Summary
mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.
Abstract
translational 신장의 속도가 아닌 교복이다. 이차 구조, 코돈 사용을 mRNA와 1 참조 관련 단백질 검토를 위해 메시지에 ribosome 운동을 변경할 수도 있습니다 mRNA. 그러나 이제는 널리 동의어 코돈 사용하는 비 균일한 translational 신장 속도 1 차 원인임을 인정있어. 동의어 codons는 동일한 주파수로 사용되지 않습니다. 바이어스가 다른이보다 더 자주 사용하는 일부 codons와 동의어 codons의 사용에 있습니다. 코돈 바이어스는 유기체뿐만 아니라 2,3 구체적인 조직이다. 또한 코돈 사용 빈도가 기원 tRNAs 4의 농도에 직접 비례합니다. 따라서 자주 사용하는 코돈은 더 자주 코돈이 빠르게 드문보다 번역된다는 것을 의미합니다 해당 tRNAs 높은 무리를 가질 것입니다. 따라서, 희귀 codons (잠재 일시 사이트)에 풍부 mRNA의 지역은 원칙적으로 messa에 ribosome 움직임이 느려지며각각의 크기는 5-8의 초기 펩티드의 GE와 명분 축적. 이러한 일시 사이트가 단백질 발현에 대한 기능적 영향을 미칠 수 mRNA 안정성 및 검토를위한 단백질 폴딩 9를 참조하십시오. 실제로, 그것은 같은 일시 중지 사이트의 완화는 mRNA에 ribosome 운동을 변경할 수 있으며, 이후 공동 translational (생체내)을 단백질 폴딩 1,7,10,11의 효율성에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 궁극적으로 그것이 translational 연신율 동안 mRNA를 따라 리보솜의 움직임에 대한 코돈 사용 / tRNA 콘텐츠의 영향으로 종합적인 통찰력을 얻기 위해 필수적인 단백질 합성의 과정에 결합되어 세포에서 생체내의 단백질 접힘의 과정을 이해하려면 .
여기에서 우리는 다양한 세포없는 시스템을 6-8로 번역 주어진 mRNA에 대한 주요 번역 일시 사이트를 찾는 데 사용할 수있는 간단한 기술을 설명합니다. 이 절차는 초기 polypeptides accumulati의 고립을 기반으로합니다대상 mRNA의 체외 번역의 도중 리보솜에 NG. 근거는 낮은 주파수 codons에서 해당 규모의 초기 펩티드의 증가 금액 리보솜 결과의 체류 시간 증가. 체외 베꼈는데 mRNA에서 radioactively 라벨이 아미노산의 존재에 체외에서 translational 반응에 사용되고있다는 것입니다 초기 체인의 검출을 허용합니다. ribosome 바운드 초기 폴리펩티드 단지를 분리하기 위해서는 번역 반응은 원심 분리에 의해 다음에 30 % 글리세롤 용액 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다. polysomal 펠렛의 초기 polypeptides은 더욱 ribonuclease로 치료와 SDS 페이지에 의해 해결된다. 이 기술은 잠재적으로 어떤 단백질에 사용되며 ribosome mRNA를 따라 움직임과 주요 일시 중지 사이트의 검출 분석을 허용 할 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 ribosome 운동을 변경할 수 있으며 따라서 잠재적으로 또 일을 변경할 수있는 요인과 조건을 연구하는 데 적용할 수 있습니다전자 기능 / 단백질의 형태.
Protocol
1. DNA를 템플릿 준비 및 시험 관내 스크립트 작성에
- 관심있는 유전자는 T7 및 / 또는 예 SP6 transcriptional 발기인 아래에 복제됩니다.
- 시험 관내 전사의 내용은 템플릿 DNA가 ORF 정류장 코돈 및 / 또는 mRNA 3 '끝에 스트림 절삭 적절한 제한 효소로 선형있다. 하나는 아가로 오스 겔 전기 영동에 제한 소화 제품을 실행하여 플라스미드 DNA의 완전한 선형화를 확인해야합니다.
- 선형 플라스미드는 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다. 템플릿 DNA의 서로 다른 농도는 시험 관내 전사에 필요한 최적의 DNA 농도를 확인하는 테스트를 할 수 있습니다. 일반적으로 Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)로, 1 μg 선형 DNA는 mRNA의 40-60 μg를 얻을. 시험 관내 전사에는 제조 업체의 지침 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 Islan에 따라 이루어집니다D, NY).
- 시험 관내 전사에 따라 mRNA는 제조 업체의 지침 (Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트)에 따라 염화 리튬의 석출에 의해 정화된다.
- mRNA 무결성이 더욱 아크릴 아미드 또는 아가로 오스 젤에서 전기 영동으로 확인됩니다.
2.에서는 체외 세포 무료 번역
다음 단계를 따르십 R abbit R eticulocyte Lysate, RRL을 (Promega, 매디슨, WI)를 사용하여 체외 번역의 경우 :
- 체외 번역 반응 다음과 같은 제조 업체의 지침에 100 μl를 준비합니다. 간단히, nuclease 무료 물에 2 μl 아미노산 혼합물 마이너스 메티오닌 (1 ㎜), RNase 억제제 (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 방사성의 20 μCi [35 S]-메티오닌 (MP의 Biomedicals 10 단위를 추가, ) 오, 솔론, 토끼 Reticulocyte Lysate (Promega, 매디슨, 위스콘신) 70 μl.
- 일 품어따뜻한 번역 반응을 미리하는 5 분 30 ° C에서 전자 반응. 5 분 30 ° C에서 번역 반응과 부화 mRNA의 2 μg을 추가합니다.
- 얼음 번역 반응을 배치하여 반응을 중지합니다.
3. 체외 번역 반응의 초기 Polypeptides의 분리
- 리보솜 (polysome)에 바인딩 초기 폴리펩티드를 분리하려면 번역 반응이 100 밀리미터 KCl, 10 MM MgCI 2를 포함하는, 10 MM 트리스-HCL 버퍼 산도 7.6에서 30 % 글리세롤 4.5 ML 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 그리고 100,000 X g에서 centrifuged합니다 4 ° C.에 1 시간을위한 TLA-110 로터 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, Inc의 어딘지, CA)에서
- 뜨는는 더욱 신중하게 제거됩니다.
- 어렸을때 polypeptides를 포함 polysomal 펠릿에는 0.5 MG / ML의 ribonuclease (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 그리고위한 incubated를 포함, 1 ㎜ 트리스-HCL 버퍼 산도 7.6의 작은 부피 (10-15 μl)에 resuspended 있습니다 37 30 분 ° C. 순서대로peptidyl-tRNA 에스테르 결합의 가수 분해를 향상시키기 위해, NaOH는 10 mm의 최종 농도에 추가되고, 그리고 부화가 추가로 30 분 동안 계속됩니다.
체외에서 번역 반응 mRNA없이 조립과 동일한 조건 (설명되었습니다대로 초기 펩티드의 분리에 의해 다음) 하에서 수행이 중요한 컨트롤 역할을합니다. 밀도 기울기 원심 분리로 추출한 쓰는 전에 puromycin으로 변환 반응 (들)의 치료는 추가적인 제어 될 수있다.
4. 트리스 - tricine SDS 페이지의 초기 폴리펩티드를 해결
- 격리된 초기 polypeptides가 해결 및 트리스 - tricine SDS-PAGE를 분석하고 있습니다. 물질의 양의 단백질 라벨, 단백질 번역과 많은 다른 파라미터에 대한 효율의 효율성에 관한 것이다 의존 겔에로드합니다. 로드된 물질의 양은 bes 수 있도록 경험적으로 조정되어야합니다t 시각화 및 개별 초기 폴리펩티드 사슬의 분리.
- 전기 영동 장치 젤류가 해결된 후, 진공 젤 다이어를 사용하고 autoradiography를 받게 건조. 어렸을때 polypeptides의 분포는 phosphoimaging를 사용하여 관찰하고 있습니다.
5. 대표 결과
소의 감마-B Crystallin은 잘 E.와 같은 토끼 Reticulocyte의 Lysate로 번역되었다 대장균 S30 추출 시스템 (Promega, 매디슨, 위스콘신) 초기 폴리펩티드 사슬의 고립으로 따라갔다. 그림 1은 ribosome 바운드 초기 체인의 분리에 관여 단계를 묘사. tRNAs (때문에 생물 사이의 코돈 바이어스의 차이로 실질적으로 포유 동물의 다른 (RRL)와 prokaryotic (E. 대장균) 시스템으로 알려져 있음) 수의 번역 즉 레퍼토리의 환경을 변경하는 경우에는 현재의 연구에서는 목표, 테스트하는 것이었다 mRNA 따라 ribosome 운동을 변경하고 번역을 일시 중지 사이트의 분포에 영향을.변경된 ribosome 운동은 번역뿐만 아니라 그들의 상대적인 농도 동안 축적 초기 polypeptides의 크기 분포의 변화로 연결되어야합니다. 밴드의 상대 농도는 일시 정지 기간을 반영합니다. 어렸을때 polypeptides은 고립과 16.5 % T, 6퍼센트 C 트리스-tricine SDS 페이지 (그림 2)에서 해결이되었습니다. 감마-B Crystallin는 20 kDa 단백질이다. RRL와 E가 아닌 동일한 길이와 농도의 초기 polypeptides의 관찰 대장균 시스템은이 두 시스템의 mRNA를 따라 리보솜의 움직임이 다른 번역 속도론을 따른다는 것을 나타냅니다. 예를 들어, E.에 17.7 kDa의 유명 밴드를 관찰 그것은 E.로 번역되었을 때 mRNA의 3' 엔드 지역 (감마 B Crystallin의 인코딩의 C-말단 지역)에서 추가 translational 일시 사이트가있다는 것을 암시 RRL 시스템에서 대장균의 lysate가 아닌, 대장균 시스템. 우리는 참고 감마-B Crystallin 항만 탠덤 아르헨티나 codons (AGG 일포유류 시스템에서 자주 있지만, E. 극히 드문 천천히 번역된 것으로 알려져 53과 AGA 154) 대장균. E.에 축적 소설 초기 펩타이드 대장균 시스템 (~ 17.7 kDa 그림 2.2) 가능성이 탠덤 희귀 codons에서 일시 중지 ribosome로 인해 발생합니다. 어떤 밴드는 mRNA의 부재 (그림 2.3)에서 관찰되지 않으며 그 puromycin 치료가 polysomes (그림 2.3)에서 초기 사슬의 대부분을 제거 할 수있는 점에 유의하십시오. puromycin (> 15 분)와 장기간 치료는 초기 체인 (데이터가 보이지 않음)를 제거합니다. 이것은 관찰된 폴리펩티드 제품이 오히려 polysomes로 cosedimenting mRNPs 이상의 ribosome 관련 초기 체인,한지 확인합니다.
위에서 언급한 바와 같이 코돈 바이어스는 유기체뿐만 아니라 조직마다 다릅니다. 대표적인 예제는 여기에 설명된 분명 tRNAs / 코돈의 번역 즉 레퍼토리의 환경을 변경함을 나타냅니다바이어스는 mRNA 따라 ribosome의 개조 운동으로 이어질 수 있습니다. 결국,이 간단한 방법은 mRNA를 따라 translational 일시 중지 사이트의 신분을 허락할 수 없다뿐만 아니라, 서로 다른 시스템 간의 번역을 일시 중지 사이트의 빠른 비교를 허용합니다.
1 그림. 도식은 ribosome 바운드 초기 polypeptides를 격리에 관련된 단계를 설명. 소의 감마-B Crystallin는 ORF 시퀀스 (528 기본 쌍) pBSKS에서 하류 T7 프로 모터의 복제되었습니다 +. 시험 관내 전사의 내용은 템플릿 DNA가 EcoRI으로 치료하여 선형되었다. 선형화된 템플릿은 시험 관내 전사에 사용되었습니다. DNA를 템플릿 T7 프로 모터는 하류 감마-B Crystallin 유전자를 transcribes T7 RNA 중합 효소에 의해 인정되고 있습니다. mRNA는 염화 리튬의 석출 방법을 사용하여 정화하고 있습니다. 정화 mRNA는 체외 변환에 사용됩니다. 다음의인큐베이션, 번역 반응은 30 % 글리세롤 용액 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 4에서 1 시간 동안 centrifuged되고 ribosome 바운드 초기 polypeptides 격리시킬 100,000 X g에서 ° C에서.
그림 2. 래빗 Reticulocyte Lysate (RRL)와 E로 번역 소의 감마-B Crystallin 초기 polypeptides의 분리 대장균의 Lysate가. 2 μg의 mRNA는 RRL 또는 E를 포함하는 100 μl 반응에 혼합되었다 5 분 20 μCi [35 S]-메티오닌 30시 incubated ° C와 제조 업체의 지시에 따라 대장균 S30 추출 시스템 (Promega, 매디슨, 위스콘신). 아래 부화는 번역 반응이 100 밀리미터 KCl, 10 MM MgCI 2를 포함하는, 10 MM 트리스-HCL 버퍼 산도 7.6에서 30 % 글리세롤 4.5 ML 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 그리고에서 4 ° C와 100,000 X g에서 1 시간 동안 centrifuged되었다 TLA-110 로터 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, Inc의 어딘지, CA). 격리된 polyribosome 펠렛은 열매가 나타나고이었다은 (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕) NaOH (같은 프로토콜 섹션에서 설명)가있는 치료이어서 0.5 MG / ML의 ribonuclease를 포함, 1 ㎜ 트리스-HCL pH는 7.6 20 μl에 spended. 어렸을때 polypeptides은 16.5 % T, 6퍼센트 C 트리스-Tricine SDS PAGE 젤에 해결이되었습니다. 겔은 건조하고 autoradiography에 대해 접했습니다. 노출에 이어 젤은 GE 헬스케어의 태풍 이미징 스캐너를 사용하여 스캔했습니다. 그림 2.1은 번역 반응은 두 가지 다른 시스템 (RRL와 E 대장균)에 완료 이후 격리 및 해결 어렸을때 polypeptides로 젤을 보여줍니다. 그림 2.2는 겔은 이미지 양의 TL에 의해 분석되었다 . 번역 후 SDS 페이지를 격리 및 해결 어렸을때 polypeptides : v2005 소프트웨어와 두 시스템에 축적 초기 polypeptides의 분자량과 강도를 쉽게 분석하고 비교할 수 있도록 표시하는 예제로 여기에 사용되는 그림 2.3 컨트롤의 두 세트를 보여줍니다 반응이 모였습반응은 원심 분리에 노출되기 전에 mRNA 및 / 또는 후에없이 번역 반응 puromycin (5 분, 마지막 conc. 1 ㎜)로 치료되었다.
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Discussion
시험 관내 전사 및 번역 반응에 사용되는 부품의 재현성 결과, 품질과 집중이 중요하십시오. 현재의 연구에서 우리는 주의깊게 처리하는 경우, 높은 재현성 데이터를 제공 상용 키트와 추출물을 사용했다. 필요한 경우에는 번역 - 관할 추출물은 하나의 선택의 세포에서 작성하실 수 있습니다. mRNA의 품질이 번역에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 시험 관내 번역하는 동안 그것을 사용하기 전에 mRNAs의 무결성을 테스트하기 위해 가장 중요합니다.
또한, 체외 변환 반응의 기간은 각각의 단백질을 위해 최적화되어야한다. 이것은 초기 polypeptides의 절연을위한 중요한 단계입니다. 연장 보육은 전체 길이 단백질의 합성과 리보솜에서 초기 polypeptides의 대다수의 출시로 연결. 배양 시간이 체외 번역 수행하여 최적화할 수 R다른 시간 포인트 eactions. 장편 단백질의 번역을 위해 필요한 최소 시간이 설정되면, 다음 단계는 초기 polypeptides의 대부분이 여전히 ribosome (들에 바인딩됩니다 곳이,이 기간 주변 실험의 또 다른 세트를 수행하고 잠복기를 식별하는 것입니다 ) (즉 번역 개시 및 종료 프로세스가 평형 여전히있을 것이다). 번역 반응도 항생제 해당 체포 translational 연신율 (예 cycloheximide)를 추가하여 중지 할 수 있습니다. 그것은이 실험 시스템은 mRNA를 따라 주요 일시 중지 사이트와 사용되는 겔 시스템의 해결 능력 해상도와 분석 결과의 품질에 큰 영향을 미칠 것이 허용 것이 확실하다. 1에서 100 kDa의 범위에서 단백질의 분리를 허용 Tricine - 나트륨 dodecyl 황산염-polyacrylamide 겔 전기 영동은 높은 실험 12 이러한 유형의 사용을 권장합니다. 그것은 지적되어야이 전략또한 생체내 단백질의 발현 (세포)을하는 동안 일시 중지 사이트의 위치의 분석에 적용할 수 있습니다. 나중에 경우에, metabolically 라벨이 세포로부터 총 polysomal 분수가 먼저 격리되어야합니다. 관심있는 특정 mRNA를 번역 Polysomes 그런 다음 설명에 따라 반 (관심있는 단백질)라고 표시된 초기 체인의 특정 항체와 분석이 완료되어야과 immunoprecipitation에 의해 격리되어야한다. 그것은 관심 단백질의 N-말단 지역에 대한 감독이 항체를 사용하는 것이 바람직합니다. 필요하다면, 관심있는 단백질은 효율이 풀다운 보장하기 위해 플래그-펩타이드 예 태그도 가능합니다. 비오틴 - 라벨이 mRNA에 바인딩 번역 리보솜의 선택적 분리를 기반으로 다른 프로토콜도 최근 13 decribed되었습니다. 이것은 특히 큰 단백질에 대한 번역을 일시 중지 사이트의보다 정확한 결정을 위해 하나가 micrococcal nuclease 보호 분석 5를 사용할 수 있다고 언급한다. t의 수정그는 ribosome 보호된 mRNA 조각의 깊은 시퀀싱을 기반으로 게놈 전체의 수준에서 단백질 translational 역학 조사를 가능하게되고 나중에 분석은 또한 14 설명되었습니다.
본 논문에서 설명하는 간단하고 매우 적응력이 기술은 translational 연신율 동안 ribosome 운동을 바꿀 수있는 번역을 일시 중지 사이트와도 테스트 요소와 조건을 식별하는 데 도움이, mRNA를 따라 리보솜의 움직임을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 잠재적으로 동의어로 코돈의 대체를 고용하여 주요 번역을 일시 중지 사이트의 정확한 위치를 조정하여 heterologous 시스템 (들)의 공동 translational 단백질 폴딩의 최적화를 위해 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0024에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
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