Summary
MRNA के पर translational को थामने साइटों की पहचान तकनीक वर्णित है. इस प्रक्रिया नवजात के दौरान एक लक्ष्य mRNA की इन विट्रो अनुवाद, नवजात denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग श्रृंखला के आकार के विश्लेषण के बाद में राइबोसोम पर जमते polypeptides के अलगाव पर आधारित है.
Protocol
1. डीएनए खाका और इन विट्रो प्रतिलेखन में तैयार
- T7 और / या जैसे SP6 transcriptional प्रमोटर के तहत ब्याज की जीन क्लोन है.
- टेम्पलेट डीएनए के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में एक उपयुक्त प्रतिबंध के बहाव के ओआरएफ बंद codon और / या 3 'अंत mRNA के काटने एंजाइम के साथ linearized है. एक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर प्रतिबंध पाचन उत्पाद चलाकर प्लास्मिड डीएनए की पूरी linearization को सत्यापित करने की जरूरत है.
- linearized प्लाज्मिड के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में किया जाता है. टेम्पलेट डीएनए के विभिन्न एकाग्रता के इष्टतम डीएनए के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में एकाग्रता की आवश्यकता की पहचान के लिए परीक्षण किया जा सकता है. आम तौर पर, Ambion MEGAscript उच्च उपज ट्रांसक्रिप्शन किट (Ambion / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के साथ, एक डीएनए linearized μg mRNA की 40-60 μg पैदावार विट्रो प्रतिलेखन में निर्माता के अनुदेश (Ambion / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड Islan के बाद किया जाता है.घ, NY).
- विट्रो प्रतिलेखन में बाद mRNA के निर्माता के अनुदेश (Ambion MEGAscript उच्च उपज ट्रांसक्रिप्शन किट) के अनुसार लिथियम क्लोराइड तेज़ी द्वारा शुद्ध होता है.
- mRNA के अखंडता और acrylamide या agarose जैल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सत्यापित है.
2. इन विट्रो सेल नि: शुल्क अनुवाद
इन विट्रो आर आर abbit eticulocyte lysate, RRL (Promega, मैडिसन, WI) का उपयोग कर नीचे दिए गए चरणों का पालन अनुवाद के लिए:
- इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रिया निम्नलिखित निर्माता के अनुदेश में 100 μl तैयार. संक्षेप में, nuclease मुफ्त पानी में 2 μl एमिनो एसिड मिश्रण ऋण methionine (1 मिमी), RNase अवरोध करनेवाला (Invitrogen / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY), 20 रेडियोधर्मी की μCi [35 एस] Methionine (सांसद Biomedicals की 10 इकाइयों को जोड़ने के लिए, Solon, OH), खरगोश Reticulocyte lysate (Promega, मैडिसन, WI) के 70 μl.
- वें सेते हैं30 डिग्री सेल्सियस पर गर्म अनुवाद प्रतिक्रिया पूर्व 5 मिनट के लिए ई प्रतिक्रिया. अनुवाद प्रतिक्रिया और 5 मिनट के लिए 30 ° सी में सेते हैं mRNA की 2 μg जोड़ें.
- बर्फ पर प्रतिक्रिया अनुवाद रखकर प्रतिक्रिया बंद करो.
3. नवजात polypeptides की इन विट्रो अनुवाद रिएक्शन में से अलगाव
- नवजात राइबोसोम (polysome) करने के लिए बाध्य पॉलीपेप्टाइड अलग, अनुवाद प्रतिक्रिया के 30% ग्लिसरॉल के 4.5 मिलीग्राम के शीर्ष पर 10 मिमी Tris - एचसीएल बफर पीएच 7.6 में स्तरित है, 100 मिमी KCl, 10 मिमी 2 MgCI युक्त, और 100.000 एक्स जी Centrifuged 1 घंटे के लिए एक TLA-110 (Beckman कल्टर, इंक, Brea, CA) 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटर में
- सतह पर तैरनेवाला आगे ध्यान से हटा दिया जाता है.
- polysomal नवजात polypeptides युक्त गोली 1 मिमी Tris - एचसीएल बफर पीएच 7.6 की एक छोटी मात्रा (10-15 μl) में resuspended है, 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर ribonuclease के (Invitrogen / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) और के लिए incubated रहे युक्त 37 पर 30 मिनट डिग्री सेल्सियस आदेश मेंएस्टर peptidyl-tRNA बांड की hydrolysis को बढ़ाने के लिए, NaOH 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा जाता है, और ऊष्मायन अतिरिक्त 30 मिनट के लिए जारी रखा है.
इन विट्रो में अनुवाद प्रतिक्रिया mRNA के बिना इकट्ठे और एक ही स्थितियों (नवजात पेप्टाइड्स के अलगाव के रूप में वर्णित किया गया है के बाद) के तहत प्रदर्शन एक प्रमुख नियंत्रण के रूप में काम करेगा. अनुवाद (ओं) puromycin साथ घनत्व ढाल centrifugation निकालने को subjecting से पहले प्रतिक्रिया के उपचार के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकता है.
4. Tris tricine एसडीएस पृष्ठ पर नवजात polypeptide हल
- अलग नवजात polypeptides हल कर रहे हैं और Tris tricine एसडीएस पृष्ठ पर विश्लेषण किया. कृपया ध्यान दें कि सामग्री की राशि प्रोटीन लेबलिंग, प्रोटीन अनुवाद और कई दूसरों मापदंडों पर क्षमता की क्षमता पर निर्भर करेगा जेल पर लोड. भरी हुई सामग्री की मात्रा empirically का bes की अनुमति समायोजित किया जाना चाहिएटी दृश्य और व्यक्ति नवजात पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला की जुदाई.
- वैद्युतकणसंचलन जैल के बाद तय कर रहे हैं, निर्वात जेल डायर का उपयोग और autoradiography के अधीन सूखे. नवजात polypeptides का वितरण phosphoimaging का उपयोग कर मनाया जाता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
गोजातीय गामा बी crystallin खरगोश Reticulocyte lysate में अनुवाद किया गया था के रूप में ई. में कोलाई S30 निकालें सिस्टम (Promega, मैडिसन, WI) नवजात पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के अलगाव के द्वारा पीछा किया चित्रा 1 ribosome बाध्य नवजात श्रृंखला के अलगाव में शामिल कदम दर्शाया गया है. वर्तमान अध्ययन में उद्देश्य के लिए परीक्षण किया गया था, अगर अनुवाद codon पूर्वाग्रह में जीवों के बीच मतभेद की वजह से काफी स्तनधारी में अलग (RRL) और prokaryotic सिस्टम (ई. कोलाई) हो जाता tRNAs कर सकते हैं अर्थात् प्रदर्शनों की सूची के वातावरण बदल रहा है mRNA के साथ ribosome के आंदोलन को बदलने और अनुवाद को थामने साइटों का वितरण प्रभाव.बदल ribosome नवजात अनुवाद के रूप में अच्छी तरह से उनके रिश्तेदार तीव्रता के दौरान जमा polypeptides के आकार के वितरण में परिवर्तन के लिए आंदोलन का नेतृत्व करना चाहिए. बैंड के सापेक्ष तीव्रता के ठहराव की अवधि को प्रतिबिंबित. नवजात के polypeptides अलग थे और 16.5% टी, सी 6% Tris tricine एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 2) पर हल. गामा - बी crystallin 20 केडीए प्रोटीन है. गैर समान RRL और ई. में तीव्रता और लंबाई के polypeptides नवजात का अवलोकन कोलाई सिस्टम इंगित करता है कि mRNA के साथ इन दोनों प्रणालियों में ribosomes की आवाजाही अलग अनुवाद कैनेटीक्स. उदाहरण के लिए, हम ई. में 17.7 केडीए के एक प्रमुख बैंड मनाया कोलाई और lysate RRL प्रणाली में नहीं है, सुझाव है कि वहाँ एक अतिरिक्त mRNA की 3'-अंत क्षेत्र (एन्कोडिंग सी टर्मिनल गामा बी crystallin के क्षेत्र), translational को थामने साइट है, जब यह ई. में अनुवाद किया है प्रणाली कोलाई. ध्यान दें कि हम गामा बी crystallin बंदरगाहों मिलकर Arg codons (1 AGG53 और आगा 154) कि स्तनधारी सिस्टम में पाये जाते हैं, लेकिन अत्यंत दुर्लभ है और धीरे धीरे ई. में अनुवाद हो जाता है कोलाई एक उपन्यास नवजात ई. में जमते पेप्टाइड कोलाई प्रणाली (~ 17.7 में केडीए 2.2 चित्रा) की संभावना इन मिलकर दुर्लभ codons में ribosome रोक के कारण होता है. कृपया ध्यान दें कि कोई बैंड mRNA का अभाव (2.3 चित्रा) में देखा जा सकता है और कि puromycin उपचार polysomes (2.3 चित्रा) से नवजात श्रृंखला के सबसे को हटा. Puromycin (15 मिनट) के साथ लम्बे समय तक इलाज के सभी नवजात श्रृंखला (नहीं दिखाया डेटा) को हटा. यह पुष्टि की है कि मनाया पॉलीपेप्टाइड उत्पादों ribosome बल्कि polysomes साथ cosedimenting mRNPs से जुड़े नवजात चेन, कर रहे हैं.
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, codon पूर्वाग्रह के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट ऊतक जीव है. प्रतिनिधि उदाहरण यहाँ वर्णित है, स्पष्ट रूप से इंगित करता है कि tRNAs / codon का अनुवाद यानी प्रदर्शनों की सूची का माहौल बदलपूर्वाग्रह ribosome की mRNA के साथ बदल आंदोलन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. जाहिर है, इस सरल तकनीक केवल mRNA के साथ translational को थामने साइटों की पहचान नहीं की अनुमति है, लेकिन हो सकता है भी तेजी से विभिन्न प्रणालियों के बीच अनुवाद को थामने साइटों की तुलना परमिट.
आकृति 1. योजनाबद्ध के ribosome बाध्य नवजात polypeptides अलग में शामिल कदम समझा. गोजातीय गामा B है crystallin ओआरएफ अनुक्रम (528 आधार जोड़े) T7 प्रमोटर के बहाव pBSKS में क्लोन किया गया था + +. इन विट्रो प्रतिलेखन में के लिए टेम्पलेट डीएनए EcoRI के साथ इलाज के द्वारा में linearized किया गया. Linearized टेम्पलेट के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में इस्तेमाल किया गया था. डीएनए टेम्पलेट में T7 प्रमोटर T7 शाही सेना पोलीमरेज़ कि बहाव गामा बी crystallin जीन transcribes द्वारा मान्यता प्राप्त है. mRNA के लिथियम क्लोराइड तेज़ी विधि का उपयोग कर शुद्ध होता है. शुद्ध mRNA के लिए इन विट्रो में अनुवाद में प्रयोग किया जाता है. निम्नलिखितऊष्मायन, अनुवाद प्रतिक्रिया 30% ग्लिसरॉल समाधान के शीर्ष पर स्तरित है और 4 में 1 घंटे के लिए Centrifuged ° 100.000 एक्स जी सी है ribosome बाध्य नवजात polypeptides अलग.
चित्रा 2. गोजातीय गामा बी crystallin नवजात खरगोश Reticulocyte lysate (RRL) और ई. में अनुवाद polypeptides का अलगाव कोलाई lysate 2 μg mRNA के. 100 μl RRL या ई युक्त प्रतिक्रिया में मिलाया गया था कोलाई S30 निकालें 20 μCi Methionine और 30 में incubated रहे [35 एस] डिग्री सेल्सियस के साथ 5 मिनट के लिए निर्माता अनुदेश के अनुसार सिस्टम (Promega, मैडिसन, WI). निम्नलिखित ऊष्मायन अनुवाद प्रतिक्रिया 30% ग्लिसरॉल के 4.5 मिलीग्राम के शीर्ष पर 10 मिमी Tris - एचसीएल बफर पीएच 7.6 में स्तरित किया गया था, 100 मिमी KCl, 10 मिमी 2 MgCI युक्त, और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 100,000 एक्स जी Centrifuged में TLA 110 रोटर (Beckman कल्टर, इंक, Brea, सीए). अलग polyribosome गोली resu1 मिमी Tris - एचसीएल 7.6 पीएच के 20 μl में spended, 0.5 मिलीग्राम / मिलीग्राम ribonuclease युक्त (Invitrogen / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) NaOH (के रूप में प्रोटोकॉल खंड में वर्णित है) के साथ उपचार के बाद. नवजात polypeptides 16.5% टी, सी 6% Tris Tricine एसडीएस पृष्ठ जेल पर सुलझाया गया. जेल सूखे और autoradiography के लिए उजागर किया गया था. प्रदर्शन के बाद जेल जीई हेल्थकेयर आंधी इमेजिंग स्कैनर का उपयोग कर स्कैन किया गया 2.1 चित्रा नवजात अलग और हल अनुवाद प्रतिक्रियाओं के बाद दो अलग अलग प्रणालियों (RRL और ई. कोलाई) में किया polypeptides साथ जेल से पता चलता है. 2.2 चित्रा जेल छवि बल्ली से ढकेलना TL द्वारा विश्लेषण किया गया था नवजात अलग और हल अनुवाद polypeptides बाद एसडीएस पेज पर: v2005 सॉफ्टवेयर और यहाँ एक उदाहरण के रूप में दिखाने के लिए कि आणविक वजन और नवजात दोनों पद्धतियों में जमा polypeptides की तीव्रता को आसानी से और विश्लेषण कर सकते हैं की तुलना में 2.3 चित्रा नियंत्रण के दो सेट से पता चलता है प्रतिक्रियाओं इकट्ठे थेmRNA और / या के बाद बिना अनुवाद प्रतिक्रियाओं puromycin (5 मिनट, अंतिम सान्द्र 1 मिमी.) के साथ इलाज किया गया है से पहले प्रतिक्रिया centrifugation के अधीन किया गया था.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम है, और इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया घटकों की गुणवत्ता एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण हैं. वर्तमान अध्ययन में हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट और निष्कर्षों की है कि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्रदान करते हैं, अगर ध्यान से संभाला इस्तेमाल किया है. हालांकि, अनुवाद - सक्षम अर्क एक पसंद के सेल से तैयार किया जा सकता है, अगर जरूरत है. MRNA की गुणवत्ता अनुवाद को प्रभावित कर सकते हैं, तो यह अत्यंत महत्व का है यह इन विट्रो में अनुवाद के दौरान प्रयोग करने से पहले mRNAs की अखंडता का परीक्षण है.
इसके अलावा, इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रिया में की अवधि के लिए प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है. यह नवजात polypeptides के अलगाव के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. विस्तारित ऊष्मायन पूर्ण लंबाई प्रोटीन के संश्लेषण और ribosomes से नवजात polypeptides के बहुमत की रिहाई की ओर जाता है. ऊष्मायन समय इन विट्रो अनुवाद में प्रदर्शन से अनुकूलित किया जा सकता है आरअलग अलग समय अंक के साथ eactions. एक बार पूर्ण लंबाई प्रोटीन के अनुवाद के लिए आवश्यक न्यूनतम समय स्थापित है, अगले कदम के लिए चारों ओर इस समय अवधि के प्रयोगों का एक और सेट करने और ऊष्मायन अवधि की पहचान, जहां नवजात polypeptides की सबसे अभी भी ribosome (ओं बाध्य किया जाएगा ) (यानी अनुवाद दीक्षा और समाप्ति प्रक्रिया अभी भी संतुलन में होगा). अनुवाद प्रतिक्रिया भी कि गिरफ्तारी के लिए translational बढ़ाव एंटीबायोटिक दवाओं (cycloheximide उदाहरण के लिए) को जोड़ने के द्वारा रोका जा सकता है. यह स्पष्ट है कि यह प्रायोगिक प्रणाली की अनुमति होगी और mRNA के साथ प्रमुख को थामने साइटों और जेल के लिए इस्तेमाल किया जा प्रणाली की क्षमता को हल करने का संकल्प विश्लेषण परिणामों की गुणवत्ता पर एक बड़ा असर होता है. Tricine सोडियम dodecyl जेल सल्फेट polyacrylamide प्रोटीन के 1 से 100 केडीए के लिए रेंज में जुदाई की अनुमति वैद्युतकणसंचलन 12 प्रयोगों के इन प्रकार में उपयोग के लिए अत्यधिक की सिफारिश की है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस रणनीतिभी vivo में प्रोटीन अभिव्यक्ति की कोशिकाओं में () के दौरान विराम साइटों के स्थान का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. बाद में मामले में, metabolically लेबल की कोशिकाओं से कुल polysomal अंश पहले अलग किया जाना चाहिए. ब्याज की विशिष्ट mRNA अनुवाद polysomes तो (ब्याज की प्रोटीन) विरोधी लेबल नवजात श्रृंखला के विशिष्ट एंटीबॉडी और विश्लेषण के रूप में वर्णित किया जाना चाहिए के साथ immunoprecipitation से अलग किया जाना चाहिए. यह ब्याज की प्रोटीन के क्षेत्र में एन टर्मिनल के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए बेहतर है. यदि आवश्यक हो, तो ब्याज की प्रोटीन जैसे झंडा पेप्टाइड के साथ टैग किया जा सकता है कुशल नीचे खींच करने के लिए सुनिश्चित करें. एक वैकल्पिक अनुवाद एक बायोटिन लेबल की mRNA के लिए बाध्य ribosomes की चयनात्मक अलगाव पर आधारित प्रोटोकॉल भी किया गया है हाल ही में वर्णित 13. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अनुवाद को थामने साइटों की सही बड़े प्रोटीन के लिए विशेष रूप से, दृढ़ संकल्प के लिए एक micrococcal nuclease संरक्षण 5 परख का उपयोग कर सकते हैं चाहिए. टी के एक संशोधनवह बाद में परख, जो ribosome की रक्षा mRNA के टुकड़े की गहरी अनुक्रमण पर आधारित है और जीनोम चौड़ा स्तर पर प्रोटीन translational गतिशीलता की जांच के लिए सक्षम बनाता भी किया गया है 14 वर्णित है.
सरल और उच्च अनुकूलनीय इस पत्र में वर्णित तकनीक mRNA के साथ राइबोसोम के आंदोलन का पालन करने के लिए, अनुवाद को थामने और भी साइटों परीक्षण कारकों और शर्तों है कि translational बढ़ाव दौरान ribosome के आंदोलन को बदल सकते हैं की पहचान में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह संभवतः से पर्याय codon substitutions के रोजगार के प्रमुख अनुवाद को थामने साइटों की सही स्थानों समायोजन सह translational heterologous प्रणाली (ओं) में प्रोटीन तह के अनुकूलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम RGP0024 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
