Induktion af adhæsionsafhængige Signaler af ringe intensitet Ultralyd

Summary

Denne protokol beskrives stimuleringen af ​​dyrkede fibroblaster med lav intensitet pulserede ultralyd, som driver fokal adhesionsdannelse og Rac1 aktivering ved at efterligne indgreb af transmembrane matrix-receptor, syndecan-4. Denne fremgangsmåde muliggør undersøgelse af et succesfuldt klinisk teknik på det cellulære niveau, hvorved der tilvejebringes mulighed for forbedring af behandlingen.

Abstract

I multicellulære organismer, er cellen adfærd dikteret af interaktioner med den ekstracellulære matrix. Konsekvenser af matrix-engagement spænder fra regulering af celle-migration og proliferation, til sekretion og endda differentiering. De signaler, der ligger til grund hver af disse komplekse processer stammer fra molekylære vekselvirkninger ekstracellulære matrix-receptorer på overfladen af ​​cellen. Integriner er det prototypiske receptorer og tilvejebringe en mekanisk forbindelse mellem ekstracellulær matrix og cytoskelettet, samt initiering nogle af de adhæsionsafhængige signaleringskaskader. Dog bliver det stadig mere tydeligt, at yderligere transmembrane receptorer fungere sammen med de integrinerne at regulere både integrinet selv og signaler nedstrøms. Den mest elegante af disse eksempler, er det transmembrane proteoglycan, syndecan-4, der samvirker med α ₅ β _1-integrin i adhæsion til fibronectin. In vivo-modeller demonstrspiste betydningen af syndecan-4-signalering, som syndecan-4-knockout-mus udviser heling retardering grund af ineffektiv fibroblast migration ^1,2. I vildtype-dyr, er migration af fibroblaster mod et sår udløst ved fremkomst af fibronectin, som lækker fra beskadigede blodkar og deponeres af makrofager i beskadigede væv. Derfor er der stor interesse i at finde strategier, der forbedrer fibronectin-afhængige signaler og kan fremskynde reparation processer.

Integrin-formidlede og syndecan-4-medieret komponenter i fibronectin-afhængige signaler kan adskilles ved at stimulere cellerne med rekombinante fibronectinfragmenter. Selv integrin indgreb er nødvendigt for celleadhæsion har visse fibronectin-afhængige signaler reguleres af syndecan-4. Syndecan-4 aktiverer Rac1 protrusive signal ^3, forårsager integrin omfordeling ^en udløser rekruttering af cytoskeletale molekyler, såsom vinculin til fokalsammenvoksninger ^4, og dermed inducerer retningsbestemt migration ^3. Vi har søgt efter alternative strategier til aktivering af sådanne signaler og fandt, at lav intensitet pulseret ultralyd (LIPUS) kan efterligne virkningen af syndecan-4 indgreb ^5. I denne protokol beskrives den fremgangsmåde, ved hvilken 30 mW / cm ^2, 1,5 MHz ultralyd, pulseret med 1 kHz (fig. 1) kan anvendes til fibroblaster i kultur (fig. 2) for at inducere Rac1 aktivering og fokal adhesionsdannelse. Ultralyd stimulation anvendes i maksimalt 20 minutter, idet denne kombination af parametre har vist sig at være mest effektiv til fremskyndelse af klinisk frakturreparation ^6. Fremgangsmåden anvender rekombinante fibronectinfragmenter at udøve α ₅ β _1-integrin, uden indgreb af syndecan-4, og kræver inhibering af proteinsyntesen ved cycloheximid til at blokere aflejring af yderligere matrix af fibroblasterne., Positive virkning of ultralyd på reparations-mekanismer er veldokumenteret ^7,8, og ved at forstå den molekylære effekten af ultralyd i kultur, vi bør være i stand til at forfine den terapeutiske teknik til at forbedre de kliniske resultater.

Protocol

1. Coating Overflader med Matrix Ligand

1. Ultralyd vil blive anvendt til celler i 3,5 cm-brønde, enten som individuelle retter eller en 6-brønds plade. Til biokemiske assays, ligand lag direkte på plasten. For immunfluorescens, dækglassene kog glas tre gange i MilliQ vand og anbringes 4 dækglas i bunden af ​​hver brønd.
2. Glas overflader skal være derivatiseres for at sikre en effektiv ligand belægning. Opløs sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester i PBS ved 1 mM. Tilsættes 2 ml til hver brønd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
3. Vask de derivatiserede overflader 3 gange med PBS.
4. Coat enten derivatiseret glas eller ubehandlet plastmateriale med integrin-ligand. Anvendes 2 ml 10 ug / ml integrin ligand9, opløst i PBS indeholdende ^{Ca2 +} og ^{Mg2 +} til hver brønd og inkuber natten over ved 4 ° C.
5. Forberede monoparticulate BSA ved opvarmning 1% BSA, opløst i PBS, til 85 ° C i 13 minutter. Tilladat afkøle og derefter passere gennem et 0,45 um filter.
6. Vask ligand-overtrukne overflader 3 gange med PBS og blok med monoparticulate BSA i 30 minutter.

2. Fremstillinq af celler

1. At styre matrixen miljøet i hele forsøget bør proteinsyntese blokeres ved tilsætning af 25 ug / ml cycloheximid til 80% konfluente fibroblaster i 2 timer.
2. Skylning cycloheximid-behandlede celler med PBS, og løsnes fra dyrkningskolben ved anvendelse af 0,5 mg / ml trypsin / EDTA.
3. Høst løsnede celler ved centrifugering ved 500x g i 5 minutter.
4. Resuspender cellerne i DMEM/25 mM HEPES, 25 ug / ml cycloheximid.
5. Tæller celletæthed af suspensionen ved hjælp af et hæmocytometer og fortyndes til 105 ml-1.
6. Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter for at inddrive overflade integrin.
7. Skylle ligandbelagt, BSA-blokerede brønde 3 gange med PBS.
8. Frø 2 ml af cellesuspensionen i hver brønd.
9. Allow celler fordelt i 2 timer ved 37 ° C, _5% CO2.

3. Ultralyd Stimulation

1. Opvarme ultralyd emitteren arrayet og kobling gel til 37 ° C.
2. Anvender en ært klat kobling gel til hver emitter.
3. Teste, hver emitter er funktionel ved hjælp af en ultralyd indikator diodedetektoren.
4. Placere brønde på emitteren arrayet. Tilbage matrix til 37 ° C, _5% CO2 og tillade temperaturen at ækvilibrere i 10 minutter.
5. Tænde ultralydsignal.
6. Ultralydssignalet deaktiveres efter 20 minutter, efterligner den terapeutiske regime. Hvis kortere stimulering tider er påkrævet, bør plader fjernes fra array'et på passende tidspunkter. I alle tilfælde anvendes ustimulerede plader som negativ kontrol.

4. Fokal adhæsion Analyse ved immunofluorescens

1. Til analyse af fokal adhesionsdannelse, anvender den 20-minutters ultralydsignalog derefter give strukturer for at udvikle yderligere 40 minutter ved opretholdelse af celler ved 37 ° C, _5% CO2.
2. Aspirer medier og fastgør celler ved anvendelse af 2 ml 4% paraformaldehyd i PBS. Inkuber i 14 minutter ved stuetemperatur.
3. Aspirer paraformaldehyd og skylles tre gange med PBS under anvendelse af PBS forsigtigt ned i kanten af ​​brønden for at undgå dannelse af forskydningskræfter.
4. Overfør hver dækglas fra 3,5 cm og en 24-brønds plade til efterfølgende immunfluorescensfarvning.
5. Dæmpning resterende paraformaldehyd ved anvendelse 0,5 ml 0,1 M glycin i PBS til hver af de 24 brønde. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
6. Aspirer glycin og skylles tre gange med PBS.
7. Permeabilise celler ved anvendelse af 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) i PBS. Inkuber i 4 minutter ved stuetemperatur.
8. Aspirer Triton X-100 og skylles tre gange med PBS.
9. Blok ved anvendelse af 0,5 ml 3% (w / v) BSA i PBS. Inkuber natten over ved 4 & df.eks; C.
10. Plette vinculin indeholdende fokal adhæsion med hVIN-1-antistof fortyndet 1:400 i BSA blok. Inkuberes i en time ved stuetemperatur.
11. Skylles tre gange med PBS.
12. Anvendelse fluorofor (DyLight 488)-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1:200) og pletter actin med TRITC-konjugeret phalloidin (fortyndet 1:200) i BSA blok. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
13. Skylles tre gange med PBS og en gang med vand.
14. Monteres på en glasplade i en omvendt position med Forlæng Gold mountant.

5. Kvantificering af Rac1 Aktivering af Pull-down Assay

1. Til analyse af Rac1 aktivering anvende 20 minutter ultralyd signal til celler ved 37 ° C, _5% CO2. Ved vurderingen reaktionstider længere end 20 minutter, anvender ultralyd signal i 20 minutter og opretholde cellerne ved 37 ° C, 5% _CO2 i den resterende tid til at tillade reaktionen at udvikle sig.
2. Aspirer medier og sted samts på is. Skylles brønde med 2 ml kold PBS og aspirat. Sikre en tilbageværende PBS fjernes ved at lade brønde vippes i 1 minut efterfulgt af grundig aspiration.
3. Lysere cellerne på is med 35 ul lysepuffer (10% glycerol, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 x komplet proteaseinhibitor) pr. I dette eksempel 6 brønde anvendes per tidspunkt at generere 210 ul cellelysat. Flere eller færre brønde kan anvendes, men totale lysat volumenet samlede ~ 200 ul.
4. Skrabemærker celler grundigt med celleskraber at sikre fuldstændig cellelyse og efterlade brønde vippet i 1 minut for at tillade lysatet at samle.
5. Overførsel lysatet til en iskold 1,5 ml mikrocentrifugerør (sammenlægning lysater fra samme behandlingsregimen) og centrifugering ved 21 tusind x g i 2 minutter ved 4 ° C for at pelletere cellulært debris.
6. Overfør 180 ul lysat til iskold 1,5 ml-mikrocentrifugerør indeholdende 130 ul lysepuffer og 25 pi PAK-glutathione agaroseperler ^10. Holde resterende rå lysat ved -20 ° C til efterfølgende gelseparation.
7. Indfange aktive Rac1 på PAK-glutathionagaroseperler ved rotation rør i 40 minutter ved 4 ° C.
8. Høst agaroseperle konjugater ved centrifugering ved 2000 x g i 1 minut ved 4 ° C.
9. Vask vulst konjugater tre gange med 500 pi lysisbuffer, høst perler ved centrifugering ved 2000 x g, og kassere supernatanten efter hver vask. Forsigtigt fjerne eventuel resterende lysis vaskebuffer med en 200 ul pipette.
10. Eluering hver prøve ved tilsætning af 35 pi SDS-PAGE loadingbuffer og inkuber ved 85 ° C på en ryster varmeblok i 5 minutter. Fjerne perlerne ved centrifugering ved 21 tusind x g i 1 minut.
11. Løse vulst eluat ved SDS-PAGE, overføres til nitrocellulose og probe til Rac1.

6. Repræsentative resultater

I denne protokol beskrives induktionen af ​​vinculin-farvninged fokale adhærencer og Rac1 aktivitet ved ultralyd. For fokal adhæsion eksperimentet er basislinien position, fibroblaster spredes på en ligand af α ₅ β _1-integrin ikke danner vinculin-holdige adhæsioner (fig. 3A), medmindre andet fibronectinreceptor, syndecan-4, aktiveres ved tilsætning af opløselig ligand (fig. 3B) ^3,4. Imidlertid stimulering med ultralyd inducerer fokal adhesionsdannelse i samme omfang som indgreb syndecan-4 (fig. 3C), hvilket indikerer, at ultralyd stimulation kan erstatte visse bestanddele af fibronectin-afhængige signalvej ^5. Nøglen hurdle med denne protokol er at fjerne fokus adhærencedannelse i fravær af stimulerende. Ufuldstændig inhibering af proteinsyntese ved cycloheximid vil tillade matrixaflejring, der er tilstrækkelig til cellerne til automatisk at stimulere. Overfyldning af celler kan også føre til lav-niveau fokal adhæsion formation og en dårlig respons på ultralyd som krydstale mellem celle-celle-og celle-matrix-kontakter vil komplicere et eksperiment, som er designet til at isolere en enkelt stimulus. Som en udvikling af den grundlæggende assayet viser vi det samme eksperiment, gentaget med fibroblaster, der mangler syndecan-4 (fig. 4). Disse fibroblaster stadig reagere ultralyd (fig. 4C), men ikke reagerer på syndecan-4-ligand (fig. 4B). Eksperimentet under anvendelse Sdc4 - / - fibroblaster viser, at ultralyd kan faktisk omgå behovet for visse fibronectinreceptorer og illustrerer, hvordan et simpelt protokol kan udvikles til at opnå yderligere information om signalvejen.

For biokemiske eksperiment viser, at ultralyd kan inducere aktivering af Rac1 under anvendelse af en pull-down assay, der er en tilpasning af metoden beskrevet af Del Pozo et al. ^10. Udfældning af aktivt Rac1 0, 10, 30 og 60 minutter efter initiation af ultralyd stimulation afslører, at Rac1 Aktiviteten topper i 10-30 minutter, før han vendte tilbage til baseline (Fig. 5). Blotting rålysater for vinculin sikrer ligestillet belastning mellem tidspunkter. Resultatet ligner aktivering af Rac1 ved indgreb af syndecan-4 ^3, men er lidt mere langvarig end aktivering af fibronectin. Derfor 8-10 gentagelser typisk kræves for at opnå væsentlige data. Aktivering af Rac1 er ansvarlig for engagement af celler til fokal adhæsion dannelse, og spirende fokale adhæsioner, begynder at danne i 10-30 minutter, samtidig med Rac1 aktivering. Når først påbegyndes, vil disse adhæsioner fortsat modnes til de store friktion plaques vist i figur 3 og 4.

Figur 1. Ultralydsbølgen form. Ultralyd omfatter en intermitterende 1,5 MHz signal, på grund af lav amplitude (30 mW / cm <sup> 2, rumlig gennemsnit tidsmæssige gennemsnittet) har ingen varme effekt.

Figur 2. Skematisk fremstilling af arbejdsprocessen for forberedelse og stimulering af celler med ultralyd.

Figur 3. Ultralyd induktion af fokal adhesionsdannelse i fibroblaster. Fibroblaster blev spredt på integrin-bindende fragment af fibronectin (A) før stimulering med syndecan-4-bindende fragment af fibronectin (B) eller ultralyd (C). Efter 60 minutters stimulering blev cellerne fikseret, farvet for vinculin og actin, og afbildes ved epifluorescens. Bar = 10 um.

Figur 4. Ultralyd induktion af fokal adhesionsdannelse i fibroblaster, der mangler syndecan-4. Sdc4 - / - fibroblaster var fibronectin-ufølsomme, ultralyd stadig induceres fokal adhesionsdannelse, hvilket indikerer, at ultralyd omgår matrix-receptor indgreb. Bar = 10 um.

Figur 5. Aktivering af Rac1 ved ultralyd. Celler blev stimuleret i 0, 10, 30 og 60 minutter med 6 brønde anvendes per tidspunkt. Mængden af ​​GTP-Rac1 stede i prøver fra en Rac1 pull-down assay tidsforløbet blev visualiseret ved inkubation med anti-Rac1 antistof på et Western blot (øverste billede). Kvantificering af bandet intensiteten (gennemsnit af 8-10 gentagelser) afslører øget Rac1 enctivity som følge af ultralyd signal på 10 og 30 minutter, før han vendte tilbage til baseline ved 60 minutter (graf). Fejlsøjler repræsenterer SEM

Discussion

I denne protokol beskrives den metode, som en behandling, som normalt anvendes til humane patienter, kan anvendes i celle-baserede eksperimenter. Det ultimative mål er at forstå den molekylære mekanisme af ultralyd handling, således at behandlingen kan forbedres. I denne protokol anvender vi muse embryonale fibroblaster (MEF) som model cellesystem, men ultralyd har også vist sig at være effektive i primære humane forhudsfibroblaster ^5, mesenchymale stamceller, osteoblaster og chondrocytter ^6. Vi anvender Rac1 aktivering som eksempel biokemisk assay, men fremgangsmåden kan anvendes også til at teste regulering af proteinphosphorylering eller dannelse af protein-komplekser ved immunfældning. For immunofluorescent eksempel vil vi vise en effekt ultralyd på fokal adhæsion dannelse, men en omfordeling af ethvert molekyle, der kan undersøges. For eksempel kunne man teste rekruttering af cytosoliske faktorer til plasmamembranen, colocalisation af proteins i menneskehandel vesikler eller undersøge effekten af ​​ultralyd på mitotiske spindel organisation. Hidtil har vi begrænset os til at teste fibronektin-afhængige veje, ved effekten af ​​ultralyd på celler på kollagen, eller i tilstedeværelse af vækstfaktorer kan testes for at opbygge et billede af, hvordan ultralyd påvirker celle adfærd i et komplekst miljø, der mere ligner en in vivo situation. En større udfordring vil være at afprøve effekten af ​​ultralyd ved hjælp af time-lapse billeddannelse, hvor tilstedeværelsen af ​​emitter blokerer lyset stien og vibrationer fra de ultralyd nuværende yderligere tekniske forhindringer. Den omstændighed, at den terapeutiske applikation kræver kun 20 minutter stimulering per dag antyder, at analyse af cellen adfærd efter en byge af stimulation kan meget vel være produktiv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester	Fisher Scientific	PN22312	25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C
6-well tissue culture plate	Corning	3516	Plastic from other companies can coat poorly
13-mm glass coverslip	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3336	Glass from other companies can coat poorly
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
PBS, Ca2+ Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662
50K integrin ligand (fibronectin fragment)			Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698	Can be stored as 10mg/ml stock in water
DMEM/25 mM HEPES	Sigma-Aldrich	D6171
Exogen 4000+	Smith & Nephew Inc.
Ultrasound coupling gel	Smith & Nephew Inc.
SAFHS indicator	Smith & Nephew Inc.
hVIN-1	Sigma-Aldrich	V9264
DyLight 488-conjugated anti-mouse	Stratagene, Agilent Technologies	715-485-150
TRITC-labelled phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930
cOmplete protease inhibitor (EDTA free)	Roche Group	056 489 001	100× stock made up from tablet stored at -20°C
PAK-glutathione agarose beads			Construct description and preparation in 10
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Make 1M stock and pH to 7.4
NaCl	Fisher Scientific	S/0160/65
NP40	Sigma-Aldrich	I3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134