Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Stimulation der kultivierten Fibroblasten mit geringer Intensität gepulster Ultraschall, die privilegierte Adhäsionsbildung und Rac1 Aktivierung durch Nachahmen Eingriff des Transmembran-Rezeptor-Matrix, Syndecan-4 antreibt. Dieser Ansatz erlaubt die Untersuchung einer erfolgreichen klinischen Technik auf zellulärer Ebene, wodurch Möglichkeiten für die Verfeinerung der Therapie.
Abstract
In vielzelligen Organismen, wird das Verhalten der Zelle durch die Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix bestimmt. Folgen der Matrix-Engagements reichen von Regulierung von Zellmigration und Proliferation, die Sekretion und sogar Differenzierung. Die Signale jeweils zugrunde liegt dieser komplexen Prozesse ergeben sich aus den molekularen Wechselwirkungen von extrazellulären Matrix-Rezeptoren auf der Oberfläche der Zelle. Integrine sind die prototypischen Rezeptoren und eine mechanische Verbindung zwischen extrazellulären Matrix und Zytoskelett, sowie die Einleitung einige der Haftung-abhängige Signalkaskade. Es wird jedoch immer offensichtlicher, dass zusätzliche Transmembranrezeptoren neben den Integrinen funktionieren, um sowohl das Integrin selbst und Signale stromabwärts zu regulieren. Die eleganteste dieser Beispiele ist die transmembrane Proteoglykan Syndecan-4, die mit α 5 β 1-Integrin kooperiert während der Adhäsion an Fibronectin. In-vivo-Modellen, Einzelhandelaß die Bedeutung der Syndecan-4-Signalisierung, wie Syndecan-4-Knockout-Mäusen Heilung Retardierung aufgrund ineffizienter Fibroblastenmigration 1,2 aufweisen. In Wildtyp-Tieren, wird die Migration von Fibroblasten in Richtung einer Wunde durch das Auftreten von Fibronektin, dass Lecks aus beschädigten Kapillaren und durch Makrophagen in verletztem Gewebe abgelagert wird ausgelöst. Daher besteht ein großes Interesse an der Entdeckung Strategien, die Fibronektin-abhängige Signalgebung verbessern und könnte Reparaturprozesse beschleunigen.
Die Integrin-vermittelten und Syndecan-4-vermittelte Komponenten Fibronectin-abhängige Signalgebung durch Stimulieren von Zellen mit rekombinanten Fibronektinfragmenten getrennt werden. Obwohl Integrin-Engagement ist wichtig für Zell-Adhäsion, werden bestimmte Fibronektin-abhängige Signale von Syndecan-4 reguliert. Syndecan-4 aktiviert den Rac1 vorstehenden Signal 3, bewirkt Integrin Umverteilung 1, Trigger Einstellung von Zytoskelett-Moleküle, wie Vinculin, um fokaleVerwachsungen 4, und führt somit zu gerichtete Migration 3. Wir haben für alternative Strategien zur Aktivierung von solchen Signalen gesucht und gefunden, dass niedriger Intensität gepulster Ultraschall (Lipuš) können die Wirkung von Syndecan-4 Verlobung 5 imitieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode, durch die 30 mW / cm 2, 1,5 MHz Ultraschall, bei 1 kHz (Abb. 1) gepulst, um Fibroblasten in Kultur (Abb. 2) angewendet werden können, um Rac1 Aktivierung und fokale Adhäsion zu induzieren. Ultraschall Stimulation für höchstens 20 Minuten angelegt, da diese Kombination von Parametern gefunden wurde, am wirksamsten für die Beschleunigung der klinischen Frakturheilung 6. Die Methode verwendet, um rekombinante Fibronektin-Fragmente α 5 β 1-Integrin, ohne Engagement von Syndecan-4 zu engagieren, und erfordert die Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid zur Ablagerung von zusätzlichen Matrix durch die Fibroblasten zu blockieren., Die positive Wirkung of Ultraschall auf Reparaturmechanismen ist gut dokumentiert, 7,8, und durch das Verständnis der molekularen Wirkung von Ultraschall in der Kultur sollten wir fähig sein, um die therapeutische Technik zu verfeinern, um die klinischen Ergebnisse verbessern.
Protocol
1. Beschichtung von Oberflächen mit Matrix-Ligand
- Ultraschall wird, um Zellen in 3,5-cm Brunnen angelegt werden, entweder als einzelne Gerichte oder als 6-Well-Platte. Für biochemische Assays, Ligand Mantel direkt auf dem Kunststoff. Für Immunfluoreszenz, Deckgläser aufkochen Glas dreimal in MilliQ Wasser und Platz 4 Deckgläser in den Boden jeder Vertiefung.
- Glasflächen müssen derivatisiert werden, um eine effiziente Liganden Beschichtung zu gewährleisten. Man löst Sulfo-m-Maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide Ester in PBS mit 1 mM. 2 ml in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen der derivatisierten Oberflächen 3-mal mit PBS.
- Coat derivatisiert entweder Glas oder Kunststoff mit unbehandelten Integrin-Liganden. Auftragen von 2 ml 10 ug / ml Integrin ligand9, in PBS mit Ca 2 + und Mg 2 + gelöst, so dass jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht
- Planen monopartikuläre BSA durch Erwärmen von 1% BSA in PBS gelöst, auf 85 ° C für 13 Minuten. Erlaubenabkühlen lassen und dann durch ein 0,45-um-Filter.
- Waschen Liganden-beschichteten Oberflächen 3 mal mit PBS und mit dem Block monopartikulären BSA für 30 Minuten.
2. Herstellung von Zellen
- Um die Umgebung der Matrix während des Experiments zu steuern, sollte die Proteinsynthese durch Zugabe von 25 ug / ml Cycloheximid zu 80% konfluent Fibroblasten für 2 Stunden blockiert.
- Spülen Cycloheximid-behandelten Zellen mit PBS und lösen sich vom Kulturgefäß unter Verwendung von 0,5 mg / ml Trypsin / EDTA.
- Ernte abgelösten Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 Minuten.
- Die Zellen in DMEM/25 mM HEPES, 25 ug / ml Cycloheximid.
- Anzahl Zelldichte der Suspension unter Verwendung eines Hämozytometers und mit Wasser auf 105 ml-1.
- Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 20 Minuten an die Oberfläche Integrin erholen.
- Spülen Sie die Liganden-beschichteten, BSA-blockierten Vertiefungen 3mal mit PBS.
- Seed 2 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung.
- Allow Zellen für 2 Stunden bei 37 ° C verteilt, 5% CO 2.
3. Ultraschall-Stimulation
- Warm die Ultraschall-Emitter-Array und Kopplungsgel auf 37 ° C
- Tragen Sie eine erbsengroße Klecks Kopplungsgel zu jedem Emitter.
- Testen Sie, dass jeder Sender ist funktional mit einem Ultraschall-Indikator Diodendetektor.
- Legen Sie die Vertiefungen auf der Emitter-Array. Zurück Arrays auf 37 ° C, 5% CO 2 und damit sich das Wasser für 10 min lang sich ausgleichen.
- Schalten Sie den Ultraschall-Signal.
- Das Ultraschallsignal wird nach 20 Minuten deaktivieren, imitiert das therapeutische Regime. Wenn kürzere Zeiten Stimulation erforderlich sind, sollten Platten aus dem Array zu gegebener Zeit-Punkte entfernt werden. In allen Fällen verwenden Platten als negative Kontrolle unstimulierten.
4. Focal Adhesion Analyse durch Immunfluoreszenz
- Für die Analyse von fokalen Adhäsionen, gelten die 20-minütige Ultraschallsignalund dann die Entstehung von Strukturen, um für weitere 40 Minuten durch die Aufrechterhaltung Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 zu entwickeln.
- Saugen Medien und zu fixieren Zellen durch Anwendung von 2 ml 4% Paraformaldehyd in PBS. Inkubieren für 14 Minuten bei Raumtemperatur.
- Saugen Paraformaldehyd und spülen dreimal mit PBS, die Anwendung des PBS sanft den Rand des Brunnens, die Erzeugung von Scherkräften zu vermeiden.
- Übertragen jedes Deckglas von den 3,5 cm und einer 24-Well-Platte für die nachfolgende Immunfluoreszenzfärbung.
- Quench restliche Paraformaldehyd durch Aufbringen von 0,5 ml 0,1 M Glycin in PBS in jede der 24 Vertiefungen. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Glycin absaugen und spülen Sie drei Mal mit PBS.
- Permeabilisieren Zellen durch Aufbringen von 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Inkubieren für 4 Minuten bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Triton X-100 und spülen Sie drei Mal mit PBS.
- Sperren, indem 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Inkubieren über Nacht bei 4 & dz. B., C.
- Stain Vinculin-haltige fokalen Adhäsionen mit hVIN-1-Antikörper verdünnt 1:400 in BSA-Block. Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie dreimal mit PBS.
- Anwenden Fluorophor (DyLight 488)-konjugierten sekundären Antikörper (1:200 verdünnt) und Fleck Aktin mit TRITC-Phalloidin (1:200 verdünnt) in BSA-Block. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Spülen dreimal mit PBS und einmal mit Wasser.
- Montieren auf einem Glasträger in einer umgekehrten Position mit Gold-Deckfluessigkeit verlängern.
5. Die Quantifizierung der Rac1-Aktivierung durch Pull-down-Assay
- Für die Analyse von Rac1 Aktivierung gelten die 20-minütige Ultraschallsignal an Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2. Bei der Beurteilung Reaktionszeiten länger als 20 Minuten, gelten die Ultraschallsignal für 20 Minuten und zu halten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für die verbleibende Zeit, damit die Reaktion zu entwickeln.
- Aspirieren Medien und Ort guts auf dem Eis. Spülen Sie die Taschen mit 2 ml kaltem PBS und saugen. Stellen Sie sicher, restliches PBS wird durch Verlassen Brunnen für 1 Minute durch sorgfältige Aspiration gefolgt gekippt entfernt.
- Lyse-Zellen auf Eis mit 35 ul Lysepuffer (10% Glycerin, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × gesamte Protease-Inhibitor) pro Vertiefung. In diesem Beispiel sind 6 Vertiefungen pro Zeitpunkt verwendet zu 210 ul Zelllysat zu erzeugen. Mehr oder weniger Quellen können verwendet werden, aber insgesamt Lysat Volumen sollte insgesamt ~ 200 pl.
- Scrape Zellen gründlich mit Zellenabstreifer um vollständige Lyse der Zellen zu gewährleisten und zu verlassen Vertiefungen geneigt für 1 Minute, bis Lysat zu bündeln.
- Das Lysat zu einer eiskalten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Pooling Lysaten aus gleichen Behandlungsregime) und drehen sich mit 21.000 × g für 2 Minuten bei 4 ° C bis Pellet Zelltrümmer.
- Übertragen Sie 180 ul Lysat zu eiskalter 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 130 ul Lysepuffer und 25 ul PAK-glutathione Agarosekügelchen 10. Halten verbleibenden Rohlysat bei -20 ° C für die anschließende Gel-Trennung.
- Erfassen aktiven Rac1 auf die PAK-Glutathion-Agarose-Kügelchen durch Drehen Röhrchen für 40 Minuten bei 4 ° C
- Ernte Agarosekugel Konjugate durch Zentrifugation bei 2000 × g für 1 Minute bei 4 ° C
- Wash Wulst Konjugate dreimal mit 500 ul Lysepuffer, Ernte Kügelchen durch Zentrifugieren bei 2000 x g und Verwerfen Überstand nach jedem Waschen. Entfernen Sie vorsichtig das restliche Lyse Waschpuffer mit einer 200 ul Pipette.
- Eluieren jede Probe durch Zugabe von 35 ul SDS-PAGE-Ladepuffer und inkubieren bei 85 ° C auf einem Schüttler Heizblock für 5 Minuten. Entfernen Kügelchen durch Zentrifugieren bei 21.000 × g für 1 Minute.
- Auflösen Wulst Eluat durch SDS-PAGE, auf Nitrozellulose und Sonde für Rac1 übertragen.
6. Repräsentative Ergebnisse
In diesem Protokoll beschreiben wir die Induktion von Vinculin-Flecked fokalen Adhäsionen und Rac1-Aktivität durch Ultraschall. Für die focal adhesion Experiment ist die Ausgangssituation, dass Fibroblasten auf einem Liganden von α 5 β 1-Integrin zu verbreiten bilden keine Vinculin-haltige Verwachsungen (Abb. 3A), es sei denn eine zweite Fibronectinrezeptor, Syndecan-4, wird durch Zugabe von engagiert löslichen Liganden (3B) 3,4. Allerdings induziert Stimulation mit Ultraschall Mittelpunkt Adhäsionsbildung im gleichen Umfang wie der Eingriff Syndecan-4 (3C), was anzeigt, dass Ultraschall-Stimulation kann für bestimmte Komponenten des Fibronectin-abhängigen Signalweg 5 ersetzen. Der Schlüssel Hürde mit diesem Protokoll wird die Beseitigung fokalen Adhäsionen in der Abwesenheit von Stimulanzien. Unvollständige Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid ermöglicht Matrixablagerung, die ausreicht, damit die Zellen automatisch zu stimulieren. Die Überbelegung der Zellen kann auch auf Low-Level-focal adhesion formatio führenn und ein schlechtes Ansprechen auf Ultraschall als Übersprechen zwischen Zell-Zell-und Zell-Matrix Kontakte werden erschwert ein Experiment, das entworfen, um einen einzigen Reiz isolieren wird. Als Entwicklungspartner der Grund-Test zeigen wir das gleiche Experiment, mit Fibroblasten fehlen Syndecan-4 (Abb. 4) wiederholt. Diese Fibroblasten noch Ultraschall (4C) zu reagieren, aber nicht an Syndecan-4-Liganden (4B) zu reagieren. Das Experiment mit SDC4 - / - Fibroblasten zeigt, dass Ultraschall kann in der Tat umgehen die Notwendigkeit bestimmter Fibronectin-Rezeptoren, und zeigt, wie die einfache Protokoll entwickelt werden, um zusätzliche Informationen über den Signalweg zu gewinnen.
Für die biochemische Experiment zeigen, dass Ultraschall Aktivierung von Rac1 zu induzieren, unter Verwendung eines Pull-Down-Assay, der eine Anpassung des Verfahrens von Del Pozo et al. 10 beschrieben ist. Niederschlag der aktiven Rac1 0, 10, 30 und 60 Minuten nach der inirenzierung von Ultraschall Stimulation zeigt, dass Rac1-Aktivität Peaks bei 10-30 Minuten, vor der Rückkehr zur Basislinie (Abb. 5). Blot Rohlysaten für Vinculin sorgt äquivalente Belastung zwischen den Zeitpunkten. Das Ergebnis ähnelt Aktivierung von Rac1 durch den Eingriff des Syndecan-4 3, ist aber etwas langwieriger sein als die Aktivierung durch Fibronektin. Deshalb 8-10 Wiederholungen werden in der Regel erforderlich, um aussagekräftige Daten zu erzielen. Die Aktivierung von Rac1 ist verantwortlich für die Verpflichtung von Zellen zu fokalen Adhäsionen, und im Entstehen begriffenen Fokaladhäsionen beginnen bei 10-30 Minuten bilden, zeitgleich mit Rac1-Aktivierung. Einmal in Gang gesetzt, wird die Adhäsionen weiterhin in die große Adhäsionsplaques in den 3 und 4 gezeigt reifen.
Abbildung 1. Die Ultraschallwelle Form. Ultraschall umfasst eine intermittierende 1,5 MHz-Signal, dass aufgrund einer geringen Amplitude (30 mW / cm <sup> 2, hat räumliche Mittelwert, zeitlichen Durchschnitt) keine Heizung Wirkung.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Workflow für die Vorbereitung und Stimulation der Zellen mit Ultraschall.
Abbildung 3. Ultraschall Induktion der fokalen Adhäsionen in Fibroblasten. Fibroblasten wurden auf der Integrin-bindendes Fragment von Fibronectin (A) vor der Stimulation mit dem Syndecan-4-bindendes Fragment von Fibronectin (B) oder Ultraschall (C) verteilt sind. Nach 60 Minuten Stimulierung wurden die Zellen fixiert, gefärbt und Vinculin Actin und abgebildet durch Epifluoreszenz. Bar = 10 um.
Abbildung 4. Ultraschall Induktion der fokalen Adhäsionen in Fibroblasten fehlen Syndecan-4.
Abbildung 5. Aktivierung von Rac1 durch Ultraschall. Die Zellen wurden 0, 10, 30 und 60 Minuten mit 6 Vertiefungen pro Zeitpunkt verwendet stimuliert. Die Menge an GTP-Rac1 in Proben von einem Rac1 Pull-down-Assay Zeitverlauf visualisiert wurde durch Inkubation mit Anti-Rac1 Antikörper auf einem Western-Blot (oberes Bild). Quantifizierung der Bandenintensität (durchschnittlich 8-10 Wiederholungen) zeigt eine erhöhte Rac1ctivity aus Ultraschall-Signal bei 10 und 30 Minuten, bevor sie wieder auf das Ausgangsniveau bei 60 Minuten (Grafik). Fehlerbalken stellen SEM
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode, mit der eine Behandlung, die normalerweise an menschliche Patienten angewendet wird in zellbasierten Experimenten verwendet werden kann. Das ultimative Ziel ist es, den molekularen Mechanismus der Ultraschall-Aktion zu verstehen, so dass die Therapie kann verfeinert werden. In diesem Protokoll verwenden wir embryonale Maus-Fibroblasten (MEFs) als Modell Zellsystem, aber Ultraschall wurde auch gefunden, dass in primären humanen Vorhautfibroblasten 5, mesenchymalen Stammzellen, Osteoblasten und Chondrozyten 6 wirksam. Wir verwenden Rac1 Aktivierung als Beispiel biochemischen Test, aber das Verfahren kann genutzt werden, ebenso zur Regulierung der Protein-Phosphorylierung oder Bildung von Proteinkomplexen durch Immunpräzipitation zu testen. Für die Immunfluoreszenz-Beispiel zeigen wir eine Wirkung Ultraschall auf fokale Adhäsionen, aber Umverteilung von jedem Molekül untersucht werden konnte. Zum Beispiel könnte man die Einstellung von cytosolische Faktoren zur Plasmamembran zu testen, kolokalisiert proteIns im Handel Bläschen oder untersuchen die Wirkung von Ultraschall auf Mitosespindel Organisation. Bisher haben wir beschränkten uns auf Fibronektin-abhängige Signalwege Prüfung, durch die Wirkung von Ultraschall auf Zellen auf Kollagen, oder in Gegenwart von Wachstumsfaktoren könnte getestet, um sich ein Bild davon, wie Ultraschall wirkt sich das Verhalten der Zelle in einem komplexen Umfeld, dass mehr ähnelt einer in vivo Situation. Eine größere Herausforderung wird sein, die Wirkung des Ultraschalls mit Zeitraffer-Imaging, wo die Anwesenheit des Senders die Blockierung der Lichtweg und Vibrationen aus den Ultraschall vorhanden zusätzliche technische Hindernisse zu testen. Allerdings schlägt die Tatsache, dass therapeutische Anwendung nur 20 Minuten der Stimulation pro Tag verlangt, dass Analyse des Verhaltens von Zellen nach einem Ausbruch von Stimulation kann durchaus produktiv sein.
Disclosures
Andrew Harrison ist ein Mitarbeiter von Smith & Nephew UK Limited.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust Zuschuss 088.419 in MDB und Sponsoring von Smith & Nephew UK Ltd unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
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