljud Stimulering

1. Värm arrayen ultraljud emitter och koppling gel till 37 ° C.
2. Applicera en ärtstora klump av koppling gel till varje sändare.
3. Testa att varje sändare är funktionell med en ultraljud-detektor indikeringsdioden.
4. Placera brunnarna på emittern matrisen. Återgå matris till 37 ° C, _5% CO2 och tillåta temperaturen att jämvikta i 10 minuter.
5. Slå på ultraljudssignalen.
6. Ultraljudssignalen avaktiveras efter 20 minuter, som imiterar den terapeutiska regimen. Om kortare stimulering tider krävs skall tallrikar tas bort från arrayen vid rätt tidpunkt-poäng. I samtliga fall använda ostimulerad plattor som den negativa kontrollen.

4. Focal Adhesion Analys med immunofluorescens

1. För analys av fokal adherensbildning, tillämpa 20-minuters ultraljudssignalenoch sedan låta strukturer för att utveckla under ytterligare 40 minuter med bibehållande celler vid 37 ° C, _5% CO2.
2. Aspirera media och fixera cellerna genom att tillämpa 2 ml 4% paraformaldehyd i PBS. Inkubera under 14 minuter vid rumstemperatur.
3. Aspirera paraformaldehyd och skölj tre gånger med PBS, med tillämpning av PBS försiktigt ner kanten av brunnen för att undvika generering av skjuvkrafter.
4. Överför varje täckglas från 3,5 cm brunn till en 24-brunnsplatta för efterföljande immunfluorescerande färgning.
5. Släcka återstående paraformaldehyd genom applicering 0,5 ml 0,1 M glycin i PBS till varje av de 24 brunnarna. Inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur.
6. Sug glycin och skölj tre gånger med PBS.
7. Permeabilisera celler genom att applicera 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (vikt / volym) i PBS. Inkubera under 4 minuter vid rumstemperatur.
8. Sug Triton X-100 och skölj tre gånger med PBS.
9. Blockera genom applicering 0,5 ml 3% (vikt / volym) BSA i PBS. Inkubera över natten vid 4 & dt.ex., C.
10. Stain vinkulin innehållande fokal adhesion med hVIN-1-antikropp utspädd 1:400 i BSA block. Inkubera under en timme vid rumstemperatur.
11. Skölj tre gånger med PBS.
12. Tillämpas fluorofor (DyLight 488)-konjugerad sekundär antikropp (spädd 1:200) och fläcken aktin med TRITC-falloidin konjugerad (utspädd 1:200) i BSA-block. Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
13. Skölj tre gånger med PBS och en gång med vatten.
14. Montera på en glasskiva i en inverterad position med hjälp Förläng guld monteringsvätska.

5. Kvantifiering av RAC1 Aktivering av Pull-down-analys

1. För analys av RAC1 aktivering, applicera den 20-minuters ultraljudssignalen till celler vid 37 ° C, _5% CO2. Vid bedömning av respons gånger längre än 20 minuter, applicera ultraljud signalen under 20 minuter och bibehålla cellerna vid 37 ° C, _5% CO2 under återstående tid för att tillåta reaktion på att utvecklas.
2. Aspirera media och plats samts på is. Skölj brunnar med 2 ml kall PBS och aspirera. Se till att alla kvarvarande PBS avlägsnas genom att lämna brunnar vinklas för 1 minut följt av noggrann aspiration.
3. Lyserar celler på is med 35 pl lysbuffert (10% glycerol, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxikolat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 x fullständig proteasinhibitor) per brunn. I detta exempel är 6 brunnar användes per tidpunkt för att generera 210 | il av cellysatet. Fler eller färre brunnar kan användas, men den totala lysatet volym bör uppgå ~ 200 | il.
4. Skrapa celler grundligt med cellskrapa för att säkerställa fullständig cell-lys och lämna brunnar lutas i 1 minut för att lysat att slå.
5. Överföra lysatet till en iskall 1,5 ml mikrofugrör (pooling lysat från samma behandlingskur) och centrifugering vid 21 tusen x g under 2 minuter vid 4 ° C för att pelletera cellrester.
6. Överföra 180 pl av lysat till iskall 1,5-ml mikrocentrifugrör innehållande 130 | il lysbuffert och 25 | il PAK-glutathione agarospärlor ^10. Hålla kvar råa lysatet vid -20 ° C för efterföljande gelseparation.
7. Fånga aktiva RAC1 på PAK-glutation-agaroskulor genom att rotera rören under 40 minuter vid 4 ° C.
8. Skörd agaros vulst konjugat genom centrifugering vid 2000 x g under 1 minut vid 4 ° C.
9. Tvätt vulst konjugat tre gånger med 500 pl lysbuffert, skörd pärlorna genom centrifugering vid 2000x g och kasta supernatanten efter varje tvätt. Ta försiktigt bort eventuellt kvarvarande buffert lys tvätta med en 200 ^ pipett.
10. Eluera varje prov genom att tillsätta 35 | il SDS-PAGE-laddningsbuffert och inkubera vid 85 ° C på en skakande värmeblock under 5 minuter. Avlägsna pärlorna genom centrifugering vid 21 tusen x g under 1 minut.
11. Lös vulst eluat med SDS-PAGE, överföring till nitrocellulosa och sonden för RAC1.

6. Representativa resultat

I detta protokoll beskriver vi induktion av vinkulin-fläcked fokala sammanväxningar och RAC1 aktivitet med ultraljud. För i fokus vidhäftning experiment är baslinjen position som fibroblaster sprids på ett ligand α ₅ β _1-integrin inte utgör vinkulin innehåller sammanväxningar (Fig. 3A) om en andra fibronektinreceptor, syndekan-4, är engagerad genom tillsats av löslig ligand (figur 3B) ^3,4. Emellertid inducerar stimulering med ultraljud fokal adherensbildning i samma utsträckning som ingrepp av syndekan-4 (fig. 3C), vilket indikerar att ultraljud stimulering kan ersätta vissa komponenter i det fibronektin-beroende signalväg ^5. Nyckeln hindret med detta protokoll eliminera fokus adherensbildning i frånvaro av stimulerande. Ofullständig inhibering av proteinsyntes genom cykloheximid tillåter matrixdeposition som är tillräcklig för att cellerna skall automatiskt stimulera. Överbeläggning av celler kan också leda till låg nivå fokus vidhäftning Formation och ett dåligt svar på ultraljud som överhörning mellan cell-cell-och cell-matrix kontakter kommer att komplicera ett experiment som utformats för att isolera en enda stimulus. Som en utveckling av den grundläggande analysen visar vi samma experiment, upprepas med fibroblaster som saknar syndekan-4 (Fig. 4). Dessa fibroblaster reagera fortfarande för ultraljud (fig. 4C), men misslyckas med att svara på syndekan-4-ligand (figur 4B). Experimentet med Sdc4 - / - fibroblaster visar att ultraljud faktiskt kan kringgå behovet av vissa fibronektinreceptorer, och illustrerar hur enkelt protokoll kan utvecklas för att få extra information om signalväg.

För biokemiska experiment visar vi att ultraljud kan inducera aktivering av RAC1, med användning av en neddragningstransistor immunanalys som en anpassning av metoden beskriven av del Pozo et al. ^10. Utfällning av aktivt RAC1 0, 10, 30 och 60 minuter efter ini-differentiering av ultraljud stimulering avslöjar att RAC1 aktivitet toppar vid 10-30 minuter, innan han återvände till baslinjen (Fig. 5). Blotting rålysat för vinkulin ger lastutrymme motsvarande mellan tidpunkter. Resultatet liknar aktiveringen av RAC1 genom ingrepp av syndekan-4 ^3, men är något mer utdragen än aktivering av fibronektin. Därför 8-10 upprepningar är vanligtvis krävs för att uppnå betydande data. Aktivering av RAC1 är ansvarig för åtagande av celler till fokal adherenser, och begynnande fokala sammanväxningar börjar bildas vid 10-30 minuter, vilket sammanföll med RAC1 aktivering. En gång påbörjats, kommer dessa adhesioner fortsätter att mogna till de stora adhesion plack som visas i figurerna 3 och 4.

Figur 1. Ultraljudet vågform. Ultraljud innefattar en intermittent 1,5 MHz-signalen som beror på låg amplitud (30 mW / cm <sup> 2, har rumslig genomsnitt temporal genomsnitt) ingen uppvärmning effekt.

Figur 2. Schematisk representation av arbetsflödet för framställning och stimulering av celler med ultraljud.

Figur 3. Ultraljud induktion av fokal adherensbildning i fibroblaster. Fibroblaster spreds på integrin-bindande fragment av fibronektin (A) före stimulering med syndekan-4-bindande fragment av fibronektin (B) eller ultraljud (C). Efter 60 minuters stimulering fixerades celler, färgades för vinkulin och aktin, och avbildas av epifluorescens. Bar = 10 pm.

Figur 4. Ultraljud induktion av fokal adherensbildning i fibroblaster som saknar syndekan-4. Sdc4 - / - fibroblaster var fibronektin-okänsliga, ultraljud inducerade fortfarande fokus adherensbildning, vilket tyder på att ultraljud förbi matrix receptor engagemang. Bar = 10 pm.

Figur 5. Aktivering av RAC1 med ultraljud. Cellerna stimulerades under 0, 10, 30 och 60 minuter med 6 brunnar användes per tidpunkt. Mängden av GTP-RAC1 närvarande i prover från en RAC1 pull-down-analys tidsförloppet visualiserades genom inkubation med anti-RAC1 antikropp på en western blöt (övre bilden). Kvantifiering av bandet intensitet (i genomsnitt 8-10 replikat) visar ökade RAC1 enctivity följd av ultraljud signal vid 10 och 30 minuter, innan han återvände till baslinjenivåer vid 60 minuter (graf). Felstaplar utgör SEM

Discussion

I detta protokoll beskriver vi den metod med vilken en behandling, som normalt appliceras på humana patienter kan användas i cellbaserade försök. Det slutliga målet är att förstå den molekylära mekanismen för ultraljud åtgärder så att den behandlingen kan förfinas. I detta protokoll använder vi mus embryonala fibroblaster (MEF) som modell cellsystem, men ultraljud har också visat sig vara effektiva i primära humana förhudsfibroblaster ^5, mesenkymala stamceller, osteoblaster och kondrocyter ^6. Vi använder RAC1 aktivering som exempel biokemisk analys, men den metod skulle kunna användas på samma sätt för testa reglering av proteinfosforylering eller bildning av protein-komplex genom immunoutfällning. För immunofluorescens exemplet visar vi en effekt ultraljud fokus adherensbildning, men omfördelning av vilken molekyl som helst kan undersökas. Exempelvis kan man testa rekrytering av cytosoliska faktorer till plasmamembranet, colocalisation av proteprogram i människohandel blåsor eller undersöka effekten av ultraljud på mitotisk spindel organisation. Hittills har vi begränsat oss till att testa fibronektin-beroende vägar, genom effekten av ultraljud på celler på kollagen, eller i närvaro av tillväxtfaktorer kan testas för att bygga upp en bild av hur ultraljud påverkar cellens beteende i en komplex miljö som mer liknar en in vivo-situationen. En större utmaning blir att testa effekten av ultraljud att använda time-lapse avbildning, där närvaron av sändaren blockerar ljuset vägen och vibrationer från ultraljud nuvarande ytterligare tekniska hinder. Tyder dock på det faktum att terapeutiska applikationen kräver bara 20 minuter stimulering per dag som analysen av cellens beteende efter en skur av stimulering kan mycket väl vara produktiv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester	Fisher Scientific	PN22312	25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C
6-well tissue culture plate	Corning	3516	Plastic from other companies can coat poorly
13-mm glass coverslip	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3336	Glass from other companies can coat poorly
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
PBS, Ca2+ Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662
50K integrin ligand (fibronectin fragment)			Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698	Can be stored as 10mg/ml stock in water
DMEM/25 mM HEPES	Sigma-Aldrich	D6171
Exogen 4000+	Smith & Nephew Inc.
Ultrasound coupling gel	Smith & Nephew Inc.
SAFHS indicator	Smith & Nephew Inc.
hVIN-1	Sigma-Aldrich	V9264
DyLight 488-conjugated anti-mouse	Stratagene, Agilent Technologies	715-485-150
TRITC-labelled phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930
cOmplete protease inhibitor (EDTA free)	Roche Group	056 489 001	100× stock made up from tablet stored at -20°C
PAK-glutathione agarose beads			Construct description and preparation in 10
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Make 1M stock and pH to 7.4
NaCl	Fisher Scientific	S/0160/65
NP40	Sigma-Aldrich	I3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134