Summary
המתואר כאן טכניקה כיום בשימוש שגרתי לבודד קשורות ביציבות הריבוזום מתחמי הרשת המתהווה (RNCs). שיטה זו מנצלת את הגילוי כי 17 חומצות אמינו ארוכה SecM "מעצר רצף" יכול לעצור את התארכות תרגום פרוקריוטים (
Abstract
מחקר מקיף סיפקה ראיות בשפע טוען כי קיפול חלבונים בתא הוא תהליך שיתוף translational 1-5. עם זאת, המסלול המדויק שרשרת פוליפפטיד כדלקמן במהלך קיפול שיתוף translational להשיג טופס הפונקציונלי הוא עדיין חידה. על מנת להבין את התהליך הזה כדי לקבוע את הקונפורמציה המדויק של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים, חשוב לפתח שיטות המאפשרות בידוד של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש על מנת לאפשר ניתוח מבנית נוספת שלהם.
SecM (צג הפרשת) הוא 170 חומצות אמינו א ' coli חלבון המווסת את ביטוי של ATPase במורד הזרם (נהיגה הפרשת) SecA ב operon secM-secA 6. Nakatogawa ו איטו במקור נמצא כי רצף 17 חומצות אמינו ארוכה (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) באזור C-terminal של החלבון SecM מספיק וצריךכי השתהות של התארכות SecM ב Gly165, ובכך לייצר peptidyl-glycyl-tRNA קשורה ביציבות אל ריבוזומלי P-האתר 7-9. יתרה מכך, נמצא כי 17 זה רצף חומצות האמינו זמן רב ניתן קיבע את הסופית-C של חלבון כמעט בכל באורך מלא ו / או מקוצר ובכך מאפשר ייצור של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש 7. לכן, כאשר התמזגו או מוכנס לתוך היעד החלבון, רצף SecM מייצר השתהות מעצרו של התארכות שרשרת פוליפפטיד ומייצר RNCs יציבים הן in vivo של א ' קולי תאים במבחנה במערכת התא ללא. שיפוע צנטריפוגה סוכרוז הוא מנוצל יותר לבודד RNCs.
RNCs את בודדים ניתן לנתח מאפיינים מבניים ותפקודיים של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים. לאחרונה, טכניקה זו שימשה בהצלחה להבנה טובה של המבנה של הריבוזום שרשראות כמה המתהווה קשורות 10,11. כאן אנו מתארים את הבידוד של Crystallin שור Gamma-B RNCs התמזגו כדי SecM ו שנוצר במערכת בתרגום חוץ גופית.
Protocol
1. תבנית ה-DNA הכנה בתעתיק חוץ גופית
- הגן של הריבית לשכפל בכל T7 ו / או למשל SP6 האמרגן מבוסס פלסמיד. כדי להשיג RNCs של עניין, C-הסופית של יעד פוליפפטיד הוארך על ידי הוספת התרמה מעצר רצף של SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. על מנת להבטיח כי שבר פוליפפטיד מעניין יהיה extrude מתוך המנהרה ריבוזומלי, החלק C-טרמינל של חלבון המטרה צריכה להיות מורחבת על ידי לפחות 30 חומצות אמינו 12-14. מקשר גליצין, סרין גמישה עשיר יכול להיות מוצג בין חלבון לבין רצף מעצר SecM כדי למנוע אילוצים קונפורמציה אפשריים.
- עבור בתעתיק חוץ גופית, תבנית ה-DNA יש לינארית עם אנזים הגבלה חותך במורד הזרם של ORF. יש צורך לאמת את לינאריזציה מלאה של DNA פלסמיד על ידי הפעלת המוצר העיכול מגבלה על ג'ל אלקטרופורזה agarose.
- בפלסמה לינאריתid משמש נוספת בתגובה שעתוק במבחנה. ריכוז שונה של DNA התבנית ניתן לבדוק לזהות ריכוז ה-DNA האופטימלי הנדרש ב שעתוק במבחנה. בדרך כלל עם ערכת MEGAscript של Ambion תמלול, תפוקה גבוהה (Ambion / Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק), ה-DNA 1 מיקרוגרם לינארית מניבה mRNA 40-60 מיקרוגרם. בתעתיק חוץ גופית נעשית בעקבות הוראה של היצרן (Ambion / Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק) .
- בעקבות בתעתיק חוץ גופית, mRNA מטוהרים על ידי משקעים ליתיום כלוריד על פי הוראה של היצרן (MEGAscript תמלול העליון Ambion ערכת התשואה Ambion / Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק).
- שלמות mRNA מאומת עוד יותר על ידי אלקטרופורזה באמצעות acrylamide או ג'ל agarose.
2. במבחנה תרגום
עבור בתרגום חוץ גופית באמצעות 100 RTS א coli ח.י. Kit (5 הממשלה, גאיתרsburg, MD) בצע את הפעולות הבאות:
- הכן 100 μl ההוראה בתגובה במבחנה תרגום יצרן הבאה. בקצרה, במים nuclease חינם להוסיף 24 חומצות אמינו μl תערובת מינוס מתיונין (1 מ"מ), 10 יחידות של מעכבי Ribonuclease (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), 20 μCi של רדיואקטיבי-מתיונין (S [35] Biomedicals מגה פיקסל, סולון, OH), 20 תערובת התגובה μl, 24 חיץ הכינון מחדש μl ו 24 μl של א ' lysate coli.
- דגירה התגובה על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מראש תגובה חמה תרגום. להוסיף 1-2 מיקרוגרם של ה-mRNA לתגובה תרגום דגירה על 30 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות.
- לעצור את התגובה על ידי הנחת התגובה התרגום על הקרח.
3. הבידוד של פוליפפטיד ינוקא מ בתגובה תרגום חוץ גופית
- לבודד RNCs, התגובה התרגום שכבות על גבי שיפוע של 4.5 מ"ל 5-30% סוכרוז ב-pH 20 מ"מ HEPES-KOH 70.5, 15 מ"מ MgCl 2, 100 אצטט mM אשלגן, 1 mM DTT וכן באמצעות centrifuged Beckman Coulter SW55-Ti הרוטור ב 41000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- לאחר צנטריפוגה, שיפוע סוכרוז הוא מופרדים לבודד אוכלוסיות ריבוזומלי שונים ורשתות המתהווה הכרוכים בכך. ההפרדה מנוטר באמצעות צבע לתכנות ISCO מערכת צפיפות עם הקלטה רציפה ב 254 ננומטר באמצעות גלאי ISCO UA-6 ספיגת.
- חלק קטן (S) המכילה ריבוזומים ה -70 הם לאסוף ולנתח נוספת בהתאם המטרה של הניסוי.
4. תצפית של חלבון כך נגזר, ריבוזום עם טריס-tricine SDS PAGE
כדי לבדוק זאת, אם חלבון ממושכת SecM נשארת מחוברת ה -70 הריבוזום, שברים הדרגתיים נאספו וטופלו באופן הבא:
- חלבון בשבריר כל אחד זירז ידי הוספת חומצה Trichloroacetic (TCA) לריכוז סופי של 10% ו מודגרות ב 4 ° C overnight.
- לאחר הדגירה לילה, דגימות היו centrifuged על 14,000 X גרם במשך 15 דקות כדי גלולה חלבון. Supernatant צנטריפוגה הבאה הוסר גלולה נשטף פעמיים עם אצטון תמיסה המכילה: 1 mM Tris-HCl pH 7.6 (04:01). גלולה היה באוויר עוד יותר יבשים מומסים חיץ SDS-PAGE הטעינה.
- המדגם התייחס נפתרה ונותחו על ידי טריס-tricine SDS-PAGE.
- לאחר אלקטרופורזה, ג'לים תוקנו, מיובשים באמצעות ואקום ג'ל דייר ו נתון autoradiography. הפצה של פוליפפטידים המתהווה נצפו באמצעות phosphoimaging.
5. נציג תוצאות
כאן אנו מציגים ניסוי המתאר את בידודו של באורך מלא שור Gamma-B Crystallin קשור ביציבות אל שנות ה -70 הריבוזום. איור 1 מתאר את השלבים הכרוכים בבידוד של RNCs שור Gamma-B Crystallin. C-הסופית של Crystallin Gamma-B הוארך הכוללת של חומצות אמינו לא 32הו להבטיח באורך מלא מוציא חלבון מתוך המנהרה ריבוזומלי, זה כולל גם את רצף SecM השתהות שהוצב מאוד C-הסופית של היתוך פוליפפטיד. בעקבות בתרגום חוץ גופית, ריבוזומים ה -70 בודדו על ידי צנטריפוגה סוכרוז שיפוע (איור 2.1). על מנת להבטיח כי החלבון נשאר חייב ביציבות אל הריבוזום, בשנות ה -70 המכילים שברים היו נקווה, מאגר desalted, החליפו וכפופים לסיבוב נוסף של צנטריפוגה גרדיאנט סוכרוז (איור 2.2). התוצאה מוצגת באיור 2 עולה בבירור כי SecM ביעילות לגרום למעצר translational של RNCs את Gamma-B Crystallin.
באיור 1. הסבר סכמטי של המעורבים בידוד RNCs. C-הסופית של Crystallin שור Gamma-B הוארך רצף 32 חומצות אמינו. זה המורחבתבטרמינל C-אזורים כולל גם רצף מעצר SecM. Gamma-B Crystallin עם רצף SecM שוכפלה ב pIVEX 2.3 (מבוסס T7) הפלסמיד. שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית על ידי XbaI. תבנית לינארית שימש נוספת של שעתוק במבחנה. T7 בתבנית ה-DNA הוא מוכר על ידי RNA פולימראז T7 כי מעתיק את Gamma-B Crystallin גנים הממוקמים במורד של האמרגן T7. mRNA היה מטוהרים באמצעות ליתיום כלוריד שיטת משקעים. MRNA מטוהרים היה אז בשימוש עבור בתרגום חוץ גופית. הדגירה הבאה, התגובה התרגום שכבות על גבי שיפוע 5-30% סוכרוז centrifuged ב Beckman Coulter SW55-Ti הרוטור ב 41000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
איור 2. הבידוד של Crystallin שור Gamma-B RNCs קשור ביציבות אל הריבוזום ה -70. 1 mRNA מיקרוגרם היה מעורב ב 100 התגובה ה μl coli מערכת S30 תמצית כאמור בסעיף 20 לפרוטוקול עם μCi [35 S]-מתיונין מודגרות על 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הדגירה הבאה, התגובה התרגום שכבות על גבי שיפוע 5-30% סוכרוז ב 20 HEPES-KOH mM pH 7.5, 15 מ"מ MgCl 2, אצטט אשלגן 100 מ"מ, 1 mM DTT ו centrifuged ב Beckman Coulter SW55-Ti הרוטור ב 41000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לאחר שקיעה מהירות, שיפוע נפרק את הריבוזום Pro Le הושג. הנתונים נרשמו על ידי תוכנית PeakTrak (צפיפות ISCO שיפוע שיפוע מערכת חלוקה). נאספו שברים, החלבון היה TCA זירז והחליט על T 16.5%, 6% C טריס-Tricine PAGE ג'ל 15. ג'ל היה יבש וחשוף עבור autoradiography. החשיפה הבאה ג'ל נסרק באמצעות טייפון 9410 סורק הדמיה. איור 2.1 מראה באורך מלא, Gamma-B Crystallin קיים בשנות ה -70 שברים הריבוזום. לפיכך, רצף SecM השתהות מאפשר בידוד של האורווה Gamma-B RNCs שור Crystallin. הנתונים איור 2.2 עולה בבירור כי את RNCs בודדים הם יציבים מאוד. בניסוי הנוכחי ה -70 שברים לאחר הסיבוב הראשון של צנטריפוגה גרדיאנט סוכרוז היו נקווה ואת סוכרוז הוסר באמצעות Amicon Ultra-4 יחידת מסנן צנטריפוגלי (Millipore), ואחריו מאגר החליפין תמיסה המכילה 20 מ"מ HEPES KOH-pH 7.5, 15 מ"מ MgCl 2, אשלגן 100 mM אצטט, DTT 1 מ"מ. מדגם זה היה נתון עוד יותר לסיבוב נוסף של צנטריפוגה דרך שיפוע 5-30% סוכרוז ו מופרדים. חלק זה טופל וניתח כמו באיור 2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה התרגום הן קריטיות. השתמשנו זמינים מסחרית שעתוק במבחנה תמציות תרגום והם נותנים תוצאות יעיל לשחזור, אם מטופל בזהירות. האיכות של ה-mRNA יכול להשפיע על התרגום, ולכן הוא בעל חשיבות עליונה לבחון את שלמות ה-mRNA לפני השימוש בו בתרגום חוץ גופית. זמן הדגירה של בתרגום חוץ גופית משתנה עם אורך של החלבון. כמו כן, זמן / מהירות צנטריפוגה יכול להיות בהתאם, במקרה, חלק ה -70 ריבוזומלי לא נפתרה היטב להפריד שנות ה -50. יתר על כן, הריבוזום מערכות חלבון הנכנס יש לטפל בזהירות, כדי למנוע זיהום RNase. יתר על כן, תנאי חיץ יש לעקוב בקפידה סוכני chelating שעשוי Chelate Mg 2 + יש להימנע.
SecM מעצררצף, על התרגום שלה בשיתוף פעולה מלא עם חלבונים ריבוזומלי L4 ו L22 וגם rRNA 23S במנהרה ריבוזומלי 7,8. מספר שאריות קריטיים, המהווים מוטיב מעצר SecM, WI F XXXX XXXX GIRAGP 7 (באותיות מודגשות) הם בעלי חשיבות עצומה, על מנת להבטיח את יעילות המעצר translational. מוטציות, או מחיקות של שאריות אלה קריטיים עלולה להוביל להקלה על מעצרו תרגום התארכות 7,8. לכן, שמירה על רצף של מוטיב מעצר SecM F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 ללא פגע הוא קריטי כדי להבטיח את החלבון על פי המחקר יישאר קשור ביציבות אל הריבוזום.
טכניקה זו יכולה לשמש עבור ניתוח של מבנה משותף של תרגום ביניים ושיתוף translational קיפול של חלבונים שונים. זה כבר מזמן השתמשו בהצלחה כדי לקבוע את המבנה המדויק OF כמה רשתות הריבוזום המתהווה הנכנס בעזרת NMR 10-11. בנוסף, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לייצר פפטידים המתהווה בגדלים קבועים מראש לניתוח אינטראקציות שלישוני שלהם עם חלבונים או אביזר, cofactors ligands.
גישה חלופית לייצר מתחמי RNCs היה להתבצע תוך שימוש mRNAs חתוכים חסרי קודון עצירה. גישה זו נמצאת בשימוש נרחב על ידי חוקרים רבים ללמוד מתקפל שיתוף translational חלבון לראות למשל 12,16. עם זאת, יש מספר חסרונות. גישה זו לא יכול להיות מועסק in vivo ובעייתי גם לשימוש במבחנה עם א ' coli לחלץ בשל נוכחותם של א ' coli של מערכת SsrA כי מתווך תוספת של C-peptide מסוף תג (AANDENYALAA) לחלבונים המתורגמים מ mRNAs ללא ב-מסגרת קודונים הפסקה, מה שהוביל השפלה שלהם 17. לכן, במקרה אחר, צריך להשתמש reconsti לחלוטיןמערכת tuted ו / או המערכת, חסר / דיכוי SsrA תיוג מכונות. SecM מכוונת השתהות יעילה וייחודית כפי שהוכח לייצר מתחמי הריבוזום התקועות in vivo ו במבחנה ביעילות דומה כמעט 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
