Summary
이 프로토콜은 초점 유착 형성과 transmembrane 매트릭스 수용체, syndecan-4의 포용을 흉내낸하여 Rac1 활성화를 몰고 낮은 강도 펄스 초음파와 교양 섬유아 세포의 자극에 대해 설명합니다. 이러한 접근 방식함으로써 치료의 섬세한 기회를 제공하고, 세포 수준에서 성공적인 임상 기술의 조사를 허용합니다.
Abstract
다세포 생물에서는 세포 문제는 세포외 기질과 상호 작용에 의해 결정됩니다. 세포 마이 그 레이션 및 확산 규제에서 분비 심지어 차별화에 매트릭스 - 포용 범위의 결과들. 이러한 복잡한 프로세스 각각의 기본 신호는 세포의 표면에 세포외 기질 수용체의 분자 상호 작용에서 발생합니다. Integrins는 prototypic 수용체이며 기계 세포외 기질과 cytoskeleton 사이의 연결뿐만 아니라 접착 - 종속 신호 폭포의 일부를 시작하고 있습니다. 그러나 추가 transmembrane 수용체가 하류 인테 자체와 신호를 모두 통제하고 integrins 함께 작동하는 점점 명백한지고 있습니다. 이러한 예제의 가장 우아 fibronectin에 부착하는 동안 α 5 β 1-인테 협력 transmembrane의 proteoglycan, syndecan-4입니다. 생체내 모델에서 demonstr가syndecan-4-녹아웃 마우스는 비효율적인 fibroblast 마이 그 레이션 1,2로 인한 치료 지연을 전시로, syndecan-4 신호의 중요성을 먹었어요. 야생 형 동물에 상처 향해 섬유아 세포의 이전이 손상된 모세 혈관의 누출과 부상을 조직의 macrophages에 의해 침전되는 fibronectin의 모양에 의해 트리거됩니다. 따라서 fibronectin 종속 신호를 향상시키고 복구 프로세스를 가속화할 수있는 전략을 발견에 큰 관심이 있습니다.
fibronectin 종속 신호의 인테 그린 - 중재와 syndecan-4-매개 구성 요소는 재조합 fibronectin의 파편 자극 세포로 구분 할 수 있습니다. 인테 그린 결합은 세포 부착에 필수이지만, 특정 fibronectin 종속 신호는 syndecan-4에 의해 규제됩니다. Syndecan-4를 활성화 Rac1 밀어내는 신호 3 초점으로 인테 재배포 1 등 vinculin 같은 cytoskeletal 분자의 트리거 모집을 일으키는adhesions 4 및함으로써 방향 마이 그 레이션 3 유도합니다. 우리는 그러한 신호를 활성화하기위한 대안 전략에 대해 검토한 결과, 낮은 강도 펄스 초음파 (LIPUS)는 syndecan-4 교전 5 효과를 흉내내는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜에서는 1 kHz에서 (그림 1)에서 펄스 30 MW / cm 2, 1.5 MHz의 초음파가, Rac1 활성화 및 초점 유착 형성을 유도하기 위해 문화의 섬유아 세포 (그림 2)에 적용할 수있는하는 방법을 설명합니다. 매개 변수의 조합 임상적 골절 수리 6 가속을위한 가장 효과있는 것으로 판명되었습니다로 초음파 자극은 20 분 최대 적용됩니다. 방법은 syndecan-4의 참여없이 α 5 β 1-인테 그린을 참여시키는 재조합 fibronectin 조각을 사용하며 섬유아 세포에 의해 추가로 모체의 증착을 차단하는 cycloheximide에 의한 단백질 합성의 억제가 필요합니다., 긍정적인 효과 O수리 메커니즘의 F에 초음파가 잘 7,8를 문서화하고 있으며, 문화 초음파의 분자 효과를 이해함으로써 우리는 임상 결과를 개선하는 치료 기법을 좁힐 수 있어야합니다.
Protocol
1. 매트릭스 리간드와 코팅 표면
- 초음파는 개별 음식이나 6 - 잘 플레이트 등 중, 3.5 cm의 우물에서 전지에 적용됩니다. 직접 플라스틱쪽으로 생화학 assays 들면, 코트 리간드. immunofluorescence 들어, 종기 유리 MilliQ 물 및 각 우물의 바닥에 장소 4 coverslips을에 세 번 coverslips.
- 유리 표면 효율적인 리간드 코팅을 보장하기 위해 derivatized이어야합니다. 1 ㎜에서 PBS의 sulpho-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide 에스테르를 해산. 각도에이 ML을 넣고 실온에서 30 분간 부화.
- PBS로 derivatized 표면에 3 번씩 씻으십시오.
- 코트 중 derivatized 유리 또는 인테 그린의 리간드와 치료 플라스틱. 각도에 +와 MG 2 + 칼슘 2를 포함하는 PBS에 녹아있는 10 UG / ML 인테 ligand9 2 ML을 적용하고 4에서 하룻밤 품어 ° C.
- ° C 13분 동안 85 PBS에 녹아있는 1 % BSA를, 가열하여 BSA를 monoparticulate 준비합니다. 허용식힌 다음 0.45-μm의 필터를 통과합니다.
- 30 분 monoparticulate BSA와 리간드 - 코팅 표면에게 PBS 및 블록과 3 회 씻는다.
2. 세포의 준비
- 실험 내내 매트릭스 환경을 제어하려면 단백질 합성은 25 μg / ML cycloheximide 80 % 2 시간 합류 섬유아 세포의 추가에 의해 차단되어야합니다.
- PBS와 cycloheximide - 대우 세포를 씻어 및 0.5 밀리그램 / ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 배양 플라스크에서 분리.
- 15 분 500x g에서 원심 분리하여 세포를 수확 단독.
- DMEM/25 밀리미터 HEPES의 Resuspend 세포, 25 μg / ML의 cycloheximide.
- 혈구계를 사용하여 현탁액의 세포 밀도를 세어 105 ML-1로 희석.
- 표면 인테 그린을 복구하기 위해 20 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어.
- PBS와 리간드 - 코팅, BSA 차단 우물 3 회 씻어.
- 각도에 세포 현탁액의 씨앗이 ML.
- Allo37에서 2 시간 동안 확산 w 세포 ° C에서 5 % CO 2.
3. 초음파 자극
- 37 ° C.에 초음파 에미터 어레이와 결합 젤을 따뜻하게
- 각 방출로 젤 커플링의 완두콩 크기의 BLOB을 적용합니다.
- 각 방출은 초음파 지표 다이오드 검출기를 사용하여 기능성한지 테스트합니다.
- 에미터 어레이에 우물를 놓습니다. 37로 배열을 반환 ° C, 10 분 동안 평형을 위해 5 % CO 2와 허용 온도.
- 초음파 신호를 전환합니다.
- 초음파 신호 치료 정권을 흉내낸 20 분 후에 비활성화됩니다. 짧은 자극 시간이 필요한 경우, 플레이트는 시간을 가리키는 적절한에서 배열에서 제거됩니다. 모든 경우에있어서 사용은 부정적인 컨트롤로 번호판을 unstimulated.
4. Immunofluorescence에 의한 초점 접착 분석
- 초점 유착 형성의 분석은 20 분간 초음파 신호를 적용그리고 구조 ° C에서 5 % CO 2 37 세포를 유지하여 추가로 40 분 동안 개발할 수 있습니다.
- 미디어를 대기음하고 PBS로 200 ML 4 % paraformaldehyde를 적용하여 세포를 고정시킨다. 실온 14 분 동안 품어.
- paraformaldehyde를 기음과 전단 세력의 생성을 피하기 위해 우물의 가장자리 아래로 부드럽게 PBS를 적용, PBS로 세 번 씻어.
- 3.5 ㎝의 잘 후속 immunofluorescent 염색법을위한 24 잘 플레이트 각 coverslip을 전송합니다.
- 24 우물 각 PBS에 0.5 ML 0.1 M 글리신을 적용하여 잔류 paraformaldehyde를 끄다. 상온에서 20 분 동안 품어.
- 기음 글리신은하고 PBS로 세 번 씻어.
- 0.5 ML 0.5 % Triton은 PBS의 X-100 (W / V)을 적용하여 세포를 Permeabilise. 실온에서 4 분간 부화.
- 기음 트리톤 X-100하고 PBS로 세 번 씻어.
- 0.5 ML 3퍼센트 (W / V) PBS에 BSA를 적용하여 차단합니다. 4 & D에서 하룻밤 사이에 품어예, C.
- 청바지 vinculin 함유 BSA 블록에 1:400 희석 hVIN-1 항체에 초점 접착력을. 실온에서 한 시간 만이라도 품어.
- PBS로 세 번 씻어.
- 형광단 (DyLight 488) 복합 이차 항체 (1:200 희석)와 BSA 블록에 TRITC-복합 phalloidin (1:200 희석)와 얼룩 actin을 적용합니다. 상온에서 30 분간 부화.
- PBS, 그리고 한 물로 세 번 씻어.
- 골드 mountant을 연장 사용 거꾸로 입장에 유리 슬라이드에 탑재합니다.
5. 풀다운 분석에 의한 Rac1 활성화의 부량
- Rac1 활성화의 분석 내용은, 37에서 세포에 20 분간 초음파 신호를 적용 ° C에서 5 % CO 2. 이십분 이상 응답 시간을 평가했을 때 20 분 동안 초음파 신호를 적용한 37에서 세포를 유지 ° C, 5 % 응답 개발할 수 있도록 남은 시간에 대한 CO 2.
- 대기음 매체와 장소 잘얼음의. 이 ML 차가운 PBS와 대기음으로 우물을 씻어. 확인 잔여 PBS는 철저한 흡인 뒤에는 1 분 기울어져 우물을 떠날에 의해 제거됩니다.
- 물론 당 35 μl 용해 완충액 (10 % 글리세롤, 20 밀리미터 Hepes의 산도 7.4, 140 MM NaCl, 1 % NP40, 0.5 %의 나트륨 Deoxycholate, 4 MM EGTA, 4 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 × 전체 테아제 억제제)와 함께 얼음 세포를 Lyse. 이 예제에서, 6 우물은 세포 lysate의 210 μl를 생성하는 시점에 따라 사용됩니다. 더 많거나 적게 우물을 사용 할 수 있지만 전체 lysate 볼륨 집계해야 ~ 200 μl를.
- 세포 스크레이퍼로 철저하게 자국이 세포 전체 세포 용해를 보장하고 우물을 떠난은 풀에 lysate 수 있도록 1 분 기울어져.
- 펠렛 세포 잔해는 4 ° C에서 2 분 동안 21,000에서 얼음처럼 차가운 1.5 ML microfuge 튜브 (동일 치료 정권에서 풀링의 lysates) 및 스핀 × g로 lysate 전송합니다.
- 용해 완충액 130 μl, 25 μl 박 - GLUT를 포함하는 1.5-ML microfuge 튜브는 심심풀이로 lysate 180 μl를 전송athione 아가로 오스 비즈 10. 이후 겔 분리를 위해 -20 ° C에서 남아있는 원유 lysate 보관하십시오.
- 4에서 40 분 동안 튜브를 돌려 박-글루타티온 아가로 오스 비즈에 대한 적극적인 Rac1 캡처 ° C.
- 하베스트 아가로 오스 비드는 2000에서 원심 분리하여 conjugates × G를 1 분 4 시에 ° C.
- 워시 비드는 각 세척 후에 2000x G 및 폐기 뜨는에서 원심 분리하여 구슬을 수확, 500 μl 용해 완충액으로 세 번 conjugates. 조심스럽게 200 μl 피펫으로 모든 나머지 용해 세차 버퍼를 제거합니다.
- 5 분 동안 흔들어 열 블록에 85 35 μl SDS-PAGE 로딩 버퍼와 부화 ° C를 추가하여 각 샘플을 Elute. 1 분 21,000 × g에서 원심 분리하여 구슬을 제거합니다.
- SDS-PAGE에 의해 비드 eluate를 해결 Rac1위한 nitrocellulose와 프로브로 전송할 수 있습니다.
6. 대표 결과
이 프로토콜에서는 vinculin - 얼룩의 유도를 설명에드 초점의 adhesions과 초음파에 의한 Rac1 활동. 초점 유착 실험의 경우 기준 위치는 α 5 β 1-인테 그린의 리간드에 확산 섬유아 세포가 두 번째 fibronectin 수용체, syndecan-4 않는 vinculin 함유 adhesions (그림 3A)를 형성하지 않는 것이있다는가 추가로 종사하고 있습니다 수용성 리간드 (그림 3B) 3,4. 그러나 초음파로 자극은 초음파 자극은 fibronectin에 의존 신호 전달 경로 5의 특정 구성 요소에 대해 대체할 수 나타내는 syndecan-4 (그림 3C)의 약혼과 같은 정도로 초점 유착 형성을 유도합니다. 이 프로토콜있는 주요 장애물은 흥분제의 부재에 초점 유착 형성을 제거할 수있다. cycloheximide에 의한 단백질 합성의 억제 불완전 자동 자극에 대한 세포하기에 충분 매트릭스 증착을 허용합니다. 세포의 인구 과잉은 또한 낮은 수준의 초점 유착 formatio을 일으킬 수N과 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 접점 사이의 누화와 같은 초음파에 가난한 반응은 하나의 자극을 분리하도록 설계된 실험을 복잡하게합니다. 기본적인 분석의 개발로서 우리는 syndecan-4 (그림 4) 부족한 섬유아 세포에 반복적으로 동일한 실험을 보여줍니다. 이 섬유아 세포는 아직 초음파 (그림 4C)에 대응하지만, syndecan-4 리간드 (그림 4B)에 대응하기 위해 실패합니다. / - - Sdc4 이용한 실험 섬유아 세포는 초음파 실제로 특정 fibronectin 수용체에 대한 필요성을 무시할 수 보여줍니다, 그리고 간단한 프로토콜 신호 전달 경로에 대한 추가적인 정보를 얻기 위해 개발된 수있는 방법을 보여줍니다.
생화학 실험을 위해 우리가 초음파 델 Pozo 외 10.에 기술된 방법의 적응이다 풀다운 분석을 사용하여 Rac1의 정품 인증을 일으킬 수 보여줍니다. 활성 Rac1 0, 10, 30 INI 후 60 분 강수초음파 자극 tiation는 기준선 (그림 5)로 돌아오기 전에, 10-30분에서 Rac1 활동 봉우리 그것을 보여준다. vinculin에 대한 원유 lysates를 모래 바닥은 시간 지점 사이의 등가 하중을 보장합니다. 결과는 syndecan-4 3의 참여에 의한 Rac1의 정품 인증과 유사하지만, fibronectin에 의해 활성화보다 약간 더 오래 끈 것입니다. 따라서 8-10 반복 일반적으로 중요한 데이터를 달성해야합니다. Rac1의 정품 인증은 초점 유착 형성에 대한 세포의 헌신에 대한 책임이며, 초기 초점 adhesions는 Rac1 활성화와 동시, 10~30분에서 형성되기 시작합니다. 일단 시작, 그 adhesions는 그림 3과 4에 표시된 대형 유착 plaques으로 성숙 나갈 것입니다.
그림 1. 초음파 파형. 초음파는 간헐적으로 1.5 MHz의 신호를 구성 그 낮은 진폭 (30 MW / cm <로 인해> 2를 한모금, 공간적 평균, 시간적 평균)은 더 가열 효과가 없습니다.
그림 2. 준비와 초음파 검사와 세포의 자극에 대한 흐름의 도식 표현.
그림 3. 섬유아 세포에 초점 유착 형성의 초음파 유도. 섬유아 세포는 syndecan-4-결합 fibronectin의 조각 (B) 또는 초음파 (C)로 자극하기 전에 fibronectin의 인테 바인딩 조각 ()에 확산되었다. 60 분 자극에 따라 세포가 수정되었습니다 vinculin와 actin에 대해 묻다, 그리고 epifluorescence에 의해 몇 군데. 바 = 10 μm의.
그림 4. syndecan-4가 부족한 섬유아 세포에 초점 유착 형성의 초음파 유도.
그림 5. 초음파에 의한 Rac1의 활성화. 세포는 시점에 따라 사용되는 여섯 웰스와 0, 10, 30 및 60 분간 자극했다. Rac1 풀다운 분석 시간 코스부터 샘플에 GTP-Rac1 현재의 금액은 서양 얼룩 (상단 이미지)에 대한 백신 Rac1 항체와 배양에 의한 시각이었다. 밴드 강도 (8-10의 평균 복제)의 부량는 Rac1 증가 드러내ctivity 60 분 (그래프)에서 기준 레벨로 돌아오기 전에 10 30 분에 초음파 신호에서 발생. 오차 막대는 SEM을 대표
Discussion
이 프로토콜에서는 일반적으로 인간의 환자에 적용되는 치료는 세포 기반 실험에 사용할 수하는 방법을 설명합니다. 궁극적인 목적은 치료가 세련 수 있도록 초음파 행동의 분자 메커니즘을 이해하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 모델 전지 시스템으로 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 사용하지만, 초음파는 기본 인간 포피의 섬유아 세포 5, mesenchymal 줄기 세포, osteoblasts와 chondrocytes 6에 효과적인 것으로 발견되었습니다. 우리는 예를 생화 학적 분석으로 Rac1 정품 인증을 사용하지만 방법은 똑같이 단백질 인산화 또는 immunoprecipitation에 의한 단백질 단지 형성의 규제를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. immunofluorescent 예를 들어 우리는 초점 유착 형성에 효과 초음파를 보여주지만, 어떤 분자의 재배포는 검사 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 prote의 colocalisation, 플라즈마 막에 cytosolic 요인 채용을 테스트할 수인신 매매 vesicles의 기능이나 mitotic 스핀들 조직에 대한 초음파의 효과를 검사합니다. 지금까지 우리는 다른 콜라겐에 대한, 또는 성장 요인의 존재에 초음파 검사가 복잡한 환경에서 세포의 행동에 미치는 영향의 사진을 만들어 테스트할 수있는 세포에 대한 초음파의 효과에 의해, fibronectin 종속적인 경로를 테스트하는 데 국한되어있다 그 이상 밀접하게 관련 생체내 상황은 비슷합니다. 큰 도전은 방출의 존재는 초음파 현재 추가적인 기술적 장애물에서 빛의 경로와 진동을 차단 촬영된 이미지를 사용하여 초음파의 효과를 테스트하는 것입니다. 그러나, 치료 응용 프로그램은 하루에 자극을 불과 20 분 거리가 필요하다는 사실은 자극 버스트 후 셀 동작의 분석을 잘 생산있을 수 있습니다 제안합니다.
Disclosures
앤드류 해리슨 스미스 & 조카 영국 제한의 직원입니다.
Acknowledgments
이 작품은 스미스 & 조카 영국 회사에 의해 MDB와 후원으로 Wellcome 신탁 기금 088,419에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
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