Summary
We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische (
Abstract
Uitgebreid onderzoek heeft voldoende bewijzen waaruit blijkt dat het vouwen van eiwitten in de cel is een co-translationeel proces 1-5. Echter, de exacte pad dat polypeptideketen volgt tijdens de co-translationele vouwen om de functionele vorm te komen is nog steeds een raadsel. Om dit te begrijpen en de exacte conformatie van het co-translationele vouwen tussenproducten bepalen, is het noodzakelijk dat technieken dat de isolatie van RNC die beginnende ketens van voorafbepaalde afmetingen hun verdere structurele analyse mogelijk maken.
SecM (secretie monitor) is een 170 aminozuur E. coli-eiwit dat de expressie van de downstream SecA (secretie rijden) ATPase in de secM-seca operon 6 regelt. Nakatogawa Ito oorspronkelijk gevonden dat de 17 aminozuur lange sequentie (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) in de C-terminale gebied van het eiwit SecM nodig en voldoende omleiden tot blokkering van SecM rek bij Gly165, waardoor de productie van peptidyl-glycyl-tRNA stabiel gebonden aan de ribosomale P-site 7-9. Nog belangrijker is vastgesteld dat deze 17 aminozuur lange sequentie kan worden gefuseerd met de C-terminus van vrijwel volledige lengte en / of afgeknotte proteïne waardoor de produktie van RNC die beginnende ketens voorafbepaalde afmetingen 7. Dus, wanneer samengesmolten of ingevoegd in het doeleiwit, SecM blokkering sequentie produceert arrestatie van de polypeptideketen rek stabiel genereerd RNC zowel in vivo in E. coli-cellen en in vitro in een celvrij systeem. Sucrose gradiëntcentrifugering verder benut RNC isoleren.
De geïsoleerde RNC's kan worden gebruikt om structurele en functionele eigenschappen van de co-translationele vouwen tussenproducten te analyseren. Recent is deze techniek met succes gebruikt om inzicht te krijgen in de structuur van de verschillende ribosoom gebonden ontluikende kettingen 10,11. Hier beschrijven we de isolatie van runderen Gamma-B-crystalline RNC gefuseerd met SecM en genereerde in een in vitro translatie-systeem.
Protocol
1. DNA Template Voorbereiding en in vitro transcriptie
- Het gen van belang wordt gekloneerd in een T7 en / of bijvoorbeeld SP6 promotor gebaseerd plasmide. Om RNC van belang te verkrijgen, wordt de C-terminus van het doel polypeptide uitgebreid met arrestatie induceren reeks SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Om de polypeptide fragment van belang zal extruderen van de ribosomale tunnel, de C-terminale deel van het doelwit eiwit te verlengen ten minste 30 aminozuren 12-14. Een flexibele Glycine-serine-rijke linker worden geïntroduceerd tussen het eiwit en de SecM arrestatie sequentie eventuele conformationele beperkingen voorkomen.
- Voor in vitro transcriptie moet template DNA worden gelineariseerd met restrictie-enzym snijden achter het ORF. Men moet volledig linearisatie van het plasmide DNA te controleren door uitvoering van de restrictiedigestie product agarosegelelektroforese.
- Het gelineariseerde plasmaid wordt verder gebruikt voor in vitro transcriptie reactie. Verschillende concentraties van template DNA kan worden getest om optimale DNA vereiste concentratie in vitro transcriptie identificeren. Over het algemeen met MEGAscript High yield Ambion's Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 pg gelineariseerd DNA levert 40-60 microgram mRNA. In vitro transcriptie is gedaan volgens instructies van de fabrikant (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- Naar aanleiding van in vitro transcriptie, wordt mRNA gezuiverd door middel van lithium chloride neerslag volgens de fabrikant instructie (MEGAscript High Ambion het rendement transcriptiekit, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- mRNA integriteit verder geverifieerd door elektroforese met acrylamide of agarose gels.
2. In vitro translatie
Voor de in vitro translatie met behulp van de RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) Volg de onderstaande stappen:
- Bereid 100 pi van het onderwijs in vitro translatie reactie na de fabrikant. Kortom, toe te voegen in nuclease gratis water 24 ul aminozuurmengsel min methionine (1 mm), 10 eenheden van ribonucleaseremmer (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 pCi van radioactieve [35 S]-methionine (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 ul Reactie mix, 24 ul Reconstitutie buffer en 24 pi E. coli lysaat.
- Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 5 min warm de vertaling reactie vooraf. Voeg 1-2 pg van mRNA de vertaling reactie en incuberen bij 30 ° C gedurende 10-15 minuten.
- Stop de reactie door plaatsen van de vertaling reactie op ijs.
3. Isolatie van Nascent polypeptide van in vitro translatie Reaction
- Om RNC isoleren wordt de vertaling reactie lagen op 4,5 ml van 5-30% sucrose gradiënt in 20 mM HEPES pH 7 KOH0.5, 15 mM MgCl2, 100 mM kalium-acetaat, 1 mM DTT en gecentrifugeerd met Beckman SW55 Ti-rotor bij 41.000 rpm, 4 ° C gedurende 2 uur.
- Na centrifugeren, sucrose gradiënt gefractioneerd verschillende ribosomale populaties en bijbehorende opkomende ketens isoleren. Scheiding wordt gecontroleerd met behulp van de ISCO Programmable dichtheidsgradiënt systeem met continu-opname op 254 nm met behulp van een ISCO UA-6 absorptie detector.
- De fractie (s) met 70S ribosomen worden verzameld en geanalyseerd verder afhankelijk van het doel van het experiment.
4. Observatie van eiwit gebonden aan ribosoom met Tris-tricine SDS-PAGE
Om te controleren of de SecM verlengde eiwit blijft aan de 70S ribosoom werden gradiënt fracties verzameld en als volgt behandeld:
- Eiwit in elke fractie werd geprecipiteerd door toevoeging trichloorazijnzuur (TCA) tot een eindconcentratie van 10% en geïncubeerd bij 4 ° C overnight.
- Na overnacht incubatie werden de monsters gecentrifugeerd bij 14.000 x g gedurende 15 minuten tot pellet het eiwit. Na centrifugeren supernatant werd verwijderd en de pellet werd tweemaal gewassen met een oplossing bevattende aceton: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet is verder lucht gedroogd en opgelost in SDS-PAGE loading buffer.
- De behandelde monster werd opgelost en geanalyseerd door Tris-tricine SDS-PAGE.
- Na elektroforese gels werden vastgesteld, gedroogd onder vacuüm gel verver en aan autoradiografie. De verdeling van de ontluikende polypeptiden werden waargenomen met behulp van phosphoimaging.
5. Representatieve resultaten
Hier geven een experiment waarin de isolatie van de volledige lengte bovine Gamma-B crystalline stabiel gebonden aan het 70S ribosoom. Figuur 1 toont stappen bij de isolatie van runderen Gamma-B crystalline RNC. De C-terminus van het gamma-B crystalline werd totale verlengd 32 aminozuren to dat volle-lengte proteïne extrudeert van de ribosomale tunnel, dit ook het SecM blokkering sequentie geplaatst het C-terminus van het fusie-polypeptide. Na in vitro translatie werden de 70S ribosomen geïsoleerd door sucrose gradiënt centrifugatie (figuur 2.1). Om de eiwitten blijft stabiel gebonden aan de ribosoom de 70S fracties werden samengebracht, ontzoute, buffer uitgewisseld en onderworpen aan een extra lang sucrose gradiënt centrifugatie (figuur 2.2). Het resultaat weergegeven in figuur 2 blijkt duidelijk dat SecM efficiënt kan veroorzaken translationele arrestatie van de Gamma-B crystalline RNC.
Figuur 1. Schematische uitleg van de stappen die betrokken zijn bij de isolatie van RNC's. C-uiteinde van runderen Gamma-B crystalline werd uitgebreid met 32 aminozuursequentie. Deze uitgebreideC-terminale gebieden ook SecM arrestatie sequentie. Gamma-B crystalline met SecM sequentie werd gekloond in PIVEX 2.3 (T7 based) plasmide. Voor in vitro transcriptie de template DNA werd gelineariseerd met Xbal. Lineair template werd verder gebruikt in vitro transcriptie. De T7 in de DNA-template herkend door T7-RNA-polymerase dat Gamma-B crystalline gen zich stroomafwaarts van de T7 promoter overschrijft. mRNA werd gezuiverd met lithiumchloride precipitatie. Het gezuiverde mRNA werd vervolgens gebruikt voor in vitro translatie. Na incubatie werd het reactiemengsel vertaling lagen op 5-30% sucrose gradiënt en gecentrifugeerd Beckman SW55 Ti-rotor bij 41.000 rpm, 4 ° C gedurende 2 uur.
Figuur 2. Isolatie van runderen Gamma-B-crystalline RNC stabiel gebonden aan de 70S ribosoom. 1 ug mRNA werd gemengd in 100 ul reactie E. coli S30 Extract systeem zoals vermeld in het protocol gedeelte met 20 pCi [35S]-methionine en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 15 minuten. Na incubatie werd het reactiemengsel vertaling lagen op 5-30% sucrose gradiënt in 20 mM HEPES pH 7,5 KOH, 15 mM MgCl2, 100 mM kalium-acetaat, 1 mM DTT en gecentrifugeerd Beckman SW55 Ti-rotor bij 41.000 rpm, 4 ° C gedurende 2 uur. Na snelheid sedimentatie, werd de gradiënt gelost en het ribosoom pro le verkregen. De gegevens werden geregistreerd door het PeakTrak programma (ISCO gradiënt dichtheidsgradiënt fractionering systeem). Fracties werden verzameld, het eiwit TCA neergeslagen en opgelost in 16,5% T, 6% C Tris-Tricinus PAGE gel 15. De gel werd gedroogd en blootgesteld autoradiografie. Na blootstelling aan de gel werd gescand met behulp van Typhoon 9410 imaging scanner. Figuur 2.1 laat zien dat volledige lengte Gamma-B crystalline aanwezig is in 70S ribosoom fracties. Zo SecM afslaan functie kan de isolatie van de stabiele runderen Gamma-B crystalline RNC. Gegevens in figuur 2.2 duidelijk dat de geïsoleerde RNC inderdaad stabiel. In de huidige experiment 70S fracties na de eerste ronde van sucrose gradiënt centrifugatie werden samengevoegd en saccharose werd verwijderd met Amicon ultra-4 centrifugale filtereenheid (Millipore), gevolgd door buffer uitwisseling oplossing bevattende 20 mM HEPES pH 7,5 KOH, 15 mM MgCl2, 100 mM kalium-acetaat, 1 mM DTT. Dit monster werd verder onderworpen aan een extra lang centrifugatie door 5-30% sucrose gradiënt en gefractioneerd. Elke fractie werd behandeld en geanalyseerd als in figuur 2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor reproduceerbare resultaten kwaliteit en de concentratie van de componenten die in vitro transcriptie en translatie cruciale zijn. Wij hebben in de handel verkrijgbaar in vitro transcriptie en translatie extracten en geven efficiënte en reproduceerbare resultaten indien zorgvuldig behandeld. Kwaliteit van mRNA kan invloed hebben op de vertaling, dus het is van het grootste belang om de integriteit van mRNA te testen alvorens het te gebruiken voor in vitro vertaling. Incubatietijd in vitro translatie varieert met de lengte van het eiwit. Ook kan de tijd / snelheid van centrifugeren dienovereenkomstig worden aangepast, in het geval, de 70S ribosomale fractie is niet goed opgelost en gescheiden van de 50S. Verder moet ribosoom gebonden eiwit complexen zorgvuldig worden behandeld om RNase besmetting te voorkomen. Bovendien moet buffer omstandigheden zorgvuldig gecontroleerd en cheleringsmiddelen mogelijk chelaat Mg2 + moeten worden vermeden.
SecM arrestatievolgorde op de vertaling samenwerkt met de ribosomale eiwitten L4 en L22 en 23S rRNA in de ribosomale tunnel 7,8. Een aantal kritische residuen, die de SecM arrestatie motief, F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 (vetgedrukt) zijn van groot belang, zodat de efficiëntie van de translationele arrestatie. Mutaties of verwijderingen van deze kritische residuen kan leiden tot grote opluchting van de vertaling rek arrestatie 7,8. Zo behoud van de volgorde van de SecM arrestatie motief F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 intact absoluut noodzakelijk zijn dat het eiwit onder studie blijft stabiel gebonden aan de ribosoom.
Deze techniek kan worden gebruikt voor analyse van de structuur van co-translationele tussenproducten en co-translationele vouwen van de verschillende eiwitten. Het is onlangs succes gebruikt om de exacte structuur o bepalenf enkele ribosoom gebonden ontluikende kettingen met behulp van NMR 10-11. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om peptiden beginnende vooraf bepaalde afmetingen voor de analyse van de tertiaire interacties met additionele eiwitten, cofactoren of liganden genereren.
Een alternatieve benadering RNC complexen moeten komen, gekenmerkt door het gebruik van partiële mRNA ontbreekt stopcodon. Deze aanpak is op grote schaal gebruikt door veel onderzoekers om de studie van de co-translationele het vouwen van eiwitten zie bijvoorbeeld 12,16. Het heeft echter een aantal nadelen. Deze benadering kan worden gebruikt in vivo en problematisch voor gebruik in vitro met E. coli extract door de aanwezigheid in E. coli SsrA systeem dat de toevoeging van het C-terminale peptide tag (AANDENYALAA) voor eiwitten vertaling van mRNA zonder in-frame stopcodons, waardoor de afbraak 17. Derhalve in het laatste geval gebruikt men een volledig gereconstitueerdtuted en / of een systeem, ontbreekt / onderdrukken SsrA-tagging machines. SecM gerichte stalling is efficiënt en uniek, omdat het is bewezen dat vastgelopen ribosoom complexen in vivo en in vitro te produceren met bijna dezelfde efficiëntie 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
