Summary
En teknik til at identificere translationelle pause-steder på mRNA, er beskrevet. Denne procedure er baseret på isolering af nascente polypeptider akkumuleres på ribosomer under in vitro-translation af et mål-mRNA, efterfulgt af størrelses-analyse af nascente kæder under anvendelse af en denaturerende gelelektroforese.
Abstract
Hastigheden af translationelle forlængelse er ikke ensartet. mRNA sekundær struktur, codonanvendelsen og mRNA associerede proteiner kan ændre ribosom bevægelse på meddelelsen for review se 1. Men er det nu bredt accepteret, at synonyme codonanvendelsen er den primære årsag til ikke-ensartede translationelle brudforlængelse vækst1. Synonyme kodoner ikke anvendes med samme frekvens. En forspænding findes i anvendelsen af synonyme kodoner med nogle codons, der anvendes oftere end andre 2. Kodon-bias er organisme, samt vævsspecifikke 2,3. Desuden frekvens kodonanvendelse er direkte proportional med koncentrationen af beslægtet tRNA'er 4. Således vil en hyppigt anvendt kodon har højere mængde af tilsvarende tRNA'er, som yderligere antyder, at en hyppig kodon vil blive omsat hurtigere end en sjælden én. Således vil regionerne på mRNA beriget i sjældne codons (potentielle pause-steder), som hovedregel bremse ribosom bevægelse på Message og forårsage akkumulering af nascente peptider fra de respektive størrelser 5-8. Disse pause-steder kan have funktionel effekt på proteinekspression, mRNA-stabilitet og proteinfoldning for en oversigt se 9. Faktisk blev det vist, at lettelse af sådanne pause-steder kan ændre ribosom bevægelse mRNA og efterfølgende kan påvirke effektiviteten af co-translationel (in vivo) proteinfoldning 1,7,10,11. At forstå processen af proteinfoldning in vivo, i cellen, der i sidste ende koblet til processen af proteinsyntese er det vigtigt at opnå omfattende indsigt i virkningen af kodonanvendelse / tRNA indhold på bevægelsen af ribosomer langs mRNA under translationel brudforlængelse .
Her beskriver vi en enkel teknik, der kan anvendes til at lokalisere større oversættelse pause-steder for et givet mRNA translateres i forskellige cellefrie systemer 6-8. Denne procedure er baseret på isolering af spirende polypeptider accumulating på ribosomer under in vitro-translation af et mål-mRNA. Rationalet er, at lavfrekvente kodoner, stigningen i opholdstiden af ribosomerne resulterer i forøgede mængder af nascente peptider til de tilsvarende størrelser. In vitro-transkriberet mRNA anvendes til in vitro translationelle reaktioner i nærvær af radioaktivt mærkede aminosyrer at tillade påvisning af spirende kæder. For at isolere ribosom bundne nascente polypeptidkomplekser oversættelsen reaktionen lag oven på 30% glycerol-opløsning efterfulgt af centrifugering. Spirende polypeptider i polysomalt pellet behandles yderligere med ribonuclease A og adskilt ved SDS PAGE. Denne teknik kan potentielt anvendes til hvilket som helst protein og tillader analyse af ribosomet bevægelse langs mRNA og påvisning af de store pause-steder. Derudover kan denne protokol tilpasses til at studere faktorer og forhold, der kan ændre ribosom bevægelse og dermed potentielt kan også ændre the funktion / konformation af proteinet.
Protocol
1. DNA-template Fremstilling og in vitro-transskription
- Genet af interesse klones under T7 og / eller f.eks SP6 transkriptionel promotor.
- Til in vitro-transkription af template-DNA lineariseret med et passende restriktionsenzym skære nedstrøms for ORF stopkodon og / eller mRNA 3'-enden. Et behov for at kontrollere fuldstændig linearisering af plasmid-DNA ved at køre restriktionsfordøjelse produktet agarosegelelektroforese.
- Det lineariserede plasmid anvendes til in vitro transcription reaktionen. Forskellige koncentrationer af template-DNA kan testes for at identificere optimale DNA koncentration, der kræves til in vitro transkription. Generelt med Ambion s MEGAscript Højt udbytte Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), giver en ug lineariseret DNA 40-60 ug mRNA. In vitro transkription sker efter fabrikantens anvisninger (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- Efter in vitro-transkription af mRNA oprenses ved lithiumchlorid fældning ifølge producentens instruktioner (Ambion s MEGAscript Højt udbytte Transcription Kit).
- mRNA integritet yderligere efterprøves ved elektroforese på acrylamidgeler eller agarose geler.
2. In vitro cellefrit Translation
For in vitro translation med R abbit R eticulocyte Lysate, RRL (Promega, Madison, WI) følge nedenstående trin:
- Fremstilling af 100 gl in vitro translationsreaktion følgende producentens anvisninger. Kort fortalt, i nuclease frit vand tilsættes 2 ul aminosyreblanding minus methionin (1 mM), 10 enheder RNase-inhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi af radioaktivt [35S]-methionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 pi af kanin-reticulocytlysat (Promega, Madison, WI).
- Inkuber the reaktion ved 30 ° C i 5 minutter til præ opvarmes translationsreaktionen. Tilsættes 2 ug mRNA til translation reaktionen og inkuber ved 30 ° C i 5 min.
- Reaktionen standses ved at placere translationsreaktionen på is.
3. Isolering af nascente polypeptider fra in vitro translationsreaktion
- At isolere nascente polypeptid bundet til ribosomer (polysom) er translationsreaktion i lag oven på 4,5 ml 30% glycerol i 10 mM Tris-HCl puffer pH 7,6, indeholdende 100 mM KCI, 10 mM MgCl2, og centrifugeret ved 100.000 x g i en TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) i 1 time ved 4 ° C.
- Supernatanten yderligere omhyggeligt fjernet.
- Den polysomalt pellet indeholdende nascente polypeptider resuspenderes i et lille volumen (10-15 pl) af 1 mM Tris-HCl puffer pH 7,6, indeholdende 0,5 mg / ml ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Forat forøge hydrolysen af peptidyl-tRNA esterbinding, er NaOH tilsættes til en slutkoncentration på 10 mM, og inkubationen fortsættes i yderligere 30 minutter.
Translationsreaktion in vitro samles uden mRNA og udføres under de samme betingelser (efterfulgt af isolering af nascente peptider, som er blevet beskrevet) vil tjene som en større kontrol. Behandling af translationsreaktionen (r) med puromycin før ekstrakten underkastes densitetsgradientcentrifugering kan tjene som en yderligere kontrol.
4. Løsning af Nascent polypeptidet på Tris-tricin SDS-PAGE
- De isolerede spirende polypeptider løses, og analyseres på Tris-tricin SDS-PAGE. Bemærk, at mængden af materiale fyldt på gelen vil afhængig af effektiviteten af protein mærkning effektivitet på protein translation og mange andre parametre. Mængden af fyldte materiale skal justeres empirisk til at tillade BESt visualisering og adskillelse af individuelle nascente polypeptidkæder.
- Efter elektroforesegeler er fastgjort, tørres under anvendelse af vakuum gel Dyer og underkastet autoradiografi. Fordelingen af nascente polypeptider, ved anvendelse phosphoimaging.
5. Repræsentative resultater
Bovin gamma-B crystallin blev translateret i kanin-reticulocytlysat samt E. coli S30-ekstrakt Systems (Promega, Madison, WI), efterfulgt af isolering af nascente polypeptidkæder. Figur 1 viser trinene, der er involveret i isolering af ribosom bundne nascente kæder. I den foreliggende undersøgelse Formålet var at teste, om at ændre miljøet af translation, dvs repertoire af tRNA'er (kendt for at være væsentligt forskellige i pattedyr (RRL) og prokaryote (E. coli) systemer på grund af forskelle i kodon-bias mellem organismer) kan ændre ribosom bevægelse langs mRNA og påvirke fordelingen af oversættelses-pause-steder.Altered ribosom bevægelse bør føre til ændringer i fordelingen af størrelser af nascente polypeptider akkumuleret under translation, såvel som deres relative intensiteter. Relative intensiteter af båndene afspejler varigheden af pausen. De spirende polypeptider blev isoleret og opløst på 16,5% T, 6% C Tris-tricin SDS PAGE (figur 2). Gamma-B crystallin er et 20 kDa protein. Observation af nascente polypeptider af ikke-identiske længder og intensiteter i RRL og E. coli systemer indikerer, at bevægelsen af ribosomer langs mRNA i disse to systemer følger forskellige oversættelse kinetik. For eksempel, observerede vi en fremtrædende bånd på 17,7 kDa i E. coli-lysat og ikke RRL systemet, hvilket tyder på, at der er en yderligere translationelle pause-sted i 3'-enden region af mRNA (kodende for C-terminale region af gamma B crystallin), når det omsættes med E. coli-systemet. Vi bemærker, at Gamma-B crvstallin havne tandem Arg kodoner (AGG 153 og AGA 154), der er hyppige hos mammale systemer, men er kendt for at være ekstremt sjælden og langsomt omsat i E. coli En hidtil ukendt nascente peptid akkumuleres i E. coli-system (~ 17,7 kDa figur 2,2) er sandsynligvis forårsaget af ribosom pause på disse tandem sjældne codons. Bemærk, at der ikke bånd kan observeres i fravær af mRNA (figur 2,3), og at puromycin behandling fjerner de fleste af de spirende kæder fra polysomerne (figur 2,3). Langvarig behandling med puromycin (> 15 min), fjernes alle de nascente kæder (data ikke vist). Dette bekræfter, at de observerede polypeptid produkterne er ribo tilhørende spirende kæder, snarere end mRNPs cosedimenting med polysomer.
Som nævnt ovenfor kodon-bias er organisme samt vævsspecifik. Det repræsentativt eksempel beskrives her, viser klart, at ændre miljøet i oversættelsen, dvs repertoire af tRNA'er / codonforspænding kan føre til ændret bevægelse af ribosomet langs mRNA. Åbenbart, kan denne simple teknik ikke kun tillader identifikation af translationelle pause-steder langs mRNA, men også tillader hurtig sammenligning af forskydningsstyrene pause-steder mellem forskellige systemer.
Figur 1. Skematiske forklare de trin der er involveret i isolering ribosom bundne fremspirende polypeptider. Bovint gamma-B crystallin ORF-sekvens (528 basepar) blev klonet nedstrøms for T7-promotoren i pBSKS +. Til in vitro-transkription af skabelon-DNA blev lineariseret ved behandling med EcoRI. Lineariserede skabelon blev anvendt til in vitro transkription. T7-promotoren i DNA-templaten er anerkendt af T7 RNA polymerase, som transkriberer den nedstrøms Gamma-B crystallin-genet. mRNA renses under anvendelse af lithiumchlorid udfældning metode. Det oprensede mRNA anvendes til in vitro-translation. Efterinkubation translationsreaktion er lagt oven på 30% glycerol-opløsning og centrifugeret i 1 time ved 4 ° C ved 100.000 X g for at isolere ribosom bundne nascente polypeptider.
Figur 2. Isolering af bovint gamma-B crvstallin spirende polypeptider oversatte i kaninreticulocytlysat (RRL) og E. coli-lysat. 2 ug mRNA blev blandet i 100 ul reaktionsblanding indeholdende RRL eller E. coli S30-ekstrakt System (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner med 20 gCi [35S]-methionin og inkuberet ved 30 ° C i 5 min. Efter inkubation af translationsreaktionen blev lagt oven på 4,5 ml 30% glycerol i 10 mM Tris-HCl puffer pH 7,6, indeholdende 100 mM KCI, 10 mM MgCl2, og centrifugeret i 1 time ved 4 ° C og 100.000 X g i en TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Den isolerede polyribosome pellet blev resuspended i 20 ul 1 mM Tris-HCl pH 7,6, indeholdende 0,5 mg / ml ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) efterfulgt af behandling med NaOH (som beskrevet i protokollen afsnit). Spirende polypeptider blev opløst på 16,5% T, 6% C Tris-Tricine SDS PAGE-gel. Gelen blev tørret og eksponeret for autoradiografi. Efter eksponering gelen blev scannet ved hjælp af GE Healthcares Typhoon Imaging Scanner. Figur 2,1 viser gelen med spirende polypeptider isoleret og forsvandt efter oversættelse reaktioner gøres på to forskellige systemer (RRL og E. coli). Figur 2,2 Gelen blev analyseret af Image Quant TL ., v2005 software og bruges her som et eksempel for at vise, at den molekylære vægt og intensiteten af de spirende polypeptider akkumuleres i to systemer kan let analyseret og sammenlignet Figur 2,3 viser to sæt for kontrol: spirende polypeptider isoleret og løst på SDS PAGE efter oversættelse reaktioner blev samletuden mRNA og / eller efter translationsreaktioner blev behandlet med puromycin (5 min, slutkoncentration. 1 mM) før reaktionen blev underkastet centrifugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For reproducerbare resultater, og koncentration af de komponenter, der anvendes til in vitro-transkriptions-og translationsreaktioner er kritiske. I den aktuelle undersøgelse har vi anvendt kommercielt tilgængelige kits og ekstrakter, der tilvejebringer meget reproducerbare data, hvis den håndteres forsigtigt. Imidlertid kan translation-kompetente ekstrakter kan fremstilles ud fra cellen af et valg, hvis det er nødvendigt. Kvaliteten af mRNA kan påvirke translation, så er det af yderste vigtighed for at teste integriteten af mRNA'er før brug under in vitro-translation.
Yderligere, varigheden af in vitro translationsreaktionen skal optimeres for hvert enkelt protein. Dette er et kritisk skridt til isolering af spirende polypeptider. Forlænget inkubation fører til syntesen af fuld-længde protein, og frigivelsen af størstedelen af nascente polypeptider fra ribosomet. Inkubationstid kan optimeres ved at udføre in vitro-translation reactions med forskellige tidspunkter. Når den minimale tid, der kræves til oversættelse af fuld-længde protein er etableret, næste trin er at gøre et andet sæt eksperimenter omkring dette tidsrum og identificere inkubationsperioden, hvor de fleste af de nascente polypeptider ville stadig bundet til ribosomet (s ) (dvs. oversættelse indledning og afslutning processer vil stadig være i ligevægt). Oversættelsen Reaktionen kan også standses ved tilsætning af antibiotika, der standser translationel forlængelsesegenskaber (f.eks cycloheximid). Det er indlysende, at dette eksperimentelle system ville muliggøre opløsning og analyse af de vigtigste pause-steder langs mRNA og løse kapacitet af gelen, der skal anvendes vil have en væsentlig indflydelse på kvaliteten af resultaterne. Tricin-natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese tillader separation af proteiner i intervallet fra 1 til 100 kDa anbefales til anvendelse i disse typer af eksperimenter 12. Det skal bemærkes, at denne strategikan også tilpasses til analysen af placeringen af pause-steder i proteinekspression in vivo (i celler). I sidstnævnte tilfælde bør den samlede polysomalt fraktion fra metabolisk mærkede celler isoleres først. Polysomer oversættelse af specifikke mRNA af interesse, bør isoleres derefter ved immunopræcipitation med anti-(protein af interesse) specifikke antistoffer og analyse af de mærkede spirende kæderne bør gøres som beskrevet. Det foretrækkes at anvende antistoffer rettet mod N-terminale region af proteinet af interesse. Om nødvendigt kan proteinet af interesse mærkes med fx FLAG-peptid for at sikre effektiv trække ned. En alternativ protokol baseret på selektiv isolering af oversætte ribosomer bundet til et biotin-mærket mRNA er også for nylig decribed 13. Det skal bemærkes, at en mere nøjagtig bestemmelse af oversættelse pause-steder, især til store proteiner, kan man anvende micrococcal nuklease-beskyttelsesanalyse assay 5. En modifikation af than senere assay, der bygger på den dybe sekventering af ribosom-beskyttede mRNA fragmenter og muliggør undersøgelse af protein translationelle dynamik på genomet-plan, er også blevet beskrevet 14.
Den enkle og yderst fleksibel teknik er beskrevet i dette papir kan bruges til at følge bevægelsen af ribosomer langs mRNA, hjælpe med at identificere oversættelse pause lokaliteter og test faktorer og forhold, der kan ændre ribosom bevægelser under translationel forlængelse. Det kan potentielt anvendes til optimering af co-translationel proteinfoldning i heterologt system (r) ved at justere de korrekte placeringer af de store oversættelse pause-steder ved anvendelse af synonyme kodonsubstitutioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Human Frontier Science Program tilskud RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
