Summary
Техника для определения поступательного сайтов паузу на мРНК описано. Эта процедура основана на выделении зарождающейся полипептидов накопления на рибосомы в процессе искусственного перевода целевой мРНК, а затем размер анализ зарождающейся цепи использованием денатурирующих гель-электрофореза.
Protocol
1. Подготовка шаблона ДНК и транскрипции в пробирке
- Гена, клонируют в Т7 и / или, например, SP6 транскрипционный промотор.
- Ибо в пробирке транскрипции ДНК-матрицы линеаризуется с соответствующим ферментом ограничение резки ниже по течению от кодона ORF остановки и / или мРНК 3 'конца. Надо проверить полную линеаризации плазмиды ДНК, запустив продукт рестрикцией на геле агарозы.
- Линеаризованной плазмиды используются для реакции в пробирке транскрипции. Различные концентрации ДНК-матрицы могут быть проверены, чтобы определить оптимальную концентрацию ДНК, необходимые для транскрипции в пробирке. Как правило, с высокой MEGAscript Ambion в транскрипции выход Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 мкг линеаризованной ДНК дает 40-60 мкг мРНК. В пробирке транскрипции осуществляется после инструкции производителя (Ambion / Life Technologies, Grand Islanг, Нью-Йорк).
- После транскрипции в пробирке мРНК очищают осаждения лития хлорид в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (MEGAscript высокой Ambion в транскрипции выход Kit).
- мРНК целостность далее проверена с помощью электрофореза на агарозном акриламида или гели.
2. В пробирке Сотовые Переводчик
Для перевода в пробирке с помощью R abbit R eticulocyte лизата, РРЛ (Promega, Madison, WI) выполните следующие действия:
- Подготовить 100 мкл в инструкции пробирке перевод реакции следующих производителей. Короче говоря, в нуклеазы свободной воды добавить 2 мкл смеси аминокислот минус метионин (1 мм), 10 единиц ингибитора РНКазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 мкКи радиоактивных [35 S]-метионина (MP Biomedicals, Солон, Огайо), 70 мкл лизата ретикулоцитов кролика (Promega, Madison, WI).
- Инкубируйте йэлектронная реакции при 30 ° С в течение 5 минут предварительно теплой перевод реакции. Добавить 2 мкг мРНК реакции переводе и инкубировать при температуре 30 ° С в течение 5 мин.
- Остановить реакцию путем размещения перевод реакции на льду.
3. Выделение стадии становления полипептидов из реакции в пробирке перевода
- Чтобы изолировать рождающегося полипептида связан с рибосомами (polysome), перевод реакции на верхнем уровне 4,5 мл 30% глицерина в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащего 100 мМ KCl, 10 мМ MgCI 2, и центрифугировали при 100000 X г в TLA-110 ротора (Beckman Coulter, Inc, Brea, Калифорния) в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
- Супернатант далее тщательно удалены.
- Polysomal гранул содержащих зарождающейся полипептидов ресуспендируют в небольшом объеме (10-15 мкл) 1 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащий 0,5 мг / мл рибонуклеазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° C. В порядкедля повышения гидролиза пептидил-тРНК эфирную связь, NaOH добавляют до конечной концентрации 10 мМ и инкубацию продолжали еще 30 мин.
В пробирке перевод реакцию собравшихся без мРНК и осуществляется на тех же условиях (с последующим выделением зарождающейся пептидов, как было описано) будет выступать в качестве основного контроля. Лечение перевод реакции (ы) с пуромицином до подвергая экстракт центрифугирования в градиенте плотности может служить в качестве дополнительного контроля.
4. Решение рождающегося полипептида на Трис-tricine SDS PAGE
- Изолированной зарождающейся полипептиды решены и проанализированы на Трис-tricine SDS-PAGE. Пожалуйста, обратите внимание, что количество материала загружается на гель будет зависеть от эффективности белка маркировки, эффективность перевода на белки и многие другие параметры. Количество загруженного материала должна быть скорректирована эмпирически, чтобы бест визуализации и разделения отдельных зарождающейся полипептидной цепи.
- После электрофореза гель фиксированы, сушат вакуум гель красильщика и подвергали авторадиографии. Распределение зарождающейся полипептиды, наблюдаемые с помощью phosphoimaging.
5. Представитель Результаты
Говядина Гамма-B кристаллина был переведен в лизата ретикулоцитов кролика, а также в E. палочки S30 экстракт системы (Promega, Madison, WI) с последующим выделением зарождающейся полипептидной цепи. На рисунке 1 показаны этапы выделения рибосом связанных зарождающейся цепи. В настоящем исследовании цель состояла в том, чтобы проверить, при изменении окружающей среды, т.е. перевод репертуар тРНК (как известно, существенно отличается у млекопитающих (РРЛ) и прокариотических (E.coli), системы связи с различиями в кодон смещения между организмами) может изменить рибосомы движение вдоль мРНК и влиять на распределение участков перевод паузы.Измененные рибосомы движение должно привести к изменениям в распределении размеров зарождающихся полипептидов накапливается в процессе перевода, а также их относительные интенсивности. Относительные интенсивности полос отражает длительность паузы. Зарождающегося полипептиды были выделены и решены на 16,5%, T, C 6% Трис-tricine SDS (Рис. 2). Гамма-B кристаллина в 20 кДа белок. Наблюдение зарождающейся полипептидов неодинаковой длины и интенсивности в РРЛ и Е. кишечной системы показывает, что движение рибосомы вдоль мРНК в этих двух системах следует различных кинетики перевода. Например, мы наблюдали видные группы 17,7 кДа в E. палочки лизат, а не в РРЛ системы, что свидетельствует о наличии дополнительного поступательного сайт паузу в 3'-концевой области мРНК (кодирование C-концевой области гамма-B кристаллина), когда он переводится в E. кишечной системы. Отметим, что гамма-B кристаллина гавани тандем Arg кодона (AGG 153 и AGA 154), которые часто встречаются в млекопитающих, но, как известно, крайне редко и медленно переводится в E. палочка. зарождающегося романа пептид накапливается в E. кишечной системы (~ 17,7 кДа рис. 2.2), скорее всего, вызвано рибосомы останавливаясь на этих тандем редких кодонов. Обратите внимание, что нет полосы можно наблюдать в отсутствие мРНК (рис. 2.3), и что пуромицин обработка удаляет большую часть зарождающейся цепи с полисом (рис. 2.3). Длительное лечение пуромицин (> 15 мин) удаляет все зарождающейся сети (данные не представлены). Это подтверждает, что наблюдаемые полипептидные продукты рибосомы связанный зарождающийся цепи, а не mRNPs cosedimenting с полисом.
Как упоминалось выше, кодон смещения организма, а также ткани конкретно. Представитель пример, описанный здесь, ясно указывает, что изменение окружающей среды перевода, т.е. репертуара тРНК / кодонсмещение может привести к изменено движение рибосомы вдоль мРНК. Очевидно, что этот простой метод не только позволяет идентифицировать поступательного сайтов паузу вдоль мРНК, но и позволяет быстро сравнение перевод сайтов паузы между различными системами.
Рисунок 1. Схематическое объяснение шагов выделить рибосомы связанных зарождающейся полипептидов. Говядине Гамма-B кристаллина ORF последовательность (528 пар оснований) был клонирован вниз по течению от промоутера T7 в pBSKS +. Ибо в пробирке транскрипции шаблона ДНК линеаризовать, рассматривая его с EcoRI. Линеаризованные шаблон был использован в пробирке транскрипции. Т7 промотора в матричной ДНК признается Т7 РНК-полимеразы, что транскрипция вниз гамма-B кристаллина ген. мРНК очищают, используя хлорид лития осадков методом. Очищенные РНК используется для перевода в пробирке. Послеинкубации, перевод реакции на верхнем уровне 30% глицерин и центрифугировали в течение 1 часа при температуре 4 ° С на 100 000 Х г выделить рибосомы связанных зарождающейся полипептидов.
Рисунок 2. Изоляция рогатого Гамма-B кристаллина зарождающейся полипептидов переведены на кролика ретикулоцитов лизата (РРЛ) и Е. палочки лизата. 2 мкг мРНК смешиваются в 100 мкл реакции содержащие РРЛ или E. палочки S30 экстракт системы (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкцией производителя с 20 мкКи [35 S]-метионина и инкубировали при 30 ° C в течение 5 мин. После инкубации перевод реакции на верхнем уровне 4,5 мл 30% глицерина в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащего 100 мМ KCl, 10 мМ MgCI 2, и центрифугировали в течение 1 часа при температуре 4 ° C и 100,000 г Х в TLA-110 ротора (Beckman Coulter, Inc, Brea, Калифорния). Изолированной polyribosome осадок гезиspended в 20 мкл 1 мМ Трис-HCl, рН 7,6, содержащий 0,5 мг / мл рибонуклеазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) с последующей обработкой NaOH (как описано в протоколе раздел). Находятся в стадии становления полипептиды были решены на 16,5%, T, C 6% Трис-Tricine SDS геле. Гель сушили и подвергаются за авторадиографии. После воздействия геля отсканированный с помощью сканера изображений Тайфун GE Healthcare в. Рисунок 2.1 показывает, гель с зарождающейся полипептидов изолированы и решил после перевода реакции сделано в двух разных систем (РРЛ и кишечная палочка). Рисунок 2.2 геле проанализированы изображения Квант TL ., v2005 программного обеспечения и используется здесь в качестве примера, чтобы показать, что молекулярный вес и интенсивность накопления зарождающегося полипептидов в двух системах можно легко проанализировать и сравнить Рисунок 2.3 показывает два набора элементов управления: зарождающийся полипептидов изолированы и решаться на SDS PAGE после перевода реакции были собраныбез мРНК и / или после перевода реакции лечили пуромицин (5 мин, конечная конц. 1 мм) до реакции был подвергнут центрифугирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для воспроизводимости результатов, качества и концентрации компонентов, используемых для транскрипции в пробирке и перевод реакции являются критическими. В настоящем исследовании мы использовали коммерчески доступных наборов и экстракты, которые обеспечивают высокую воспроизводимые данные, если осторожно. Тем не менее, перевод, компетентные экстракты могут быть получены из клетки по своему выбору, если это необходимо. Качество мРНК может повлиять на перевод, так что имеет огромное значение для проверки целостности мРНК, прежде чем использовать его во время перевода в пробирке.
Кроме того, продолжительность реакции в пробирке перевод должен быть оптимизированы для каждого отдельного белка. Это очень важный шаг для изоляции зарождающейся полипептидов. Расширенный инкубации приводит к синтезу полнометражный белка и выхода большинства зарождающейся полипептидов из рибосомы. Время инкубации может быть оптимизирована путем проведения в пробирке перевод тeactions с разных точек времени. После того, минимальное время, необходимое для перевода полнометражных белка установлена, следующий шаг должен сделать другой серии экспериментов в это промежуток времени и определить инкубационный период, когда большая часть зарождающегося полипептидов будет по-прежнему связан с рибосомой (ы ) (т. е. начало перевода и прекращения процессов будет по-прежнему в состоянии равновесия). Перевод реакция также может быть остановлено путем добавления антибиотиков, что арест поступательное относительное удлинение (например, циклогексимид). Очевидно, что эта экспериментальная система позволит разрешением и анализ основных сайтов паузу вдоль мРНК и разрешающая способность гель системы, которые будут использоваться будет иметь большое влияние на качество результатов. Tricine-додецилсульфата натрия-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет разделения белков в диапазоне от 1 до 100 кДа рекомендуется для использования в подобных экспериментов 12. Следует отметить, что эта стратегиятакже может быть адаптирована к анализу расположения пауза сайтов в экспрессии белка в естественных условиях (в клетках). В последнем случае, общая polysomal фракции метаболически меченые клетки должны быть изолированы в первую очередь. Полисом переводе специфической мРНК интересов должны быть затем выделены иммунопреципитации с анти-(белок) специфических антител и анализ меченых зарождающейся цепи должно быть сделано как описано выше. Желательно использовать антитела, направленные против N-концевой области белка интерес. Если необходимо, белок могут быть помечены, например, с FLAG-пептид для обеспечения эффективного снести. Альтернативный протокол, основанный на селективной изоляции переводе рибосомы связаны с биотин-меченых мРНК была недавно decribed 13. Следует отметить, что для более точного определения сайтов перевод паузы, особенно для больших белков можно использовать микрококковой нуклеазы защита анализа 5. Модификация тон позже анализ, основанный на глубоком последовательности рибосомы защищенных фрагментов РНК и позволяет исследование белков поступательного динамики на генома уровне, также был описан 14.
Простой и хорошо адаптируется методике, описанной в этой статье могут быть использованы следовать движению рибосом вдоль мРНК, помочь определить перевод пауза сайты, а также проверка причин и условий, которые могут изменить рибосомы поступательного движения во время удлинения. Он может быть потенциально использованы для оптимизации совместного поступательного сворачивания белка в гетерологичной системе (ы), регулируя правильное расположение основных перевод пауза сайты, используя синонимы замены кодона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась по программе по науке пограничной грант RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
