Summary
En teknik för att identifiera translationella pausa platser på mRNA beskrivs. Detta förfarande grundar sig på isolering av begynnande polypeptider som samlas på ribosomer under in vitro-translation av en mål-mRNA, följt av storleksanalys av begynnande kedjorna med användning av en denaturerande gel-elektrofores.
Abstract
Hastigheten för translationella töjning är olikformig. mRNA sekundär struktur, kodon användning och mRNA associerade proteiner kan förändra ribosomen rörelse på meddelandet för översikt se 1. Men det är nu allmänt accepterat att synonymt kodon användning är den främsta orsaken till icke-enhetliga translationella förlängning priser 1. Synonyma kodon används inte med samma frekvens. En förspänning existerar i användningen av synonyma kodon med vissa kodoner som används mer frekvent än andra 2. Kodon fördomar är organism, liksom vävnadsspecifik 2,3. Dessutom är frekvensen av kodonanvändning direkt proportionell mot koncentrationen av kognat-tRNA-sekvenser 4. Således kommer en ofta använd kodon har högre mängd motsvarande tRNA, vilket ytterligare innebär att en frekvent kodon kommer att översättas snabbare än en sällan en. Således kommer regionerna på mRNA anrikas i sällsynta kodon (potentiella paus platser) som regel långsammare ribosomen rörelse på messaGE och orsaka ackumulering av halvfärdiga peptiderna för de respektive storlekarna 5-8. Dessa paus webbplatser kan ha funktionell påverkan på protein expression, mRNA stabilitet och protein folding för översikt se 9. I själva verket visade det sig att lindra dessa paus webbplatser kan förändra ribosomen rörelse på mRNA och därefter kan påverka effektiviteten av sam-translationell (in vivo) proteinveckning 1,7,10,11. För att förstå processen för proteinveckning in vivo, i cellen, som slutligen är kopplad till processen att proteinsyntesen är det viktigt att få omfattande insikt i effekterna av kodonanvändningen / tRNA innehåll på den fria rörligheten för ribosomer längs mRNA under translationell förlängning .
Här beskriver vi en enkel teknik som kan användas för att lokalisera viktiga platser översättning paus för en viss mRNA översätts i olika cellfria system 6-8. Detta förfarande grundar sig på isolering av begynnande polypeptider accumulating på ribosomer under in vitro-translation av en mål-mRNA. Den logiska grunden är att vid låga frekvenser kodoner, ökningen i uppehållstiden för ribosomer resulterar i ökade mängder av halvfärdiga peptiderna av de motsvarande storlek. In vitro transkriberade mRNA används för in vitro translationella reaktioner i närvaro av radioaktivt märkta aminosyror för att tillåta detektering av de begynnande kedjorna. För att isolera ribosom bundna begynnande polypep-komplex i translationsreaktionen skiktas på toppen av 30% glycerol-lösning följt av centrifugering. Begynnande polypeptider i Polysomalt pellet ska fortsätta behandlas med ribonukleas A och lösas genom SDS-PAGE. Denna teknik kan potentiellt användas för något protein och medger analys av ribosomen rörelse längs mRNA och detektering av de stora paus ställen. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att studera faktorer och förhållanden som kan förändra ribosomen rörelse och därmed potentiellt kan också förändra the funktion / konformation av proteinet.
Protocol
1. DNA-mall Framställning och in vitro transkription
- Genen av intresse klonas i T7-och / eller t.ex. SP6 transkriptions-promotor.
- För in vitro transkription av mall-DNA linjäriseras med ett lämpligt restriktionsenzym skärning nedströms ORF stoppkodonet och / eller mRNA-3 'änden. Man måste verifiera fullständig linearisering av plasmid-DNA genom att köra den produkt restriktionsdigerering på agarosgelelektrofores.
- Den linjäriserade plasmiden användes för in vitro transkriptionsreaktion. Olika koncentrationer av mall-DNA kan testas för att identifiera optimala DNA-koncentration som erfordras för transkription in vitro. Generellt, med Ambion s MEGAscript Hög avkastning Transkription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), ger 1 ng linjär DNA 40-60 pg mRNA. In vitro transkription sker efter tillverkarens instruktioner (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- Efter in vitro transkription av mRNA renas genom litiumklorid fällning enligt tillverkarens instruktioner (Ambion s MEGAscript Hög avkastning Transkription Kit).
- mRNA integritet verifierades ytterligare genom elektrofores på akrylamid eller agaros-geler.
2. In vitro Cell Översättning
För in vitro translation med R abbit R eticulocyte lysatet RRL (Promega, Madison, WI) följer du stegen nedan:
- Framställ 100 pl in vitro translationsreaktion följande tillverkarens instruktioner. Kortfattat, i nukleasfritt vatten tillsätt 2 pl aminosyrablandning minus metionin (1 mM), 10 enheter RNas-inhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 ^ Ci av radioaktivt [35S]-metionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 | il av kanin-retikulocytlysat (Promega, Madison, WI).
- Inkubera: ee reaktionen vid 30 ° C under 5 min för att i förväg värmdes translationsreaktion. Tillsätt 2 | ig av mRNA till translationsreaktionen och inkubera vid 30 ° C under 5 minuter.
- Stoppa reaktionen genom att placera translationsreaktionen på is.
3. Isolering av begynnande Polypeptider från in vitro translationsreaktion
- Att isolera begynnande polypeptid bunden till ribosomer (polysom) är translationsreaktion skiktas på toppen av 4,5 ml av 30% glycerol i 10 mM Tris-HCl-buffert pH 7,6, innehållande 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, och centrifugerades vid 100.000 x g i en TLA-110 rötor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) under 1 h vid 4 ° C.
- Supernatanten ytterligare omsorgsfullt avlägsnas.
- Den Polysomalt pellet innehållande begynnande polypeptider återsuspenderas i en liten volym (10-15 | il) av 1 mM Tris-HCl-buffert pH 7,6, innehållande 0,5 mg / ml ribonukleas A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) och inkuberades under 30 min vid 37 ° C. Förför att öka hydrolys av peptidyl-tRNA-esterbindning är NaOH till en slutlig koncentration av 10 mM och inkubationen fortsätts under ytterligare 30 min.
Translationsreaktionen in vitro monteras utan mRNA och utförs under samma betingelser (följt av isolering av halvfärdiga peptiderna som har beskrivits) kan fungera som en viktig kontroll. Behandling av översättningen reaktion (er) med puromycin innan man utsätter extraktet för densitetsgradientcentrifugering kan tjäna som en ytterligare kontroll.
4. Lösa den framväxande polypeptiden på Tris-tricin SDS-PAGE
- De isolerade begynnande polypeptider löses och analyseras på Tris-tricin SDS-PAGE. Observera att den mängd av materialet laddades på gelén kommer beroende på effektiviteten av proteinmärkning, effektivitet på proteintranslation och många andra parametrar. Mängden laddade material bör justeras empiriskt för att låta best visualisering och separation av individuella begynnande polypeptidkedjor.
- Efter elektrofores-geler fixeras, torkas med användning av vakuum-gel Dyer och utsattes för autoradiografi. Fördelningen av nybildade polypeptider observeras när phosphoimaging.
5. Representativa resultat
Bovint gamma-B-kristallin translaterades i kaninretikulocytlysat och i E. coli S30-extrakt Systems (Promega, Madison, WI), följt av isolering av begynnande polypeptidkedjor. Figur 1 visar stegen som är involverade vid isolering av ribosom bundna begynnande kedjor. I föreliggande studie Syftet var att testa om att förändra miljön för översättning, dvs repertoar av tRNA (känd för att vara väsentligt annorlunda i däggdjur (RRL) och prokaryota (E. coli) system på grund av skillnader i kodon fördomar mellan organismer) kan förändra ribosomen rörelse längs mRNA och påverka fördelningen av platser översättning paus.Förändrad ribosomen rörelsen bör leda till förändringar i fördelningen av storlekar på begynnande polypeptider ackumulerande under översättning, liksom deras relativa intensiteter. Relativa intensiteterna för banden av den tid pausen. De nascenta polypeptider isolerades och upplöstes på 16,5% T, 6% C Tris-tricin SDS-PAGE (figur 2). Gamma-B-kristallin är en 20 kDa-protein. Observation av begynnande polypeptider i icke-identiska längder och intensiteterna anges i RRL och E. coli system indikerar att rörelsen av ribosomer längs mRNA i dessa två system följer olika översättningar kinetik. Till exempel, observerade vi en framträdande band av 17,7 kDa i E. coli-lysat och inte i RRL systemet, vilket tyder på att det finns en ytterligare translationell pausställe i 3'-ändregionen av mRNA (som kodar C-terminala regionen av gamma-B-kristallin), när den förflyttas i E. coli-system. Vi noterar att Gamma-B-kristallin hamnar tandem Arg kodon (AGG 153 och AGA 154) som är vanliga i däggdjurssystem, men är kända att vara extremt sällsynt och långsamt translateras i E. coli En ny begynnande peptid ackumulera i E. coli-systemet (~ 17,7 kDa figur 2,2) är sannolikt orsakas av ribosomen att pausa på dessa tandem sällsynta kodon. Observera att inga band kan observeras i frånvaro av mRNA (Figur 2,3) och att puromycin behandling avlägsnar de flesta av de framväxande kedjor från polysomer (figur 2,3). Långvarig behandling med puromycin (> 15 min) avlägsnar alla halvfärdiga kedjor (data ej visade). Detta bekräftar att de observerade polypeptidprodukter produkterna ribosomen associerade begynnande kedjor, snarare än mRNPs cosedimenting med polysomer.
Såsom nämnts ovan, är kodon förspänning organism, liksom vävnadsspecifik. Den representativt exempel som beskrivs här, visar tydligt att förändra miljön i översättningen, dvs repertoar av tRNA / kodonförspänning kan leda till förändrad rörlighet av ribosomen längs mRNA. Uppenbarligen kan denna enkla metod inte bara tillåta identifieringen av de translationella paus platser längs mRNA, utan också tillåter snabb jämförelse av områdena översättning paus mellan olika system.
Figur 1. Schematisk förklara de steg som är involverade vid isolering ribosom bundna begynnande polypeptider. Bovint gamma-B-kristallin ORF-sekvensen (528 baspar) klonades nedströms om T7-promotorn i pBSKS +. För in vitro transkription av mall-DNA lineariserades genom behandling med EcoRI. Linjäriserad mall användes för in vitro transkription. T7-promotor i DNA-mallen igenkännes av T7 RNA-polymeras transkriberar den nedströms Gamma-B-kristallin-genen. mRNA renas med litium-metoden klorid nederbörd. Den renade mRNA användes för in vitro-translation. Efterinkubation translationsreaktion skiktas på toppen av 30% glycerol-lösning och centrifugerades under 1 h vid 4 ° C vid 100.000 x g för att isolera ribosom bundna begynnande polypeptider.
Figur 2. Isolering av bovint gamma-B-kristallin begynnande polypeptider translaterade i kaninretikulocytlysat (RRL) och E. coli-lysat. var 2 ^ g mRNA blandades i 100 | il reaktion innehållande RRL eller E. coli S30-extrakt (Promega, Madison, WI) enligt tillverkarens instruktioner med 20 | iCi [35S]-metionin och inkuberades vid 30 ° C under 5 minuter. Efter inkubation translationsreaktionen skiktades på toppen av 4,5 ml av 30% glycerol i 10 mM Tris-HCl-buffert pH 7,6, innehållande 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, och centrifugerades under 1 h vid 4 ° C och 100.000 x g i en TLA-110 rötor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Den isolerade polyribosome pelleten var resuspended i 20 | il av 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, innehållande 0,5 mg / ml ribonukleas A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), följt av behandling med NaOH (såsom beskrivs i protokollet sektionen). Begynnande polypeptider upplöstes på 16,5% T, 6% C Tris-tricin SDS PAGE gel. Gelén torkades och exponerades för autoradiografi. Efter exponering gelén skannas med GE Healthcare: s Typhoon Imaging Scanner. Figur 2,1 visar gelen med begynnande polypeptider isolerade och försvann efter översättning reaktioner sker i två olika system (RRL och E. coli). Gelén analyserades med Image Quant TL figur 2,2 visar v2005 mjukvara och används här som ett exempel som visar att molekylvikten och intensiteten av den begynnande polypeptider ackumuleras i två system lätt kan analyseras och jämföras figur 2,3 två kontroller. begynnande polypeptider isolerade och beslutade om SDS PAGE efter translation Reaktionerna sammansattesutan mRNA och / eller efter de translationsreaktioner behandlades med puromycin (5 min, slutlig konc. 1 mM) innan reaktionen utsattes för centrifugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För reproducerbara resultat, kvalitet och koncentrationen av de komponenter som används för in vitro transkriptions-och translationsreaktioner är kritiska. I den aktuella studien har vi använt kommersiellt tillgängliga kit och extrakt som ger mycket reproducerbara data, om den hanteras varsamt. Emellertid kan översättning-kompetenta extrakt framställas från cellen av en val, om så behövs. Kvalitet av mRNA kan påverka translation, så är det av yttersta vikt för att testa integriteten hos mRNA innan den används under in vitro-translation.
Vidare har varaktigheten av in vitro-translationsreaktionen kan optimeras för varje individuellt protein. Detta är ett kritiskt steg för isolering av begynnande polypeptider. Förlängd inkubation leder till syntes av fullängdsproteinet och frisättningen av majoriteten av begynnande polypeptider från ribosomerna. Inkubationstiden kan optimeras genom att utföra in vitro-translation reactions med olika tidpunkter. När den minsta tid som krävs för översättning av fullängdsproteinet är etablerad, är nästa steg att göra en annan uppsättning experiment runt denna tidsperiod och identifiera inkubationstiden, där de flesta framväxande polypeptiderna fortfarande skulle vara bundna till ribosomen (s ) (dvs den translationsinitiering och-avslutning processer skulle fortfarande vara i jämvikt). Översättningen Reaktionen kan också stoppas genom tillsats av antibiotika som gripande translationell förlängning (t.ex. cykloheximid). Det är uppenbart att detta experimentella system skulle möjliggöra upplösning och analys av de viktigaste paus platser längs mRNA och lösa kapacitet gelen som skall användas skulle ha en stor inverkan på kvaliteten på resultaten. Tricin-natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektro-fores tillåter separation av proteiner i området från 1 till 100 kDa rekommenderas för användning i dessa typer av experiment 12. Det bör noteras att denna strategikan också anpassas till analysen av var paus ställen under proteinuttryck in vivo (i celler). I det senare fallet bör den totala Polysomalt fraktion från metaboliskt märkta celler isoleras först. Polysomer översätta specifikt mRNA intresse bör isoleras därefter genom immunoutfällning med anti-(protein av intresse) specifika antikroppar och analys av de märkta begynnande kedjorna bör göras enligt beskrivningen. Det är föredraget att använda antikroppar riktade mot N-terminala regionen av proteinet av intresse. Om nödvändigt kan proteinet av intresse kan märkas med t.ex. FLAG-peptiden för att säkerställa effektiv dra ner. Ett alternativt protokoll baserat på selektiv isolering av översätta ribosomer bundna till en biotin-märkt mRNA har också nyligen beskrivna provtagningen 13. Det bör noteras att mer exakt bestämning av platserna översättning paus, särskilt för stora proteiner man kan använda mikrokocknukleas skydd analys 5. En modifiering av than senare analys, som bygger på den djupa sekvensering av ribosomen skyddade mRNA fragment och möjliggör undersökning av protein translationella dynamik på genomet-nivå, har också beskrivit 14.
Den enkla och mycket anpassningsbar teknik som beskrivs i detta dokument kan användas för att följa flödet av ribosomer längs mRNA, hjälpa till att identifiera områden översättning pausa och även faktorer testa och förhållanden som kan förändra ribosomen rörelse under translationell förlängning. Den kan potentiellt användas för optimering av sam-translationell proteinveckning i heterologa System (s) genom att justera rätt placeringen av viktiga platser översättning paus genom att använda synonyma kodonsubstitutioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Human Frontier Science Program bidrag RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
